第八章 發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取.pptx

1、第八章 發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取,第一節(jié) 發(fā)酵產(chǎn)物分離的特點與過程設(shè)計,一、發(fā)酵液的一般特性 （1）發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，屬于稀水溶液系統(tǒng)。 （2）成分復(fù)雜，含有目的產(chǎn)物、微生物細胞碎片、其他代謝副產(chǎn)物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等。 （3）含有色素、熱源物質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)。 （4）發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性低，對熱、酸、堿、有機溶劑、酶、機械力等敏感，不適宜條件下易失活或分解。,提取和精制 提取和精制是為了從發(fā)酵液中獲得高純度的、符合質(zhì)量標(biāo)淮要求的發(fā)酵成品。 發(fā)酵產(chǎn)物存在形式不同，用途各異，產(chǎn)品質(zhì)量要求不同，分離純化步驟有所不同。 但大多數(shù)包括以下四個步驟：發(fā)酵液預(yù)處理和菌體分離、提取、精制、成品加工。,二、常用的

2、分離技術(shù)及機制,p267,發(fā)酵產(chǎn)品后處理過程流程圖,三、發(fā)酵產(chǎn)物分離的過程選擇,細胞破碎機理圖,第二節(jié) 細胞破碎,細胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機械的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。,細胞破碎的阻力,細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大； 酵母細胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度； 霉菌細胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)； 成熟的植物細胞壁分為初生壁和次生壁。,圖8.2 細胞破碎方法分類,細胞的破影響因素,物理破碎時影響因素： 細胞的大小 形狀 細胞壁的厚度 聚合物的交聯(lián)程度 酶法和化學(xué)

3、法溶解細胞影響因素： 組成 結(jié)構(gòu),高壓勻漿法(High-pressure homogenization) 大規(guī)模細胞破碎的常用方法,原理：細胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。,高壓勻漿器,均質(zhì)頭的結(jié)構(gòu),均質(zhì)頭的結(jié)構(gòu),大多數(shù)均質(zhì)機上配備雙級均質(zhì)閥，在第一級中，料液壓力為19.6-25.4MPa, 主要使脂肪球破碎，第二級料液壓力減為3.43MPa, 主要使脂肪球均勻分散。閥和閥座采用耐磨合金鋼制造。三柱塞泵的特點是

4、排液量比較均勻。,傳動采用二級變速，利用曲臂鑲?cè)胍粚θ俗铸X輪，實施對稱傳動，具有結(jié)構(gòu)緊湊，彎矩小，受力均勻，平穩(wěn)、低噪聲等。,三柱塞泵,往復(fù)泵,壓力 (工業(yè)生產(chǎn)中常用5570MPa的壓力) 循環(huán)操作次數(shù)(多次循環(huán)的操作方法) 溫度,高壓勻漿法中影響細胞破碎的因素:,不宜采用高壓勻漿法的微生物：,易造成堵塞的團狀或絲狀真菌， 較小的革蘭氏陽性菌， 含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）,適用于：微生物細胞和植物細胞的大規(guī)模破碎。,進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋

5、放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。,珠磨法（Bead mill）,工作原理：,原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微球和細胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產(chǎn)熱由夾套帶走。,球磨機,影響細胞破碎的因素,b.珠體的裝量,a.珠體的大小,c.攪拌速度,d.操作溫度,e.被處理細胞的特性,實驗室規(guī)模，珠徑0.2mm，工業(yè)規(guī)模珠徑大于0.4mm,8090,適當(dāng),540,珠磨法的破碎率一般控制在80以下,其原理可能與空穴現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。,超聲破碎

6、法（Ultra-sonication）,超生波破碎細胞時的頻率一般為1520 kHz，功率為100250W，可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)式兩種型式。,影響超生波破碎的因素,聲強、 頻率、 破碎時間、 介質(zhì)的離子強度、 pH 菌體的濃度和種類。,一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時細胞濃度一般在20左右。,此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔擠出，由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而破碎。該法主要用于實驗室，具有使用范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點。不適用于

7、對冷凍敏感的物質(zhì)。,X-press法,滲透壓沖擊法（Osmotic pressure） 反復(fù)凍融法 干燥法,酶溶法,化學(xué)試劑破碎法,外加酶法 自溶法,表面活性物質(zhì) EDTA螯合劑 有機溶劑 變性劑,2.化學(xué)破碎（Chemical permeation）,（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）,外加酶法,常用的溶酶,G+ 溶菌酶、適量抑制劑 G- 溶菌酶、EDTA 放線菌 溶菌酶 酵母菌 -葡聚糖酶 霉菌 幾丁質(zhì)酶、 植物 纖維素酶、半纖維素酶,細胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物,選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。,溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物

