理工論文基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展.doc

基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展 基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展是小柯論文網(wǎng)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)搜集，并由本站工作人員整理后發(fā)布的，基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展是篇質(zhì)量較高的學(xué)術(shù)論文，供本站訪(fǎng)問(wèn)者學(xué)習(xí)和學(xué)術(shù)交流參考之用，不可用于其他商業(yè)目的，基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展的論文版權(quán)歸原作者所有，因網(wǎng)絡(luò)整理，有些文章作者不詳，敬請(qǐng)諒解，如需轉(zhuǎn)摘，請(qǐng)注明出處小柯論文網(wǎng)，如果此論文無(wú)法滿(mǎn)足您的論文要求，您可以申請(qǐng)本站幫您代寫(xiě)論文，以下是正文。 摘要 基因的表達(dá)和調(diào)控是植物基因工程研究的中心內(nèi)容之一，從基因克隆方法、克隆載體的構(gòu)建、瞬時(shí)表達(dá)分析、報(bào)告基因的選擇以及基因表達(dá)量分析的方法5個(gè)方面對(duì)植物基因克隆與表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞 基因表達(dá)；基因克??；表達(dá)量分析；northern雜交中圖分類(lèi)號(hào) s785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a文章編號(hào)1007-5739（2008）22-0280-02植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生命周期是不同的基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)的結(jié)果?；虻谋磉_(dá)調(diào)控受多種內(nèi)外因子的影響。根據(jù)基因表達(dá)性質(zhì)可將其分為2大類(lèi)：一是瞬時(shí)調(diào)控或稱(chēng)可逆性調(diào)控，包括某種底物或激素水平升降和細(xì)胞周期不同階段中酶活性和濃度的調(diào)節(jié)；二是發(fā)育調(diào)控或稱(chēng)不可逆調(diào)控，它決定了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和發(fā)育的全部進(jìn)程。根據(jù)基因調(diào)控在同一事件中發(fā)生的先后次序，又可將其分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控及蛋白質(zhì)加工水平調(diào)控等。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用的影響。植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的dna序列，能指導(dǎo)全酶與模版的正確結(jié)合，活化rna聚合酶，使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄的形式，并決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率以及所使用的rna聚合酶類(lèi)型，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。因此，植物基因啟動(dòng)子的克隆，對(duì)研究植物基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。1基因克隆方法通過(guò)對(duì)已發(fā)表的大豆基因的克隆方法進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，其克隆策略可概括為2種：一種是用已知克隆作為探針篩選cdna或gdna文庫(kù)，從而獲得所需的靶基因序列，然后再選擇合適的載體進(jìn)行基因克隆測(cè)序。從基因組文庫(kù)中克隆相對(duì)費(fèi)時(shí)，但可獲得較多側(cè)翼序列。另一種則是采用pcr技術(shù)，即利用基因兩端序列高度保守的特點(diǎn)，依據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，用pcr直接擴(kuò)增基因組dna，然后用southern雜交和非整倍體材料進(jìn)行定位，再亞克隆后測(cè)序。2克隆載體的構(gòu)建植物基因轉(zhuǎn)移的目的在于將目的基因?qū)胄枰牧嫉闹参?，使之正確而有效地表達(dá)，并將產(chǎn)生的目的性狀以可預(yù)言的方式穩(wěn)定遺傳下去。然而目的基因片段很難直接轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，而且由于它自身常無(wú)dna復(fù)制所需信息，在細(xì)胞分裂時(shí)不能復(fù)制給子細(xì)胞，從而丟失，所以人們要把它連在一些能獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外復(fù)制的dna片段上，這些dna片段就叫載體。常用的載體有質(zhì)粒和病毒。質(zhì)粒是最常用的載體，它通常是dna環(huán)狀分子，可以獨(dú)立地存在于細(xì)菌細(xì)胞中，而且質(zhì)粒上總是有1個(gè)或多個(gè)可賦予宿主細(xì)胞以某些有用特性的基因，如質(zhì)粒上的抗生素基因可以使宿主細(xì)胞在一定濃度的氯霉素或是氨芐青霉素等抗生素存在的培養(yǎng)基中存活。