藥臨床前毒理學(xué)評價(jià).pptVIP

第二軍醫(yī)大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心 陸國才,新藥臨床前毒理學(xué)評價(jià) Preclinical Toxicological Evaluation of New Drug,Contents,目的意義 急性毒性試驗(yàn)(acute) 長期毒性試驗(yàn)(chronic) 特殊毒性試驗(yàn)(遺傳、生殖、致癌) 其它毒性試驗(yàn)(過敏、刺激 etc.) 藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP） SFDA新藥審評會(huì) 案例學(xué)習(xí),Acute Toxicity Test,概念、目的意義 傳統(tǒng)方法基本內(nèi)容和要求 有關(guān)問題 其它實(shí)驗(yàn)方法,Concept,動(dòng)物單次或24h內(nèi)多次給予受試物后，一定時(shí)間內(nèi)(14天)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng) 毒理研究早期階段進(jìn)行,目的意義(DO STAR),毒性劑量 Toxic Dose 安全劑量范圍 Safety margin 毒性反應(yīng) Toxic reaction: 性質(zhì)、程度、量 毒關(guān)系、產(chǎn)生、達(dá)峰、持續(xù)時(shí)間及反復(fù)產(chǎn)生 毒性反應(yīng)時(shí)間、遲發(fā)性、蓄積性、耐受性 尋找毒性反應(yīng)靶器官 Target Organ 毒性反應(yīng)是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 確保臨床用藥安全(重點(diǎn)監(jiān)測指標(biāo)),目的意義,闡明藥物毒性作用及強(qiáng)度、計(jì)算相對毒性參數(shù) 了解毒性靶器官 為長毒、特殊毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì) 為期臨床試驗(yàn)起始劑量選擇 為臨床毒副反應(yīng)監(jiān)護(hù)提供參考 其它 (DO STAR),OECD口服急性毒性分級,相對毒性參數(shù),治療指數(shù)TI =LD50/ED50 安全系數(shù)SF=LD5/ED95 可靠或確實(shí)安全系數(shù)CSF =LD1/ED99 安全范圍SM=(LD1/ED99-1) X 100% SED50/ED50, 越大越安全 LD5基本無害量 ED95基本有效量 LD1肯定無害量 ED99肯定有效量,為臨床毒副反 應(yīng)監(jiān)護(hù)提供參考,中毒癥狀,起始、持續(xù)、恢復(fù)時(shí)間 中毒靶器官 對抗試驗(yàn)為臨床急救提供依據(jù),為長毒等試驗(yàn)選 擇劑量提供依據(jù),長期毒性劑量設(shè)計(jì) LD50法 (1/10, 1/50, 1/100) MTD法 ( 1, 1/3, 1/10) 生殖毒性試驗(yàn)高劑量為母鼠MTD 主要藥效學(xué)劑量限度、一般藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)劑量設(shè)計(jì)也要參考急性毒性的LD50,為特殊毒性試驗(yàn) 選擇劑量提供依據(jù),致突變試驗(yàn) 嚙齒類動(dòng)物微核試驗(yàn)高劑量為1/2 LD50 果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)的高、低劑量分別為1/2 LD50和1/4 LD50 精原細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)高劑量=1/2 LD50 短期致癌試驗(yàn)高劑量=MTD,I 期臨床選擇起 始劑量提供參考,細(xì)胞毒類抗癌藥，I期臨床起始劑量= 1/10 LD50,其 它,系列化合物的合格率分析(除理化性質(zhì)為主外)也參考LD50 復(fù)方藥物的相互作用, 也可通過拆方及合用的LD50來判別相互作用性質(zhì) 比較不同途徑的LD50，獲得一些生物利用度信息，為劑型開發(fā)提供參考,基本原則,執(zhí)行GLP 整體性 具體問題具體分析 階段性 隨機(jī)、對照、重復(fù) 方法公認(rèn),動(dòng) 物,獲得盡量多信息前提下，使用盡量少動(dòng)物 嚙齒類-小鼠或大鼠 非嚙齒類-犬或猴 二種動(dòng)物(嚙齒類及非嚙齒類) 小鼠18-22g; 大鼠120-150g; 犬用成年犬 初始體重不應(yīng)超過或低于平均體重的20% 各半 (勤儉辦事，服從命令),受 試 物,工藝穩(wěn)定、符合臨床用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，附質(zhì)檢報(bào)告 輔料、溶劑、試劑等應(yīng)標(biāo)明批號、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，符合試驗(yàn)要求,受 試 物,原料藥 臨床擬用劑型 復(fù)方制劑：復(fù)方 + 拆方 (增毒？