8、抑制的存在。 在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,酶溶法的優(yōu)點：,酶溶法的缺點：,某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。,（2）化學(xué)試劑破碎法（Chemical permeation）,該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。,用堿處理細胞，可以溶解除去細胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸。,如Triton X-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。

9、其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫等也可使細胞破碎。,表面活性劑,可促使細胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細胞的破碎。,處理G-細菌，對細胞外層膜有破壞作用。G-細菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。,EDTA螯合劑,能溶解細胞壁中的磷脂層，使細胞破壞。,有機溶劑,變性劑,鹽酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。,常用的有機溶劑：丁酯、丁醇、甲苯、二

10、甲苯、氯仿及高級醇等。,變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。,通用性差； 時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50% 有些化學(xué)試劑有毒 。,化學(xué)法的優(yōu)點：,缺點：,對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)； 細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。,細胞破碎效果的檢查,破碎率定義:被破碎的細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，即,其中N0：原細胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細胞。N0和N的可通過直接測定法、目的產(chǎn)物測定法和測定導(dǎo)電率得到。,第三節(jié) 沉淀與離心,一、沉

11、淀 氨基酸提?。?等電點法； 鹽酸鹽法； 金屬鹽法； 溶劑抽提法等。 蛋白質(zhì)提?。?二、離心,（一）離心沉降原理 （二）離心沉降設(shè)備 1、管式離心機,2. 碟片式離心機,碟式離心機分離原理,3. 沉降式螺旋卸料離心機,主要部件,1、轉(zhuǎn)鼓：圓筒部分為沉降區(qū)，用于固液分離；圓錐部分為干燥區(qū)，固相進一步脫水 轉(zhuǎn)鼓形狀：圓筒形：有利于液相澄清 圓錐形：有利于固相脫水 圓筒+圓錐形：有兩者的優(yōu)點，應(yīng)用最廣 2、螺旋 螺旋推進器與轉(zhuǎn)鼓的轉(zhuǎn)差率：1：100 轉(zhuǎn)差率越小，物料在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)停留的時間越長，排渣慢，濾渣較干 轉(zhuǎn)差率越大，物料在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)停留的時間越短，排渣塊，濾渣較濕 轉(zhuǎn)差率為零，不排料 3、差速器,In

12、troduction to GEA Westfalia Separator,（三）離心過濾,三足離心機,刮刀卸料離心機,（四）離心機的選擇與使用,一、過濾 （一）過濾原理 （二）過濾介質(zhì) 織物介質(zhì)： 粒狀介質(zhì)： 多孔介質(zhì)等,第四節(jié) 過濾與膜分離,硅藻土,硅藻土是一種硅質(zhì)巖石，是一種生物成因的硅質(zhì)沉積巖，它主要由古代硅藻的遺骸所組成。其化學(xué)成分以SiO2為主，可用SiO2nH2O表示。 化學(xué)性能穩(wěn)定； 形狀不規(guī)則，孔隙多； 無毒且不可壓縮 用法： 深層過濾介質(zhì)； 預(yù)涂層； 助濾劑,（三）過濾設(shè)備,常壓過濾機 加壓過濾機 板框過濾機 葉片式過濾機 真空過濾機,真空過濾機,轉(zhuǎn)筒真空過濾機,真空過濾機

13、,分配頭,轉(zhuǎn)動盤與固定盤緊密配合，構(gòu)成一個特殊的旋轉(zhuǎn)閥，稱為分配頭，如下圖所示。 固定盤分成若干個弧形空隙，分別與減壓管、洗液貯槽及壓縮空氣管路相通。,（1）轉(zhuǎn)動盤 （2）固定盤,轉(zhuǎn)筒真空過濾機的分配頭,工作原理,當(dāng)轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)時，借分配頭的作用，扇形格內(nèi)分別獲得真空和加壓，如此便可控制過濾、洗滌等操作循序進行。 轉(zhuǎn)鼓表面分6個區(qū)，如右圖。,二、膜分離技術(shù),常見的膜分離過程有滲透、透析、電滲析、反滲透、微過濾、超濾、氣體透過等。,滲透,一、膜分離方法,按動力本質(zhì)分,以靜壓力差為推動力的過程 微濾（microfiltration, MF) 超濾（ultrafiltration, UF） 反滲透（re

14、verse osmosis, RO) 納濾（nanofiltration, NF) 以蒸汽分壓為推動力的過程 膜蒸餾（membrane distillation, MD) 滲透蒸發(fā)（pervaporation, PV） 以濃度差為推動力的過程 滲析（dialysis, D) 以電位差為推動力的過程 電滲析（electrodialysis, ED),膜分離技術(shù)的類型,膜分離法與物質(zhì)大小的關(guān)系。,膜的分類,工業(yè)應(yīng)用膜應(yīng)具有的條件： 1. 較大的透過性； 2. 較高的選擇性； 3. 機械強度好、耐熱、化學(xué)性能穩(wěn)定；4. 不被細菌污染,幾種常用膜的適用范圍,幾種常用膜,二、膜材料,膜材料的種類,無機材

