肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測參考幻燈片.ppt

1、肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測,1,2,3,Part 1,4,肺炎支原體及耐藥突變檢測,項目簡介,4,p1302,5,兒童肺炎支原體肺炎,社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP) 肺炎支原體肺炎 (Mycoplasma pneumoniae,MP) MP 占CAP的1040%。 支原體：是介于細菌與病毒之間的微生物。已發(fā)現(xiàn)約60種，14種可致病. 致呼吸道感染：肺炎支原體最常見，沙眼衣原體次之。,6,實驗室診斷：病原學檢查,包括：培養(yǎng) 血清學（特異性：Ag、Ab；非特異性）、 核酸診斷技術(shù)（PCR ） 分離培養(yǎng)： （1）咽喉、鼻咽、胸水或體液中分離培養(yǎng)出

2、MP是診斷MP感染的可靠標準。 （2）需1014天或更長，早期診斷意義不大，用于回顧性診斷和研究。 （3）快速培養(yǎng)敏感性和特異性均不高，價值有限。,兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識. 中華實用兒科臨床雜志.2015，30（17）：1304,7,病原學檢查：血清學,特異性診斷：檢測抗原和抗體 1.明膠顆粒凝集試驗（PA）：檢測IgM和 IgG混合抗體。 單次抗體滴度1:160，診斷近期感染參考價值。 恢復期和急性期雙份抗體滴度：4倍/4倍以上增高/減低時，確診價值 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：可分別檢測IgM和IgG， 單次MP-IgM陽性：對診斷MP的近期感染有價值。 恢復期和急性期Ig

3、M或IgG抗體滴度呈4倍或者4倍以上增高或減低時，可以確診為MP感染。 非特異性診斷：冷凝集試驗（CA），參考價值。 MP感染時陽性率僅為50%左右； 腺病毒、巨細胞病毒、EB病毒等感染也可誘導血清冷凝集素的產(chǎn)生。,兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南. 中華兒科雜志.2013，51（10）：745 成人肺炎支原體肺炎診治專家共識，中華結(jié)核和呼吸雜志，2010,33（9）：643,8,病原學檢查：血清學,MP-IgM： (1) 病程：感染后早期抗體，一般感染后45天出現(xiàn)，檢測太早可假陰性。持續(xù) 13個月甚至更長； (2)年齡： 嬰幼兒免疫功能不完善，產(chǎn)生抗體能力低，可出現(xiàn)假陰性或者低滴度的抗體，評價結(jié)果

4、時需考慮患兒的病程及年齡。 (3) 廠家及方法：試劑盒生產(chǎn)廠家和檢測方法不同，判斷的陽性結(jié)果值有所差異。,9,病原學診斷：核酸診斷技術(shù),方法：RT-PCR、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術(shù)、RNA恒溫擴增實時熒光檢測（SAT）技術(shù)等。 優(yōu)點： （1）特異性強、敏感、快速，可用于早期診斷。 （2）核酸擴增技術(shù)不受年齡、抗體產(chǎn)生能力、病程早晚及用藥因素干擾，感染早期檢測率最高。 注意：與感染后攜帶狀態(tài)鑒別。 有研究顯示，MP感染后1個月，其DNA的檢出率仍然高達50%， MP-DNA持續(xù)攜帶的中位數(shù)時間為7周，個別達7個月之久。 聯(lián)合檢測：血清學和核酸檢測聯(lián)合，提高檢出率。,10,小結(jié),無論是分離培

5、養(yǎng)， 血清學檢測， 還是分子生物學檢測， 都存在各自的局限性， 目前學者多推薦采用 2 種或 2 種以上診斷方法相結(jié)合，以提高診斷的準確性。針對不同的診斷方法，具體分析實驗中出現(xiàn)的結(jié)果不一致現(xiàn)象，適當調(diào)整試驗方法， 綜合考慮臨床、 經(jīng)濟性以及可操作性等問題，探索并制定出更適合于臨床的快速、 準確、 經(jīng)濟的診斷方法， 必將推動 MP 感染臨床診斷和治療的進一步發(fā)展。,11,治療肺炎支原體肺炎常用抗菌藥物： 大環(huán)內(nèi)酯類 氟喹諾酮類 四環(huán)素類 抗感染治療的療程通常需要10-14天，部分難治性病例的療程可延長至3周左右,用藥治療,12,大環(huán)內(nèi)酯類：首選,機理：與MP核糖體的特殊靶位的蛋白質(zhì)結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)

6、肽酶作用，感染mRNA移位，選擇性抑制MP蛋白質(zhì)合成。 種類： 第一代：紅霉素 第二代：阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素； 第三代酮內(nèi)酯類：泰利霉素（telithromycin）,塞紅霉素（cethromycin) 用于MP治療的主要是1、2代，三代尚未用于兒童。,兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南（2013修訂），中華兒科雜志，2013,51（10）：745,13,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥形勢嚴峻！,自2001年日本首次分離到對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP后，世界多 國相繼報道出現(xiàn)MP耐藥株，日本及中國MP耐藥率明顯高于其他國家。 日本MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率達到40%； 美國MP耐藥率大約8.3%；

7、 多數(shù)歐洲國家，耐藥率低于10%； 在中國，有報道住院兒童MP耐藥率80%，成人耐藥率約為69%。,14,我國肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯藥物耐藥嚴重,我國北京、上海兩家醫(yī)院，兒童呼吸道感染患者中肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率已經(jīng)超過了80%,Diagn Microb Infect Dis，2010(in press)/AAC 2009; 53: 21582159 / AAC 2008;52: 348350 Clin Microbiol Infect. 2009 Sep 17. Epub ahead of print /J Clin Microbiol.2007; 45:35343539,15,