這些抗生素基因在克隆技術(shù)中常被用作選擇標(biāo)記（selectable marker），以選擇和鑒定重組子。在基因克隆中使用最廣泛而且結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的載體一般都來(lái)源于較小的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌中所存在的這種質(zhì)粒載體，不僅易于純化，轉(zhuǎn)化效率高，選擇重組子方便，而且可攜帶的外源目的基因的容量也較大（大約5kb）。因此，一些常規(guī)克隆實(shí)驗(yàn)都用質(zhì)粒載體。質(zhì)粒除了在細(xì)菌細(xì)胞中廣泛存在外，其他細(xì)胞中并不普遍存在，如在真核細(xì)胞中僅發(fā)現(xiàn)極少的幾種質(zhì)粒，其中研究最深的是酵母（saccharomyces cerevisiae）中的2um環(huán)（2um circle），人們已經(jīng)將其構(gòu)建成了能在酵母中表達(dá)的載體，使基因工程的應(yīng)用范圍得以擴(kuò)大。為構(gòu)建高效植物表達(dá)載體，人們需要對(duì)天然質(zhì)粒及病毒進(jìn)行一系列改造，如加上耐藥性基因片段等，以提高基因轉(zhuǎn)化、篩選、表達(dá)的效率。構(gòu)建好載體后，將目的dna片段與載體實(shí)現(xiàn)連接，形成全新的重組dna分子，通過(guò)一定的方法導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，便可能獲得轉(zhuǎn)基因植株。3報(bào)告基因的選擇報(bào)告基因（reporter gene）是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其他目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件：一是已被克隆和全序列已測(cè)定；二是表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；三是其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報(bào)告基因有以下幾種：胭脂堿合成酶基因（nos）、章魚(yú)堿合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。nos、ocs這2個(gè)基因是致瘤土壤農(nóng)桿菌（agrobacterium tumfaciens）的ti質(zhì)粒特有的，對(duì)ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，用相應(yīng)的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體時(shí)，如果外源基因轉(zhuǎn)入植物體中，則這2種報(bào)告基因在植物根莖葉中均能表達(dá)，不受發(fā)育調(diào)控，檢測(cè)時(shí)直接用轉(zhuǎn)化體提取液進(jìn)行紙電泳，染色后在紫外光下觀察熒光即可。npt、cat及慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因均為抗生素篩選基因，相關(guān)的酶可以對(duì)底物進(jìn)行修飾（磷酸化、乙?；龋?，從而使這些抗生素失去對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，使得含有這些抗性基因的轉(zhuǎn)化體能在含這些抗生素的篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，也可以用轉(zhuǎn)化體提取液體、外用同位素標(biāo)記、放射自顯影篩選轉(zhuǎn)化體。目前常用的一種報(bào)告基因是-d-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成-d-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無(wú)背景，組織化學(xué)檢測(cè)很穩(wěn)定，可用分光光譜、熒光等進(jìn)行檢測(cè)。熒光酶基因（luc）是1985年從北美熒火蟲(chóng)和叩頭蟲(chóng)cdna文庫(kù)中克隆出來(lái)的，該酶在有atp、mg2、o2和熒光素存在下發(fā)出熒光，這樣就可用轉(zhuǎn)基因植物整株或部分直接用x-光片或?qū)ｉT(mén)儀器進(jìn)行檢測(cè)。4瞬時(shí)表達(dá)分析瞬時(shí)表達(dá)（transient expression）是指導(dǎo)入外源基因后在短時(shí)間內(nèi)（數(shù)小時(shí)至幾天）就能檢測(cè)到其表達(dá)產(chǎn)物，但幾天后表達(dá)水平逐漸降低，直至消失的外源基因表達(dá)方式。這種表達(dá)方式在啟動(dòng)子研究中得到廣泛應(yīng)用。只要把一定的啟動(dòng)子區(qū)域和報(bào)告基因構(gòu)建在一起，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)就可以通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物分析哪些啟動(dòng)子序列是調(diào)節(jié)基因表達(dá)必需的。5基因表達(dá)量分析研究進(jìn)展現(xiàn)有的基因表達(dá)量分析的方法很多，如-actin、熒光定量pcr、半定量rt-pcr、northern雜交、rna酶保護(hù)分析等都可以用來(lái)做定量分析。這里就試驗(yàn)中常用到的2種方法作一介紹。5.1rt-pcrmrna定量研究一直是分子生物學(xué)的重要環(huán)節(jié)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的mrna定量研究的方法有nothern-blotting、原位分子雜交、rt-pcr等。