15、料 種類：陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼和碳素等。目前實用化有孔徑0.1um微濾膜和截留10kD的超濾膜，其中以陶瓷材料的微濾膜最常用。多孔陶瓷膜主要利用氧化鋁、硅膠、氧化鋯和鈦等陶瓷微粒燒結(jié)而成，膜厚方向上不對稱 復(fù)合材料 種類：如將含水金屬氧化物（氧化鋯）等膠體微?；蚓郾┧岬瘸恋碓谔沾晒艿亩嗫战橘|(zhì)表面形成膜，其中沉淀層起篩分作用。,按膜的結(jié)構(gòu)可分為對稱和非對稱膜兩大類，其中非對稱膜還可細分為多孔膜、疊合膜以及復(fù)合膜等。,膜結(jié)構(gòu)特征,均質(zhì)膜,非對稱性膜,微孔對稱性膜,鋁膜,納米管膜,聚酰胺轉(zhuǎn)相膜,四、膜分離設(shè)備,（一）板式膜過濾器,適用范圍: A、UF、MF， B、適合于處理高黏度及懸浮液較高的料

16、液。,（二）管式膜過濾器,應(yīng)用：A、毛細管式：UF、MF、PV，B、中空纖維式(能耐高壓)：RO，DS(大規(guī)模透析，人工腎)，C、適合于處理低固體含量的料液。,（三） 中空纖維式膜分離器,（四）螺旋卷式膜分離器,膜組件件所用的膜為平面膜。兩層長方形的膜，中間夾一層支撐物，沿邊黏合成長袋，膜袋口與一根多孔中心集水管密封接合，在膜袋外部的原水側(cè)再墊一層網(wǎng)狀型間隔材料。一根多孔中心集水管外壁上可黏接多個膜袋。黏在中心管上的膜袋連同膜外的網(wǎng)狀間隔材料一起繞中心管卷繞膜卷。 將若干膜卷裝入圓筒形耐壓容器就成為如圖所示的螺旋卷式膜組件。,螺旋卷式膜組件,卷式膜組件的特點,優(yōu)點：單位體積膜面積大，結(jié)構(gòu)緊湊。

17、 缺點：膜面流速一般為0.1m/s左右，濃度差極化不易控制；由于流道狹，易堵塞，不易清洗。,各種膜裝置性能的比較,6 膜分離裝置,六 膜技術(shù)的應(yīng)用,1) 細胞培養(yǎng)基的除菌； 2) 發(fā)酵液或培養(yǎng)液中細胞的收集和除去； 3) 細胞破碎后碎片的除去； 4) 標(biāo)產(chǎn)物部分純化后的濃縮或濾除小分子溶質(zhì)； 5) 最終產(chǎn)品的濃縮和洗濾除鹽； 6) 蛋白質(zhì)的回收、濃縮和純化 7) 制備用于調(diào)制生物產(chǎn)品和清洗產(chǎn)品容器的無熱源水； 8) 膜生物反應(yīng)器。,膜的污染和清洗,膜清洗 A、試劑：水、鹽溶液、稀酸、稀堿、表面活性劑、絡(luò)合劑、氧化劑和酶溶液等。 B、原則：去污能力好，對膜無損害，成本最低。 C、方法：反向清洗，

18、試劑置換，化學(xué)降解消化。 E、預(yù)防：膜的預(yù)處理(用乙醇浸泡聚砜膜)，料液預(yù)處理(調(diào)pH，預(yù)過濾)，開發(fā)抗污染膜，臨界壓力操作等。,超臨界萃取( Supercritical Fluid Extraction ),超臨界萃取是70年代興起的一門新興的分離技術(shù)。大約100年前，Hannay和Hogarth發(fā)現(xiàn)了處在超臨界狀態(tài)下的CO2無論對液體或固體都有顯著的溶解能力。 20世紀(jì)50年代美國科學(xué)家率先從理論上提出了將超臨界流體用于萃取分離的可能性，并于70年代，用超臨界CO2(SCCO2) 萃取乙醇獲得成功,第五節(jié) 萃取與色譜分離,1. 超臨界流體的性質(zhì),超臨界流體(Supercritical Fluid)是指溫度、壓力高于臨界溫度Tc和臨界壓力pc的流體。,超臨界流體兼有液體和氣體的雙重特性：粘度接近氣體，擴散系數(shù)為一般液體的10倍，因此傳質(zhì)速率快；密度接近液體，因此有很強的溶解能力，并可通過調(diào)節(jié)壓力、溫度或加入其它助劑改變?nèi)芙舛取?CO2氣體、液體和超臨界流體的物理性質(zhì),氣體 液體 臨界體 超臨界體 (常溫常壓) (常溫