新毒？) 易降解：含降解產(chǎn)物量最高的受試物進(jìn)行急毒試驗(yàn)，并與臨床樣品的急毒試驗(yàn)結(jié)果比較,給藥途徑,臨床擬用途徑 + 原型藥物較完全進(jìn)入循環(huán)途徑（如靜脈注射） 嚙齒類ig給藥前應(yīng)禁食12h，不禁水,劑量和分組,給藥劑量：未見毒性量嚴(yán)重毒性量 設(shè)空白和/或溶媒（輔料）對照 小動(dòng)物4-6個(gè)劑量組, 組距0.65-0.85,求LD50 大動(dòng)物可用50%等量遞升法(近似致死劑量法), 求出ALD和MTD，不必達(dá)到致死量,給藥容積,不等濃度等容量給藥 常規(guī)及最大給藥容量為:,觀察指標(biāo)及時(shí)間,藥后4h內(nèi)詳觀, 后每天上下午各一,觀察14d 記錄毒性反應(yīng)、死亡情況, 中毒癥狀、發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、嚴(yán)重程度、恢復(fù)期及動(dòng)物最短、最長死亡時(shí)間 其它指標(biāo)：一般指標(biāo)、體重變化等,急性毒性研究的一般觀察和指征,病理學(xué)檢查,大體解剖(瀕死動(dòng)物+死亡動(dòng)物+存活動(dòng)物) 組織病理學(xué)檢查: 體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí),結(jié)果處理,實(shí)驗(yàn)資料用Bliss法計(jì)算LD50。必要時(shí)求不同性別LD50 表. XXX急性毒性結(jié)果及LD50計(jì)算 劑 量 對數(shù)劑量 動(dòng)物數(shù) 死亡動(dòng)物數(shù) 死亡率 機(jī)率單位 LD50及可信限 (mg/kg) (X) (只) (只) % (Y) (mg/kg),結(jié)果處理,劑量反應(yīng)、時(shí)間反應(yīng)關(guān)系 反應(yīng)可能涉及組織、器官或系統(tǒng) 肉眼病變和組織病檢，初步判斷毒性靶器官 病檢報(bào)告應(yīng)附：病檢者簽名+單位蓋章+病理照片,確定NOAEL、 MTD、ALD etc，初步判斷受試物的安全范圍,綜合評價(jià),判斷反應(yīng)與藥物作用相關(guān)性： 時(shí)間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系 動(dòng)物種屬及背景數(shù)據(jù) 病理學(xué)檢查結(jié)果 同類藥物特點(diǎn) 安全范圍、毒性嚴(yán)重程度及可恢復(fù)性 毒性作用靶器官 毒性可能涉及部位 大體解剖和組織病理學(xué)檢查結(jié)果,注意問題,光化學(xué)治療藥和輻射增敏劑急毒試驗(yàn) 照光 + 不照光分別測定LD50 復(fù)方(a+b)中各組分毒性相互作用評價(jià),注意問題,充分重視預(yù)試 毒理學(xué)界對LD50看法 試驗(yàn)結(jié)果（信息）的一部分 LD50測定不足： 動(dòng)物消耗量大 獲得信息有限 測得數(shù)值不準(zhǔn),EPA Policies,Discourages the use of the Classical LD50 test Uses Structurally Related Activities (SRA) to obviate the need for testing on animals Recommends the Limit test,EPA Policies,Beyond the Limit, recommends approximate lethal dose the up-and-down methods,近似致死劑量法(非嚙齒類動(dòng)物),6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估計(jì)可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50%遞增法，設(shè)計(jì)出劑量序列表,First,最低致死劑量,最高非致死劑量,最低致死劑量,最高非致死劑量,OR,近似致死 劑量范圍,近似致死 