流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[60頁(yè)]

1、流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)及盲樣考核結(jié)果分析,湖南省疾病預(yù)防控制中心 微生物檢驗(yàn)科 黃一偉 2013-12-27,流感監(jiān)測(cè)目的,（一）監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)水平和流行動(dòng)態(tài)； （二）及時(shí)發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預(yù)警； （三）為全球及我國(guó)流感疫苗毒株的預(yù)測(cè)和推薦提供依據(jù)。,流感監(jiān)測(cè)內(nèi)容,（一）流感樣病例監(jiān)測(cè) （二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè),流感樣病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本采集,采集對(duì)象： 流感樣病例 發(fā)熱（體溫38），伴咳嗽或咽痛之一者 采集時(shí)間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集 采集地點(diǎn)：國(guó)家級(jí)流感樣病例監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院 采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家哨點(diǎn)醫(yī)院每周至少采集515份流感樣病例的標(biāo)本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強(qiáng)度、防控工作

2、需要實(shí)時(shí)調(diào)整）,暴發(fā)疫情標(biāo)本采集,（1）1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門(mén)診留觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的死亡病例； （2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。 每一起暴發(fā)疫情一般應(yīng)當(dāng)采集10份左右咽、鼻拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)當(dāng)盡量全部采樣）。,采集標(biāo)本類(lèi)型,常規(guī)特殊 咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻拭子 鼻洗液 痰液 呼吸道灌洗液 肺組織活檢標(biāo)本 尸檢標(biāo)本,采樣液,常用的采樣液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM； 標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐?/p>

3、低溫保存，同時(shí)加入抗菌素（入慶大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）,咽拭子采集,咽拭子 用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。,標(biāo)本的保存與運(yùn)送,標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下，盡快（哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)48小時(shí)疫情24小時(shí)內(nèi)）運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 未能送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70或以下保存，一周內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室 凍存的標(biāo)本，盡量避免其反復(fù)凍融，在冷藏條件下送到實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室生物安全要求,季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 流感病毒分離鑒定及其它檢測(cè)過(guò)程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過(guò)程必須在生物安

4、全級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里操作。 用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)可以在生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,標(biāo)本的接收,接收標(biāo)本時(shí)必須核對(duì)送檢表 流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員接到標(biāo)本后，24小時(shí)內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測(cè)病例標(biāo)本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”,標(biāo)本的處理,標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，未加抗菌素的加入適量的抗菌素。 將原始標(biāo)本一分為三份，一份（1ml）用于MDCK細(xì)胞接種，一份（1ml）用于雞胚接種，一份（1ml）保存待復(fù)核。（根據(jù)檢測(cè)程序?qū)崟r(shí)調(diào)整）,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),核酸檢測(cè) 病毒分離和鑒定：雞胚分離和細(xì)胞培養(yǎng) 膠體金快速檢測(cè),檢測(cè)流程,臨床標(biāo)本采集,接種MDCK細(xì)胞,接種雞胚,紅細(xì)胞

5、凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),寄送國(guó)家流感中心,流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性,核酸檢測(cè),核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit 1）在1.5ml 離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標(biāo)本用10懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。 3）稍離心后，加入560ul無(wú)水乙醇，震蕩15s。 4）將Viral RNA Mini spin柱子取出，將步驟3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。 5）重復(fù)步驟4。 6）將吸附

6、柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm離心1min。棄套管及其離心液。 7）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。 8）將吸附柱放入一新的1.5ml 離心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室溫靜置13分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即實(shí)驗(yàn)或20以下保存。,熒光定量PCR,第一次使用前引物稀釋 1引物工作濃度（40M） 配制方法： （1）將新合成的引物開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10

7、總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100M，可作為儲(chǔ)存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若2OD的量為9.1 nmol ，加水量為109.191l） （3）將100M的引物2.5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為40M，可作為工作濃度。 2探針工作濃度（10/20M/） 配制方法： （1）將新合成的探針管開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100M，可作為儲(chǔ)存液。 （3）將100M的探針10/5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為10/20M，可作為工作濃度。,熒光定量PCR,引物和探針 稀釋好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化（已

8、融的探針避光2-8可保存多達(dá)3個(gè)月，不要對(duì)探針?lè)磸?fù)凍融）； 渦旋振蕩引物和探針； 瞬時(shí)離心引物和探針，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的試劑 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在試驗(yàn)過(guò)程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。,熒光定量PCR,反應(yīng)體系和條件 試劑：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，貨號(hào)：11732-020或11745-100） 分子級(jí)無(wú)菌蒸餾水 (無(wú)RNA酶和DNA

9、酶) 正反向引物 (40M) 雙重標(biāo)記探針(10M) 反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反應(yīng)體系為25ul 注：*在55 度這一步驟中要收集熒光信號(hào)（FAM）,熒光PCR結(jié)果陽(yáng)性樣品,熒光PCR結(jié)果陰性樣品,熒光PCR結(jié)果可疑樣品,病毒分離-MDCK細(xì)胞,標(biāo)本接種MDCK細(xì)胞,每日觀察細(xì)胞病變(CPE),MDCK細(xì)胞收獲,3335培養(yǎng),接種流程,清洗MDCK 細(xì)胞,臨床采樣標(biāo)本接種細(xì)胞,Hanks液清洗細(xì)胞，一般清洗2遍,3335度吸附12小時(shí),Hanks液清洗細(xì)胞,加入病毒生長(zhǎng)液，3335度培養(yǎng)箱培養(yǎng),24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變?yōu)?/p>

