實(shí)驗(yàn)4細(xì)菌革蘭氏染色法.ppt

Central Laboratory of Biology,實(shí)驗(yàn)四 油鏡的使用及細(xì)菌革蘭氏染色法,微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),課前提問與目的要求,【課前提問】,1.油鏡的特點(diǎn)及使用范圍是什么？ 2.革蘭氏染色的原理是什么？,【目的要求】,1. 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法； 2. 了解革蘭氏染色原理； 3. 學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。,【基本原理】,1. 油鏡提高分辨率 油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間是隔一層油質(zhì)。如香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。 光線通過不減低視野的照明度； 更主要能增加數(shù)值孔徑，提高顯微鏡的放大效能。 分辨率=/2NA =光波波 （物鏡的數(shù)值孔徑值）NA=nsin =鏡口角的半數(shù) 可知n（介質(zhì)折射率）對(duì)提高顯微鏡的分辯力起著關(guān)鍵性的作用。,2. 革蘭氏染色 革蘭氏染色法可將細(xì)菌分成革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）兩種類型，細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。 首先利用草酸銨結(jié)晶紫初染，所有細(xì)菌都會(huì)著上結(jié)晶紫的藍(lán)紫色。然后利用盧戈氏碘液作為媒染劑處理，由于碘與結(jié)晶紫形成碘-結(jié)晶紫復(fù)合物，增強(qiáng)了染料在菌體中的滯留能力。之后用95%乙醇作為脫色劑進(jìn)行處理時(shí)，兩種細(xì)菌的脫色效果不同。,【基本原理】,革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂質(zhì)含量低，肽聚糖本身并不結(jié)合染料，但其所具有的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)可以滯留碘-結(jié)晶紫復(fù)合物，現(xiàn)在一般認(rèn)為乙醇處理可以使肽聚糖網(wǎng)孔收縮而使碘-結(jié)晶紫復(fù)合物滯留在細(xì)胞壁，菌體保持原有的藍(lán)紫色。 而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖含量低，交聯(lián)度低，壁薄且脂質(zhì)含量高，乙醇處理時(shí)脂質(zhì)溶解，細(xì)胞壁通透性增加，原先滯留在細(xì)胞壁中的碘-結(jié)晶紫復(fù)合物容易被洗脫下來，菌體變?yōu)闊o色，用復(fù)染劑（如番紅）染色后又變?yōu)閺?fù)染劑顏色（紅）。,【基本原理】,圖4-1 革蘭氏陽性菌和陰性菌細(xì)胞壁比較,【實(shí)驗(yàn)用品】,菌種：大腸桿菌16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。 試劑：革蘭氏染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番紅復(fù)染液等。 儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架，鑷子，載玻片夾子，載玻片支架，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。,【方法步驟】,1. 涂片：將大腸桿菌（16h）和金黃色葡萄球菌（16h）分別涂片、干燥、固定。 2. 染色： 1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴（以剛好將菌膜覆蓋為宜），染色12min后傾去染液，水洗至流出水無色； 2）媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min，傾去碘液，水洗至流出水無色。 3）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水（從邊緣吸，以防擦去菌體），將玻片傾斜，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約2030秒，立即用水沖去乙醇；,【方法步驟】,4）復(fù)染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復(fù)染液染色2min，水洗，吸去殘水晾干（圖4-1）。 3.鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 4.混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對(duì)比觀察。菌齡和脫色程度對(duì)染色結(jié)果影響較大。,【方法步驟】,A. 初染 B. 水洗 C. 媒染 D. 水洗 E. 脫色 F. 水洗 G. 復(fù)染 H. 水洗 I. 吸干 圖4-1 革蘭氏染色程序,【方法步驟】,獲得本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵： 1）選用活躍生長(zhǎng)期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細(xì)菌會(huì)被染成紅色而造成假陰性。 2）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。 3）脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】,圖4-2 大腸桿菌染色結(jié)果 圖4-3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合染色結(jié)果,【注意事項(xiàng)】,涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。 加熱時(shí)使用載玻片夾子及試管夾，以免燙傷。 使用染料時(shí)注意避免沾到衣物上。 使用乙醇脫色時(shí)勿靠近火焰。 實(shí)驗(yàn)后洗手。,【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】,1. 結(jié)果 1）繪出油鏡下觀察的混合區(qū)菌體圖像。 2）填表,表4-1 結(jié)果記錄表,2. 思考題 1）革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？ 2）現(xiàn)有一株未知桿菌，個(gè)體明顯大于大腸桿菌，請(qǐng)你鑒定該菌是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性，如何確定你染色結(jié)果的正確性？ 3）為什么用老齡菌進(jìn)行革蘭氏染色會(huì)造成假陰性？ 4）你認(rèn)為革蘭氏染色