劑量范圍,Second,MTD法,最大允許濃度和最大允許容積仍未測出LD50, 可只求MTD值 一次或24h多次(總量5g/kg)給20只動(dòng)物 觀察14d, 未見死亡, 則MTD XX g/kg; 個(gè)別死亡, 則寫成LD50 XX g/kg iv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20s ig時(shí)空腹, 即禁食12-16h左右,常用容量和最大容量(ml), 最大無毒性反應(yīng)劑量（no observed adverse effect level, NOAEL) ： 指受試物在一定時(shí)間內(nèi)，按一定方式與機(jī)體接觸，用靈敏的現(xiàn)代檢測方法和觀察指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)損害作用的最高劑量 最小毒性反應(yīng)劑量： 動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的最小劑量 最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）： 不引起受試動(dòng)物死亡的最高劑量 最小致死劑量（minimal lethal dose，MLD）： 引起個(gè)別受試動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量 半數(shù)致死量（median lethal dose, LD50）： 在一定試驗(yàn)條件下引起50%受試動(dòng)物死亡的劑量。,長 期 毒 性 試 驗(yàn) Long-term Toxicity Study,目的意義 基本內(nèi)容和要求 有關(guān)問題 Mechanic? Innovative ?,目的意義(DO STAR),毒性劑量 Toxic Dose 安全劑量范圍 Safety margin 毒性反應(yīng) Toxic reaction: 性質(zhì)、程度、量 毒關(guān)系、產(chǎn)生、達(dá)峰、持續(xù)時(shí)間及反復(fù)產(chǎn)生 毒性反應(yīng)時(shí)間、遲發(fā)性、蓄積性、耐受性 尋找毒性反應(yīng)靶器官 Target Organ 毒性反應(yīng)是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 確保臨床用藥安全(重點(diǎn)監(jiān)測指標(biāo)),基本原則,執(zhí)行GLP 整體性 具體問題具體分析 階段性 隨機(jī)、對照、重復(fù) 方法公認(rèn),Procedure,Animals Housing Drug Route Dosage Group Duration Index Recovery Time Report （動(dòng)飼藥徑劑組 周指恢時(shí)報(bào)告）,Animal,in vitro體系篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬或品系 理想動(dòng)物 對受試物生物轉(zhuǎn)化與人體相近 對受試物敏感 已有大量歷史對照數(shù)據(jù),Animals,rodent non-rodent rat beagle dog mouse monkey,Animal,二種動(dòng)物，嚙齒類首選大鼠，非嚙齒類用Beagle犬, 必要時(shí)用猴、豬等 符合等級要求 來源、品系、遺傳背景清楚，有動(dòng)物質(zhì)量合格證 大鼠6-9 w， Beagle犬6-12 m,體重CV20 各半 必要時(shí)，可用疾病模型動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn) Duration 6m, natural death ( rat: 1y-15%, 1.5y-50%, 2y-70-80%) (勤儉辦事，服從命令）,XXX 體外代謝種屬比較研究,結(jié)合體內(nèi)動(dòng)物藥代結(jié)果用大鼠和猴進(jìn)行安評,動(dòng)物選擇,XXXX西地那非,已上市藥枸櫞酸鈉西地那非改酸根（化4） PDE5抑制劑，治療男性ED 選用雄性動(dòng)物進(jìn)行下列試驗(yàn) 急性毒性（大鼠、小鼠） 安全藥理學(xué)（小鼠、犬） 須與已上市藥物進(jìn)行對比 （已上市藥需國外進(jìn)口或買不到時(shí)？）,動(dòng)物選擇,治療HER2陽性乳腺癌藥物,治療婦女HER2陽性乳腺癌 用雌性動(dòng)物進(jìn)行一般毒理學(xué)研究 廠家要求選用雌雄各半動(dòng)物，何故？