《地高辛標記系統(tǒng)》PPT課件.ppt

探針的標記,地高辛標記系統(tǒng),常用標記物分類,放射性同位素標記,非放射性標記 熒光素標記 生物素標記 地高辛標記,地高辛（DIG）是靈敏度高、非放射性核酸標記檢測體系。DIG檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險、相比熒光則不需要特殊檢測設(shè)備，相比生物素則沒有樣本內(nèi)源干擾之苦，很適合用于核酸非放標記檢測。,地高辛標記的dUTP,地高辛標記系統(tǒng)的特點,標記和檢測技術(shù)安全 標記的探針穩(wěn)定可以保存一年 雜交液可以反復(fù)使用數(shù)次,與放射性同位素標記方法相同之處,標記和雜交技術(shù)相似 高靈敏度 低背景 可以標記DNA、RNA 或Oligonucleotides,與放射性同位素標記方法不同之處,無害,安全 產(chǎn)生的廢物不需特殊處理 需要分析的時間短 探針穩(wěn)定,地高辛標記與檢測的原理,利用不同的方法將Digoxigenin-11-dUTP摻入到新合成的探針DNA 或RNA鏈中或寡核苷酸的末端 探針與目標DNA雜交后，用連接有堿性磷酸酶或其它偶聯(lián)物的地高辛的抗體檢測地高辛標記的探針 根據(jù)地高辛抗體連接的偶合物不同，利用熒光檢測（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化學發(fā)光檢測(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或顯色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates)的方法將探針雜交的位置顯現(xiàn)出來,利用隨機引物標記的方法將 Digoxigenin-11-dUTP摻入到新合成的DNA 鏈中。 反應(yīng)體系中包含六堿基隨機引物、dNTP(含有堿性條件下不穩(wěn)定的Digoxigenin-11-dUTP，Klenow 酶及反應(yīng)所需的Buffer,隨機引物標記,DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一個DIG-dUTP 隨機引物法標記的探針是基于模板的不同區(qū)段、不同長度的DNA 片段 可以探測0.03-0.1pgDNA,DNA的地高辛標記和檢測步驟,探針DNA 的標記及標記效率測定 DNA的轉(zhuǎn)移和固定 雜交 免疫測定 洗去膜上探針再次雜交,操作基本要求,工作環(huán)境及試劑要干凈：（1）試劑要高壓滅菌；（2）含有SDS 的試劑要過濾滅菌；（3）TWEEN20應(yīng)加到預(yù)先滅菌過的試劑中 用具要干凈：用之前一定要清洗得非常干凈 操作尼龍膜時要小心（1）戴無塵手套；（2）用干凈的鑷子夾取膜的邊緣,探針模板DNA的要求,質(zhì)粒DNA純度要高。最好用高純度的質(zhì)粒DNA 分離和純化試劑盒純化質(zhì)粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除殘留的蛋白質(zhì)。純化后的模板用H2O 溶解 用作探針模板的DNA應(yīng)是線型的，大于100bp，如果模板DNA 5kb則應(yīng)用4堿基的限制性內(nèi)切酶切割成較小片段（切割后要純化） 模板的量：10ng-3g，如果要檢測復(fù)雜基因組中的單拷貝基因，標記模板的最低量要300ng（探針濃度：25ng/ml雜交液） 如果做基因組DNA southern blotting, 應(yīng)將克隆倒載體上的DNA 酶切后瓊脂糖電泳分離或PCR擴增，得到的片段都需要用試劑盒純化,標記步驟(20l),將10ng-1g 模板DNA用無菌去離子水補足至16 l。 沸水浴或干浴98 C 10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。 充分混勻DiG-high Primer （1#管），并取4 l至變性DNA管，混勻并離心。 37 C溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。 停止反應(yīng)，加2 l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 C加熱10分鐘。,本次實驗標記步驟(10l),將300ng 模板DNA用無菌去離子水補足至8 l。 沸水浴或干浴98 C 10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。 充分混勻DiG-high Primer （1#管），并取2 l至變性DNA管，混勻并離心。 37 C溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。 停止反應(yīng)，65 C加熱10分鐘。,探針標記效率檢測,目的是確定雜交中使用正確的探針量，探針用量太多會引起背景太深，用量太少則無雜交或雜交很弱（探針濃度：25ng/ml雜交液）,檢測流程,將地高辛標記好的探針系列稀釋，點到一條尼龍膜上，同時用地高辛標記的control DNA作對照標準，120C固定30分鐘； 用地高辛抗體免疫檢測，按BNT/BCIP顯色步驟顯色； 比較顯色結(jié)果，選擇帶有可以接受的背景的最高探針濃度做正式的雜交。,試劑準備（1）,Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution. Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.,試劑準備（2）,Blocking solution :用Maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。封閉膜上非特異性結(jié)合位點 Antibody solution(Ab) solution : 將4#試劑離心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小時。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗體即可）.與地高辛標記的探針結(jié)合。 Color-substrate solution（顯色液）：從試劑5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，現(xiàn)配現(xiàn)用。顯示抗體結(jié)合的位點,Dig-High Prime DNA標記及檢測試劑盒理想條件下標記產(chǎn)量,探針定量,根據(jù)上表探針標記的理想產(chǎn)量將標記的探針稀釋到1ng/l. 例如：起始模板用1g，20l體系1h 后，查前表可知其理想標記量是850ng，則探針的理想標記濃度為850ng/20 l =42.5ng/l; 則取1l標記產(chǎn)物+41.5l H2O 混勻后即得到1ng/l探針稀釋液. 