傳統(tǒng)的nothern-blotting方法定量準(zhǔn)確，但其需要較多的rna樣品，對(duì)于一些難得的材料，很難收集到足夠量的標(biāo)本；對(duì)于一些低豐度的基因，用此方法很難檢測(cè)到；而且此法操作繁瑣，周期長(zhǎng)。原位雜交可對(duì)所要研究的目的基因進(jìn)行定位和定時(shí)研究，但此法操作步驟多，周期長(zhǎng)，要想得到理想的結(jié)果并非易事。rt-pcr是將目的mrna反轉(zhuǎn)錄成cdna，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，即使模板濃度較低，也能檢測(cè)。剛開(kāi)始，多采用同位素的方法檢測(cè)mrna，必須接觸同位素，且需經(jīng)電泳、壓片和掃描等多重環(huán)節(jié)。近來(lái)出現(xiàn)的不用溴化乙啶（eb）的熒光定量pcr，但需要特殊的儀器設(shè)備，如氦、氖液光引導(dǎo)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)器等（張翔等，1998）。戴建國(guó)等利用凝膠成像系統(tǒng)掃描rt-pcr產(chǎn)物熒光強(qiáng)度，建立mrna熒光定量分析方法。 pcr用于檢測(cè)細(xì)胞因子mrna，首先要將mrna 擴(kuò)增即rt-pcr，又稱(chēng)為細(xì)胞因子mrna擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，即mapping（massage amplification phenotyping）技術(shù)。rt-pc 基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展是小柯論文網(wǎng)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)搜集，并由本站工作人員整理后發(fā)布的，基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展是篇質(zhì)量較高的學(xué)術(shù)論文，供本站訪(fǎng)問(wèn)者學(xué)習(xí)和學(xué)術(shù)交流參考之用，不可用于其他商業(yè)目的，基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展的論文版權(quán)歸原作者所有，因網(wǎng)絡(luò)整理，有些文章作者不詳，敬請(qǐng)諒解，如需轉(zhuǎn)摘，請(qǐng)注明出處小柯論文網(wǎng)，如果此論文無(wú)法滿(mǎn)足您的論文要求，您可以申請(qǐng)本站幫您代寫(xiě)論文，以下是正文。r技術(shù)的步驟為：高質(zhì)量rna的提?。河糜趓t-pcr的rna分離，通常采用酸化異硫氰酸/酸/氯仿異戊醇直接提取或結(jié)合cccl超離心分離（piaa k e et al，1992；larrick j w et al，1989）如果要從總rna中進(jìn)一步分離poly（a）mrna，可采用oligo（dt）纖維素親和層析，oligo（dt）25包被的小珠或商品化的poly aaa+rna 分離試劑盒。不管哪種方法必須注意使用rna酶抑制劑并嚴(yán)格操作，防止rna被降解。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：逆轉(zhuǎn)錄體系包括mrna、dntp、rna抑制劑，轉(zhuǎn)錄相物及逆轉(zhuǎn)錄酶，根據(jù)酶（mmlv或amv）種類(lèi)不同決定反應(yīng)溫度、ph值和時(shí)間。值得指出的是cdna合成后剩余的mrna模板在pcr反應(yīng)中可能會(huì)與cdna發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。盡管大多數(shù)情況下amv、mm-lv中內(nèi)在的rna酶h足以降解剩余的mrna，如果逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏rna酶h活性，則必須加入rna酶h。引物設(shè)計(jì)及pcr反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)一般采用已發(fā)表的genbank中順序，引物長(zhǎng)度2030bp，擴(kuò)張長(zhǎng)度400bp，pcr擴(kuò)增后檢測(cè)之前一般還要確證一下pcr產(chǎn)物是否是預(yù)期的結(jié)果，采用的方法主要有限制酶圖譜，核酸測(cè)序或southern雜交。5.2northern雜交（northern blot hybridization）繼分析dna的southern雜交方法出現(xiàn)后，1977年alwine等人提出一種與此相類(lèi)似的、用于分析細(xì)胞總rna或含poly a尾的rna樣品中特定mrna分子大小和豐度的分子雜交技術(shù)，這就是與southern相對(duì)應(yīng)而定名的northern雜交技術(shù)。這一技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)，已得到廣泛應(yīng)用，成為分析mrna最為常用的經(jīng)典方法。與southern雜交相似，northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的rna分離開(kāi)來(lái)，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的dna或rna探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)rna所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強(qiáng)度則可提示目標(biāo)rna在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)rna的豐度）。