,動(dòng)物選擇,Housing,T, humidity, light, ventilation, animal feeds Rat: 5 /cage or separated， acclimation 1w Dog: TB test, anthelmintic acclimation: 1-2w / 1m,飼養(yǎng)管理,Drug,test article / solvent / excipient name, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion,Route,與臨床用藥途徑一致 臨床iv , 大鼠給藥1月，ip代替 im或sc應(yīng)變換注射部位 必要時(shí)改變給藥途徑但應(yīng)說明原因,模擬臨床給藥途徑,纖維蛋白膠：犬腹腔給藥 小兒止瀉貼劑：相當(dāng)于臍部給藥,途徑方式,Dose and Group,三個(gè)給藥組, 單位：mg (IU)/kg 或 mg (IU)/m2 不等濃度等容量給藥 低劑量組高于有效劑量，不出現(xiàn)毒性 中劑量組輕微或中等度毒性 高劑量組明顯/嚴(yán)重毒性，或個(gè)別動(dòng)物死亡 空白對照溶媒或賦形劑 溶媒或賦形劑有毒性時(shí)則增加正常對照組 陽性對照,Dose and Group,大鼠各15只/組 大動(dòng)物各5只/組,特例：等濃度不等容量給藥,白蛋白：療效與蛋白濃度有關(guān) 紫杉醇脂肪乳：乳劑的比例影響紫杉醇安全性,途徑方式,Correspond duration of clinical ad. with animal ad.,注：表中給藥期限均為最短給藥期限，不包括恢復(fù)期，均為完整試驗(yàn),Index-Clinical Examinations,rodent non-rodent signs of ill health +pupil , T behavioral changes breath, sialosis reaction to treatment vomiting Dead or moribund animal: necropsy within 1h,Index-Hematology,受試物對造血系統(tǒng)有影響，應(yīng)重視骨髓檢查,Index-Clinical Chemistry,Index-Urinalysis,Index-Pathology稱重并計(jì)算系數(shù),calculate organ weights relative to body weight , paired organs weigh together,Index-Pathology病檢臟器組織,Index-Pathology病檢臟器組織,Index-Pathology,heart liver spleen lung kidney brain adrenals pancreas stomach duodenum jejunum ileum colon cecum（盲） pituitary thymus spinal cord prostate testes epididymides uterus ovaries optic nerve injection site bone and marrow urinary bladder lymph nodes(mesenteric, local) thyroid & parathyroid lobes,臟器取材樣式（SOP),肺臟,腦,01,肝臟,02,03,04,05,腎臟,膀胱,心臟,肺,06,脾臟 胸腺,07,甲狀腺,08,氣管,09,腦垂體,10,胃,切片中組織排列和方向,IndexECG, Eye,大動(dòng)物長期毒性必須做 ECG觀察指標(biāo)：心率、P波電壓、P-R間期、R波電壓、QRS時(shí)間、ST段、T波電壓和Q-T間期,Recovery,Observation : 1/31/2 animal, 26w Late toxic reaction and reversibility Items : same as treatment period,測試次數(shù),能反映動(dòng)態(tài)變化 一般行為、食量每天觀察記錄 大鼠體重每周一次 大動(dòng)物生理指標(biāo)每半月一次 大動(dòng)物ECG 導(dǎo)聯(lián)，給藥前、給藥期間、停藥及恢復(fù)期均要檢測 發(fā)現(xiàn)有陽性指標(biāo)應(yīng)加大觀察密度,Observations,Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6m(rat) 9m(dog) Toxic reaction: properties, degree, dose-toxicity relationship, initiating time，peak time, lasted