8、肺炎支原體對于大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率高達69%,356例成人患者中共分離到67株肺炎支原體： CAP患者肺炎支原體的分離率顯著高于急性上呼吸道感染患者 69%(46株) 肺炎支原體對于紅霉素耐藥(MIC值32 g/mL),Clin Infect Dis 2010;51:189194,16,大環(huán)內(nèi)脂類抗生素耐藥機制,研究發(fā)現(xiàn)，MP的耐藥機制與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的的結(jié)合位點有關(guān)，其中在23S rRNA上的2063和2064兩個位點的點突變，是引起 MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要原因。 研究顯示，發(fā)生耐藥位點（2063位點和2064位點）突變的MP感染患者與未發(fā)生突變的MP感染患者相比，不僅發(fā)熱時間、住

9、院時間和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的起效時間更長，且肺外并發(fā)癥的發(fā)生率更高，影像學結(jié)果顯示病情更嚴重。 耐藥突變給臨床治療帶來眾多問題，如患兒的臨床癥狀加重、肺外并發(fā)癥增多、住院時間延長、治療經(jīng)費增高等。,17,非大環(huán)內(nèi)酯類：,四環(huán)素類 包括：多西環(huán)素、米諾環(huán)素/美滿霉素、替加環(huán)素、 作用：對MP強大的抑菌活性。 機理：作用于MP核糖體30S亞基，抑制蛋白質(zhì)合成的肽鏈延長。 副作用：可能使牙齒發(fā)黃或者牙釉質(zhì)發(fā)育不良等，應(yīng)用于8歲以上患兒。,18,非大環(huán)內(nèi)酯類：喹諾酮類,機理：與MP的DNA 解旋酶和拓撲異構(gòu)酶發(fā)生交替作用，干擾和抑制蛋白質(zhì)合成，對MP有抑制作用。 品種：呼吸喹諾酮（左氧氟沙星、莫西沙星、吉

10、米沙星）抗MP活性及組織穿透性、吞噬細胞內(nèi)濃度均良好。環(huán)丙沙星抗MP活性好，但組織穿透性差；諾氟沙星、伊諾沙星抗MP活性差。 副作用:可能對骨骼產(chǎn)生不良影響，18歲以下兒童使用受到限制。 目前在國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)對喹諾酮類、四環(huán)素類耐藥的肺炎支原體菌株報道。,成人肺炎支原體肺炎診治專家共識，中華結(jié)核和呼吸雜志，2010,33（9）：643,19,耐藥檢測方法,20,21,檢測MP-DNA及耐藥突變位點意義,采用熒光PCR技術(shù)，可以一步檢測，同時解決兩大問題，明確病原體的同時確定是否耐藥，即時給出用藥指導。 意義： 1、直接檢測病原體，早期、快速、特異診斷；有利于臨床癥狀分析及病情監(jiān)測； 2、對患者

11、進行MP耐藥基因突變檢測，不僅可以輔助臨床醫(yī)生及時診斷和監(jiān)測病情，同時有利于指導醫(yī)生合理用藥，避免濫用抗生素 ， 3、有利于選擇合理治療方案，針對性治療；有利于預判病程發(fā)展，向病人及家屬解釋病程情況,22,耐藥MP感染的治療,抗生素治療 對于耐藥MP感染來說，目前可應(yīng)用為紅霉素、阿奇霉素序貫療法，即紅霉素靜滴37天，口服阿奇霉素3天，停4天，7天為一個療程，根據(jù)病情按此方案重復24次，此治療方案不良反應(yīng)小、依從性好，效果滿意。對于重癥病例也可聯(lián)合使用利福平和大環(huán)內(nèi)酯類藥物，兩者對MP有著協(xié)同的抑蔚作用。如患兒年齡大于8歲，使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療效果不滿意時，可使用四環(huán)素類藥物如米諾環(huán)素，因其作

12、用機制不同，故對耐藥MP有一定療效。,23,耐藥MP感染的治療,中醫(yī)藥治療 中醫(yī)認為肺炎屬于溫病范疇，肺炎的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸與毒無不相關(guān)，因此治療肺炎的首要措施是祛邪解毒；同時肺為多氣多血之臟，易出現(xiàn)氣郁血瘀，可加用活血化瘀藥。故肺炎的治療主要以清熱解毒及活血化瘀為主。中藥的作用機制有別于大環(huán)內(nèi)酯類抗牛素，而且單味藥本身含多種成分并具有多種藥理作用，雖不十分清楚，但I臨床上已取得良好的療效，故挖掘我同中醫(yī)藥偉大寶庫，探索有效的中藥，也是耐藥MP肺炎防治工作的當務(wù)之急。,24,耐藥MP感染的治療,免疫治療 目前研究認為MP肺炎是由于病原體本身及其激發(fā)的免疫反應(yīng)共同所致。對耐藥MP感染且具有多種肺外并發(fā)癥的重癥病例，及時、早期、短程應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素是必要的，這對阻止炎性反應(yīng)的發(fā)展、減輕感染中毒癥狀、預防和控制哮喘及其他并發(fā)癥等有重要臨床價值，可縮短治療療程和減少后遺癥。其應(yīng)用指征為：急性期病情嚴鶯的MP感染；肺部病變遷延而出現(xiàn)肺不張、肺間質(zhì)纖維化、支氣管擴張及肺外并發(fā)癥者。 對于有明顯免疫功能缺陷、藥物性免疫抑制或伴心肺功能障礙者，尤其當MP感染后合并或繼發(fā)混合感染，造成機體組織損傷較迅速且