10、3+或4+時(shí)，即75100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融12次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無(wú)細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲 （細(xì)胞病變情況：細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落 ）,根據(jù)使用的細(xì)胞瓶的大小，決定接種量，一般的小細(xì)胞瓶接種0.5ml的臨床標(biāo)本,流程圖,MDCK細(xì)胞病毒分離,CPE出現(xiàn)時(shí)間與感染病毒的型別、毒株的差異、感染量的大小和MDCK細(xì)胞的敏感性有關(guān) 每日觀察細(xì)胞病變(CPE) 標(biāo)本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，繼續(xù)盲傳12代后，HA試驗(yàn)仍為陰性者，則MDCK細(xì)胞病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去,細(xì)

11、胞病變圖,雞胚病毒分離,標(biāo)本接種于9日齡雞胚,3335培養(yǎng)72小時(shí),檢卵,標(biāo)本準(zhǔn)備,雞胚分離方法-試劑準(zhǔn)備,1) 911日齡雞胚 2) 照蛋燈 3) 70%75酒精 4) 1ml 一次性注射器 5) 雞蛋開(kāi)孔器 6) 無(wú)菌膠布或蠟 7) 10ml 試管和試管架 8) 10ml 移液管或1ml移液器及無(wú)菌吸尖 9) 無(wú)菌鑷子 10) 無(wú)菌眼科剪,雞胚分離方法-標(biāo)記雞胚, 檢視標(biāo)記雞胚 用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊 胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，死胚無(wú)胎動(dòng) 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊 膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限 標(biāo)記出雞胚的氣室與尿

12、囊的界限、胚胎頭部的位置 如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉, 接種病毒方法 單腔接種 盲種 雙腔接種 燈下接種 開(kāi)窗接種,雞胚分離方法,雞胚分離流程（1）,將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋盤(pán)上，通常每個(gè)樣本接種3個(gè)雞胚 用70%75酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開(kāi)10 x6mm窗口 用注射器吸200l處理過(guò)的臨床標(biāo)本，裝上16 號(hào)針頭 從窗口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開(kāi)，此時(shí)在照蛋燈下即 可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的 鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可

13、注射100l標(biāo)本。將針頭退出至 寸，將另外100 l標(biāo)本 注入雞胚尿囊腔,雞胚分離流程（2）,用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外的兩枚雞胚 將針頭棄于合適的生物安全裝置中 用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口 3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23 天。臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天 雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去,雞胚分離流程（3）,收獲尿囊液和羊水 雞胚在收獲前應(yīng)4過(guò)夜或至少放置4小時(shí) 標(biāo)記15ml 無(wú)菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致 用70%75酒精消毒雞胚頂部 用無(wú)菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開(kāi)雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取雞胚

14、尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè)雞胚的羊水合并,雞胚病毒鑒定,經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼續(xù)盲傳1代（72小時(shí)），如仍為陰性，則雞胚病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去,雞胚收獲,HA試驗(yàn),病毒鑒定,紅細(xì)胞凝集 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),病毒鑒定流程,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),4個(gè)凝集單位配制“回滴”,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),判定流感病毒型別,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）,MDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），確定病毒滴度 原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋

15、白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn),A,H,B,C,D,E,F,G,100ul病毒液,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液,50ulPBS,稀釋病毒 加入配制好的紅細(xì)胞懸液 充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果,病毒 原液,1：2,1：128,HA： 32,HA128,HA： 4,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）,HA滴度8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制

16、（HI）試驗(yàn)；HA滴度8者，繼續(xù)在敏感的MDCK細(xì)胞系或雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使其HA滴度8后，再進(jìn)行HI測(cè)定 若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定,紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn),HA試驗(yàn)完成后，用國(guó)家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)，確定病毒的型別和亞型，進(jìn)行HI試驗(yàn)時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照。,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)步驟,4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè) 稀釋血清 加入25ul 4個(gè)血凝單位抗原，室溫孵育15-30分鐘 每孔加入50ul紅細(xì)胞懸液，充分搖勻。室

17、溫孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果,4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè),4個(gè)凝集單位的配制 讀取紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的結(jié)果 計(jì)算所須的4個(gè)凝集單位的病毒用量 用50ul檢測(cè)4個(gè)凝集單位時(shí)，用凝集效價(jià)除以8，所得商即為4個(gè)單位的稀釋度 用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)“回滴”，復(fù)核4個(gè)凝集單位 用50ul，前4孔完全凝集 。此時(shí)的抗原即為4個(gè)凝集單位,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清,1,2,7,6,5,3,4,9,8,10,H1 血清 50ul,H3 血清 50ul,50ul PBS,B 血清 50ul,25ul PBS,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,B 血清 50ul,H3 血清

18、 50ul,H1 血清 50ul,流感病毒的型別判定,標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待鑒定病毒的抑制效價(jià)20才可以算為陽(yáng)性 一個(gè)待鑒定病毒不能同時(shí)被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制 待鑒定病毒與標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他參照血清4倍以上時(shí)，可以判定為此型別的流感病毒,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)-質(zhì)量控制,使用的試劑可靠無(wú)誤 處理后的血清有無(wú)殘余非特異性凝集素 讀取HA試驗(yàn)的結(jié)果是否正確 4個(gè)血凝單位是否準(zhǔn)確 紅細(xì)胞陰性對(duì)照 待鑒定病毒確保沒(méi)有被細(xì)菌污染 稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確,結(jié)果錄入,流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員在完成病毒分離后，24小時(shí)內(nèi)將病毒分離結(jié)果錄入“監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”中的“病毒分離、鑒定結(jié)果登記一覽表”