time, late reaction toxicity, accumulating toxi-city, tolerance,Frequency of lab. investigations,rat=3m rat 6m Non-rodent last ad. interim twice pretreatment recovery end last ad. once every 1-3 m recovery end last ad. recovery end,資料整理,首頁 試驗(yàn)指導(dǎo)者、課題負(fù)責(zé)人、病理學(xué)檢查、血液生化指標(biāo)測定、血液學(xué)指標(biāo)測定及給藥觀察者 SD申明 QA申明 摘要 正文 合理的統(tǒng)計(jì)圖、表 有差異的指標(biāo)應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)標(biāo)示,Problems,Pretest Animal & Housing Route Dose Duration Observation Index Toxicokinetcs Data handling Archives,Pretest,What depend on? Overseas pre-clinical / clinical data Acute toxicity , pharmacodynamics and pharmacokinetics or intended clinical dose How long? 2w - 1m Biological product: antibody?,Dose,LD50 MTD MBS ACD 3m 6m 1/10 1 10Cmax 50100 30 50 1/50 1/3 5Cmax 3050 1525 1/100 1/10 Cmax 1020 510 half for dog and monkey,常用動(dòng)物等效劑量折算表,Dose,高劑量原則上應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生明顯毒性 低毒性藥物高劑量的選擇： 問題: 臨床擬用劑量可靠嗎？ 高劑量與臨床劑量的比值？ 與動(dòng)物有效劑量的比值? 辦法: 是否線性動(dòng)力學(xué)？ 藥物完全吸收了嗎？-毒代動(dòng)力學(xué)證據(jù) 是否達(dá)最大給藥濃度和體積(限制性因素)?,劑量設(shè)計(jì),依據(jù)充分 指導(dǎo)原則 文獻(xiàn)資料 官方資料 設(shè)計(jì)合理 藥效劑量 藥代數(shù)據(jù) 種屬差異 作用機(jī)制 預(yù)試結(jié)果,特例：犬的劑量高于大鼠,大鼠：10、30、 60 mg/kg (iv 60天) 30、60 mg/kg給藥后尖叫，體重下降 膽紅素，血糖，局部刺激 犬： 25、50、100 mg/kg (靜滴60天) 50、100 mg/kg給藥后動(dòng)物流涎、皮膚潮紅 膽紅素，血糖，局部刺激,劑量設(shè)計(jì),大鼠雌雄劑量不同,雄大鼠：20、60、120 mg/kg (ig 30天) 雌大鼠：10、30、 60 mg/kg (ig 30天),雄大鼠對該藥的生物利用度為雌大鼠的一半，故給藥劑量加倍,劑量設(shè)計(jì),分 組,分別隨機(jī)分組 開始實(shí)驗(yàn)時(shí)體重CV20 大動(dòng)物：給藥前生理生化指標(biāo)過高或過低的去掉,Index,Possible Toxic Reactions pharmaco- chemical pretesting published logical effcts structure results data,Index-hematology & chemistry,Reticulocyte count AST ALP BUN Alb,Index-pathology,Tissue: free of fat half rationed： no changes(-) 0, suspected () 0.5，mild(+) 1， median(+) 2， severe (+) 3 Local inflammation, WBC infiltration, local bleeding , haemostasis, suspected cell degeneration self-infected, sacrifice induced,指標(biāo)增加,PEG化EPO（化學(xué)1.1） +免疫源性（抗體及其性質(zhì)） +免疫毒性細(xì)胞及體液免疫：IgG、IgM、C3、C4、CIC、T淋巴細(xì)胞分型（CD4+、CD8+)，IL-6,INF-等）,指標(biāo)檢測,測試方法,簡 便 快 速 靈 敏 準(zhǔn) 