蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能-2.pptVIP

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,第1章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白質(zhì)?,蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,蛋白質(zhì)研究的歷史,1833年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中分離到類似胃蛋白酶的物質(zhì)。 1864年，血紅蛋白被分離并結(jié)晶。 19世紀末，證明蛋白質(zhì)由氨基酸組成，并合成了多種短肽。 20世紀初，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；完成胰島素一級結(jié)構(gòu)測定。,20世紀中葉，各種蛋白質(zhì)分析技術(shù)相繼建立，促進了蛋白質(zhì)研究迅速發(fā)展； 1962年，確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。 20世紀90年代，功能基因組與蛋白質(zhì)組研究地展開。,蛋白質(zhì)的生物學重要性,分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。 含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80。,1. 蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分,作為生物催化劑（酶） 代謝調(diào)節(jié)作用 免疫保護作用 物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲 運動與支持作用 參與細胞間信息傳遞,2. 蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能,3. 氧化供能,蛋白質(zhì)的分子組成 The Molecular Component of Protein,第一節(jié),組成蛋白質(zhì)的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘 。,各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。,由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 (g %) = 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100,1/16%,蛋白質(zhì)元素組成的特點,一、組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸均屬于L-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（Gly，Pro除外）。,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,非極性脂肪族氨基酸 極性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 堿性氨基酸,二、氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行分類,(一)側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,(二)側(cè)鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸,(三)側(cè)鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸,(四)側(cè)鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸,(五)側(cè)鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸,幾種特殊氨基酸,脯氨酸 （亞氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質(zhì),兩性解離及等電點,氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,（一）氨基酸具有兩性解離的性質(zhì),pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,（二）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質(zhì),色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（三）氨基酸與茚三酮反應生成藍紫色化合物,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。 由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,四、蛋白質(zhì)是由許多氨基酸殘基組成的多肽鏈,肽鍵(peptide bond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,（一）氨基酸通過肽鍵連接而形成肽 (peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽鏈中有游離-氨基的一端 C 末端：多肽鏈中有游離-羧基的一端,多肽鏈有兩端：,多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) The Molecular Structure of Protein,第二節(jié),蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括:,一級結(jié)構(gòu)(primary structure) 二級結(jié)構(gòu)(secondary structure) 三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure) 四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure),定義: 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指在蛋白質(zhì)分子從N-端至C-端的氨基酸排列順序。,一、氨基酸的排列順序決定蛋白質(zhì) 的一級結(jié)構(gòu),主要的化學鍵: 肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。,一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。,二、多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象為蛋白質(zhì) 二級結(jié)構(gòu),主要的化學鍵：氫鍵,（一）參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上,參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,-螺旋 ( -helix) -折疊 (-pleated sheet) -轉(zhuǎn)角 (-turn) 無規(guī)卷曲 (random coil),（二）-螺旋結(jié)構(gòu)是常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),-螺旋,（二）-折疊（ -片層）,（四）-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在,-轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。,（五）模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu),在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為超二級結(jié)構(gòu)。,二級結(jié)構(gòu)組合形式有3種：， 。,二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，稱為模體(motif) 。,模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)。,鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體,鋅指結(jié)構(gòu),-螺旋-轉(zhuǎn)角（或環(huán)）-螺旋模體 鏈-轉(zhuǎn)角-鏈模體 鏈-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角-鏈模體,模體常見的形式,三、在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上多肽鏈進一步折疊形成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義:,（一）三級結(jié)構(gòu)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置,肌紅蛋白 (Mb),亞基之間的結(jié)合主要是氫鍵和離子鍵。,四、含有二條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)具有四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。,有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。,由2個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 The Relation of Structure and Function of Protein,第三節(jié),（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,（二）一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能,（四）重要蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基,血紅素結(jié)構(gòu),二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),（一）血紅蛋白亞基與肌紅蛋白結(jié)構(gòu)相似,肌紅蛋白(myoglobin，Mb),肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8段-螺旋結(jié)構(gòu)。 血紅素分子中的兩個丙酸側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+形成配位結(jié)合，所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。,血紅蛋白(hemoglobin，Hb),血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，每個亞基可結(jié)合1個血紅素并攜帶1分子氧。 Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合， Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白亞基構(gòu)象變化可影響亞基與氧結(jié)合,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,變構(gòu)效應(allosteric effect),蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應。,協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity) 如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應 (negative cooperativity),（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變可引起疾病,蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導致疾病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。 正常的PrP富含-螺旋，稱為PrPc。 PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為-折疊的PrPsc，從而致病。,瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì),蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。,蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI),二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。,顆粒表面電荷 水化膜,蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:,水化膜,帶負電荷的蛋白質(zhì),溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,三、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞而引起變性,在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。,蛋白質(zhì)的變性(denaturation),造成變性的因素: 如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例: 臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。 此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能，稱為復性(renaturation) 。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。,蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,蛋白質(zhì)沉淀,蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。,蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。,五、應用蛋白質(zhì)呈色反應可測定蛋白質(zhì)溶液含量,茚三酮反應(ninhydrin reaction),雙縮脲反應(biuret reaction),五、蛋白質(zhì)的分類,根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分:,根據(jù)蛋白質(zhì)形狀:,第五節(jié),蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,分離純化的一般原則：,前處理：把蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)從組織/細胞中 釋放出來，并保持天然狀態(tài) 粗分離：目的蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)分離 細分離：進一步提純，結(jié)晶,一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物,應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,透析(dialysis),超濾法,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法,使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。,免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,三、利用荷電性質(zhì)可用電泳法將蛋白質(zhì)分離,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:,四、應用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進行層析分離,待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。,層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理,離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。 凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。,蛋白質(zhì)分離常用的層析方法,五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離,超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。,蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。,因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系