將試劑盒提供的control DNA稀釋到1ng/l (原始濃度是5ng /l),步驟,將上述稀釋的2-9 號管的control DNA 及探針DNA各取1l點膜 120C固定30分鐘或紫外交鏈 將膜放入裝有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室溫2分鐘 將膜放入10ml Blocking solution中室溫溫育30分鐘 將膜放入10ml Antibody solution 中室溫溫育30分鐘 用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分鐘 在10ml Detection buffer 平衡2-5分鐘 將膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動。 當斑點或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相,定量結(jié)果分析,染色至0.1pg的Control DNA出現(xiàn)斑點，比較標記的探針與Control DNA 染色情況計算出地高辛標記的DNA 的量。,如果0.1pg的探針及對照稀釋點都顯色，則探針標記理想 如果0.1pg的對照顯色， 0.1pg的標記探針沒顯色，但0.3pg顯色，則計算探針濃度（約為理想濃度的1/3）以確定雜交時加多少探針（25ng探針/ml雜交液） 如果0.1pg的對照顯色，但標記探針0.3pg的斑點沒顯色，則應(yīng)重新標記探針,探針標記效率低的原因及解決辦法,1. 標記條件不合適,重新標記，但將標記時間延長至過夜 用相同量的模板標記，但體系放大，體系中的其它成分相應(yīng)放大 模板放在沸水中變性,2. 模板不純,只用高純度模板 用推薦的試劑盒準備模板 純化模板：用苯酚/氯仿抽提后用酒精沉淀,DNA 的轉(zhuǎn)移和固定,固定：2 的SSC短暫洗滌膜后 120C 30 min 或80C 2h；或者將膜放在用10 的SSC 浸濕的濾紙中UV-Crosslinkering 不馬上使用的尼龍膜放在2-8 C干燥保存,預(yù)雜交注意事項,預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少雜交背景。 預(yù)雜交及雜交時保證buffer覆蓋膜 如果尼龍膜要多次探測，務(wù)必保證在任何時候都不要讓尼龍膜干燥,雜交液組成,5SSC (NaCl，檸檬酸鈉) 50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4) 5Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA) 2.5mmEDTA （有/無） 100ug/ml SS DNA (鮭精DNA) 0.1%SDS 10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate）,雜交液的準備和雜交溫度的計算,DiG Easy Hyb：將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 C搖動溶解5分鐘 計算雜交溫度：通常為37 C -42 C Tm=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。 Topt.=Tm-20 to 25 C,雜交,預(yù)熱一定體積的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度37-42 C 。 預(yù)雜交30分鐘。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42 C下充分潤濕。（此過程可以延長至數(shù)小時） 變性：Dig標記的探針（約25ng/ml）加50l H2O置沸水浴或98 C干浴鍋中5分鐘后迅速放在冰上冷卻。（不能用堿變性?。?將變性的探針加入預(yù)熱的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫。 倒出預(yù)雜交液，加入探針和DIG Easy Hyb混合液。 繼續(xù)在42 C下雜交6h 至過夜（單拷貝探針）。,備注：,含有探針的DiG Easy Hyb雜交液可重復(fù)利用，雜交結(jié)束后放入離心管中于-20 C保存，可重復(fù)使用幾次，只需在使用前于68 C處理10分鐘即可 不要煮沸DiG Easy Hyb雜交液,雜交時注意事項,使用正確的雜交溫度（使用DIG EasyHyb，DNA：DNA3742C，RNA：RNA 68C，RNA：DNA 50C） 為防止尼龍膜干燥，在準備好下一步處理用試劑之前不要倒掉正在用的溶液 使用合適的探針濃度 探針用之前68C 變性,洗膜,2SSC，0.1%SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。 0.5SSC，0.1%SDS 65-68溫和搖動15分鐘，洗2次。,雜交后洗膜時注意事項,如果探針與靶DNA 的同源性低于80%，熱洗時應(yīng)使用較低的溫度（如60C） 熱洗之前應(yīng)將洗膜液預(yù)熱到熱洗所需溫度,免疫檢測,試劑準備同探針標記效率測定 所有反應(yīng)在15-25C進行并輕輕搖動， 如果膜需再次使用，任何時候都不要讓膜干燥,試劑準備（1）,Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25 stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20)0 15-25 stable. Dilution of Blocking solution. Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20). 15-25 stable. Ajustment of pH to 9.5. TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25 stable. Stopping color reaction.,試劑準備（2）,Blocking solution :用Maleic acid buffer 10稀釋試劑6#（10Blocking solution ），成1的工作液，即每9ml 1Maleic acid buffer中加入1ml 10Blocking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。封閉膜上非特異性結(jié)合位點 Antibody solution(Ab) solution : 將4#試劑(Anti-Digoxigenin-AP Conjugate)離心，按1：5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 C可放12小時。（每10ml 1Blocking solution 加1ul Ab抗體即可）.與地高辛標記的探針結(jié)合。 Color-substrate solution（顯色液）：從試劑5#(NBT/BCIP)中取100ul到5ml Detection buffer，要避光，現(xiàn)配現(xiàn)用。顯示