確 公 認(rèn),Toxicokinetics,毒性劑量系統(tǒng)暴露的代謝動(dòng)力學(xué) 可以描述系統(tǒng)暴露與暴露劑量、暴露時(shí)間和毒理學(xué)結(jié)果之間關(guān)系 目的在于解釋長期毒性試驗(yàn)結(jié)果,Toxicokinetics,合適采樣點(diǎn)，獲得AUC、Cmax、Tmax等參數(shù) 結(jié)合藥物血漿蛋白結(jié)合率評價(jià)系統(tǒng)暴露量 長毒試驗(yàn)各劑量全部或部分動(dòng)物，以估算高劑量藥物的動(dòng)力學(xué)過程是否屬非線性 鼓勵(lì)創(chuàng)新藥物進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究,Data Handling,Ration data: xs, international unit vs control and dosage group, vs d0 Statistics: t test or F test，Ridit analysis,資料整理,raw data, documentation, records, protocol (and amendments thereto) specimens, reserve samples control article final report(signed) 原始資料應(yīng)保存完好，我國規(guī)定原始資料至少保存至生產(chǎn)后5年,均值和單個(gè)數(shù)據(jù),Rodent：組均值單個(gè)動(dòng)物，背景數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可參考 Non-rodent：數(shù)量少、個(gè)體差異大，單個(gè)動(dòng)物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有重要毒理學(xué)意義。須與給藥前、對照組和背景數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)參考價(jià)值有限,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并不一定有生物學(xué)意義 判斷因素 數(shù)據(jù)變化劑量反應(yīng)關(guān)系 其他相關(guān)參數(shù)改變 與歷史背景數(shù)據(jù)比較 異常數(shù)據(jù)合理解釋,正確判斷毒性反應(yīng),給藥組和對照組之間差異來源 與受試物有關(guān)的毒性反應(yīng) 動(dòng)物對藥物適應(yīng)性改變 正常生理波動(dòng) 判斷關(guān)注 劑量反應(yīng)關(guān)系 參數(shù)變化幅度和性別差異 分析毒理學(xué)變化參數(shù)關(guān)聯(lián)和機(jī)制 單個(gè)參數(shù)變化判斷應(yīng)慎重 結(jié)合TK,毒性反應(yīng)對于臨床試驗(yàn)意義,種屬差異 無關(guān)毒性：高劑量，非線性動(dòng)力學(xué)代謝 特異反應(yīng) 難以檢測：頭痛、頭昏、頭暈、腹脹、皮膚搔癢、視物模糊 疑毒從有,機(jī)制研究（探索藥理/毒理信號通路）,鑒別新分子實(shí)體是否有新的藥理/毒理作用機(jī)制，加深對藥物的認(rèn)識 與已有類似藥物作用比較，判斷是否屬于新作用機(jī)制 采用多種先進(jìn)的生理、生化和分子生物學(xué)方法和技術(shù)對機(jī)制進(jìn)行多層次研究,例：1971年美國頒布國家癌癥法以來，前列腺癌、肝癌、胰腺癌等發(fā)病率和/或死亡率沒有明顯改變,Pfizer研發(fā)CETP抑制劑損失8億$,Torcetrapib的副作用源自脫靶效應(yīng),輝瑞公司ILLUMINATE試驗(yàn)詳細(xì)數(shù)據(jù)表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脫靶效應(yīng) 動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)切除腎上腺，可以阻斷torcetrapib的升壓效應(yīng)，驗(yàn)證了醛固酮所起的作用 美國轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)的主席Bruce Littman指出，torcetrapib事件另一個(gè)教訓(xùn)是，當(dāng)涉及到黑箱機(jī)制時(shí)，尤其是與安全性有關(guān)的問題時(shí)，一定不要把所觀察到的問題僅僅作為風(fēng)險(xiǎn)那么簡單,Nat Rev Dr