但與soughern雜交不同的是，總rna不需要進(jìn)行酶切，即是以各個(gè)rna分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳。此外，由于堿性溶液可使rna水解，因此不進(jìn)行堿變性，而是采用甲醛等進(jìn)行變性電泳。雖然northern也可檢測(cè)目標(biāo)mrna分子的大小，但更多的是用于檢測(cè)目的基因在組織細(xì)胞中有無(wú)表達(dá)及表達(dá)的水平如何。6參考文獻(xiàn)1 ogawa te，tayama k，kitamur a.genetic improvement of seed storage proteins using three variant alleles of 7s globulin subunit in soybean （glycine max l.）j.japanj. breeding，1989（39）：137-147.2 郭靜成，薜彥彬.大豆種子蛋白及氨基酸組分分析j.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1985，11（1）：19-29.3 staswick p e，hermodson m a，nielsen n c.identification of the acidic and basic subunit complexes of glycininj.j. biol. chem，1981（256）：8752-8755.4 林忠平.有關(guān)提高大豆和其它豆類(lèi)含硫氨基酸的研究進(jìn)展j.大豆科學(xué)，1985，4（4）：327-335.5王麗俠，郭順堂，付翠真，等.大豆種子貯藏蛋白11s與7s組份的研究j.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19（4）：53-57.6 關(guān)榮霞，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟，等.栽培大豆蛋白亞基11s7s組成及過(guò)敏蛋白缺失分析j.作物學(xué)報(bào)，2004，30（11）：1076-1079.7 kitamura k，kaizuma n.mutant strains with low level of 7 sglo-bulin in soybean（glycine max merr.）seedj.japanj. breed，1981，31（4）：353-359.8 takahashi k，banba h，kikychi a，et al.an induced mutant line lacking the -subunit of -conglycinin in soybeanglycine max（l.）merrillj.ikushugaku zasshi，1994，44（11）：65-66.9 samoto m，fukuda y，takahashi k，et al.substantially comp-lete removal of three major allergenic soybean proteins（gly mbd 30k，gly mbd 28k，and the-subunit of-conglycinin）from soy protein by using a mutant soybean，tohoku 124j.biosci biotech biochem，1997， 61（12）：2148-2150.10 odanaka h，kaizuma n.mutants of soybean storage proteins induced with c-ray irradiationj.japan j. breed，1989，39（suppl 1）：430-431.11 hajika m，kitamura k，kitamura k.a line lacking all the seed lipoxygenase isozmes in soybean induced by gamma-ray irraditionj.japanese journal of breeding，1991（41）：507-509.12 harada j j，barker s j，robert b.soybean beta-cong-lycinin genes are clustered in several dna regions and are regulated by transcriptional and posttranscriptional processesj.plant cell，1989（1）：415-425.13 nobuyuki m，motoyadu a，takahashi k.crystal structures of recombinant and native soybean beta-conglycinin homotrimersj.eur j biochem，2001（268）：3595-3604.14 luis p-g，goldberg r b.soybean seed protein genes are regulated spatially during embryogenesisj.plant cell，1989（1）：1095-1109.15 meinke d w，chen j，beachy r n.expression of storage-protein genes during soybean seed developmentj.planta，1981（153）：130-139.其他參考文獻(xiàn)baker, sheridan. the practical stylist. 6th ed. new york: harper & row, 1985.flesch, rudolf. the art of plain talk. new york: harper & brothers, 1946.gowers, ernest. the complete plain words. london: penguin 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