實驗一、RNA提取及檢測.ppt

1、實驗 一、RNA提取及檢測,一、實驗目的 掌握植物RNA RNA提取及檢測方法 二、實驗試劑及材料 水稻葉片、液氮、Trizol試劑、氯仿、異丙醇、DEPC水 三、實驗器材 恒溫水浴鍋、PCR儀、臺式低溫離心機、移液槍、研缽、紫外分光光度計，一次性手套。,四、實驗步驟 采用Trizol法提取RNA(50100mg組織ml trizol)，以加1ml Trizol為例，操作流程如下： (1) 研缽加液氮數(shù)次至足夠冷，加入樣品，研磨至粉末。加入Trizol（每100mg組織加1ml的Trizol），充分研磨，放在室溫下解凍。 (2) 除不溶性物質：28C下12000g離心10min，不溶性物質沉淀

2、，將RNA的上清移入1.5 ml離心管中。 (3)相分離：在1530下放置5min，使核蛋白復合物完全解離。加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，室溫下溫浴23min。28下，12000g離心15min，RNA全部溶解于上層水相中，把水相移入另一1.5ml離心管中。,(4) 氯仿再次去雜：加0.5ml氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫下溫浴23min；28下，12000g離心15min，把水相轉入1.5ml離心管中。 (5) RNA沉積：加入0.5ml異丙醇，1530溫浴10min；2-8下，12000g離心10min，RNA沉積在離心管的底部及側壁。 (6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，

3、28下7500g離心5min，小心將上清液倒掉。 (7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，28下，7500g離心5min，小心將上清液倒掉。 (8)RNA的溶解：將離心管倒扣在吸水紙上510min，每管加30l的DEPC水，可在5560下助溶10min。,(9)RNA濃度：用DEPC水稀釋100倍，用紫外分光光度計 測定OD值（260nm、280nm 230nm），估算RNA濃度。-70 保存。 總RNA定量方法 RNA在260nm波長處有最大吸收峰。OD值為1相當于大約40g/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照，根據此時讀出的OD260值

4、即可計算出樣品稀釋前的濃度：RNA（mg/ml）=40OD260讀數(shù)稀釋倍數(shù)(n)/1000,RNA濃度檢測過程 （1）取少量待測RNA樣品，用DEPC 水稀釋100倍。 （2）用DEPC 水做空白，在260 nm、280 nm、230 nm處調節(jié)紫外分光光度計的讀數(shù)至零。 （3）加入待測RNA樣品在三個波長處讀取OD值。 RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質存在；比值太高，則提示RNA有降解。 OD260/OD230比值應 2.0，若比值較低說明鹽分過高。,電泳檢測RNA質量： （1）配制1.2

5、%的瓊脂糖凝膠（20mL） 稱取瓊脂糖0.24 g，加DEPC處理的ddH2O 12.04 mL，5RNA 電泳緩沖液4 mL，電爐加熱融化瓊脂糖，冷卻至55C，加入甲醛1.96 mL，冷卻后倒膠。 （2）RNA電泳 取去離子甲酰胺10 L，甲醛1.5 L，10 RNA Buffer 2 L，RNA (24 g, 10 L)混合液，65C加熱15min，迅速在冰浴中冷卻片刻，然后加入3 L RNA 加樣緩沖液和0.5 L EB，上樣電泳。電泳Buffer 為1 RNA buffer。,（2）RNA電泳結果判別質量： 出現(xiàn)的電泳條帶有兩條，是兩條最大的核糖體RNA（rRNA）分子，即18S 和2

6、8S rRNA，較小的RNA也很豐富但看不到，因為太小，跑出了凝膠的邊界。多數(shù)細胞中的信使RNA（mRNA）經EB染色后不足以形成可見的帶。只要18S 和28SrRNA帶亮，且28S rRNA大約為18S rRNA 的兩倍，說明提取的RNA沒有發(fā)生降解，純度好。,五、總RNA提取常見問題分析,RNA降解 1、外源RNA酶的污染：試劑，器械及實驗環(huán)境中的RNA酶進入實驗系統(tǒng)。 2、內源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多；勻漿時溫度過高。 3、外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。在液氮條件下將

7、組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后移至-70冰箱保存。樣品決不能未經液氮速凍而直接保存于-70冰箱中。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預冷。,OD260/OD280比值偏低1. 蛋白質污染：確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。3.多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和

8、植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會導致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時，需要注意多糖、多酚雜質的去除。4.設備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時，對照及樣品稀釋液請使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導致比值偏低。,RNA提取得率低1. 該組織或者細胞中RNA含量偏低： 不同細胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4g/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量0.05g/mg)。2. 組織起始量太少或者太多： 樣品量過少，則細胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導致RN