沒食子酸納米硒抗氧化性的測(cè)定

本科畢業(yè)論文 題目： 沒食子酸納米硒抗氧化性的測(cè)定 學(xué) 院： 食品科學(xué)與工程學(xué)院 姓 名： 何利強(qiáng) 學(xué) 號(hào)： 20134716 專 業(yè)： 食品質(zhì)量與安全 年 級(jí)： 食安1301 指導(dǎo)教師： 楊麗聰 職稱：講師 二00一七 年 五 月沒食子酸納米硒抗氧化性的測(cè)定目 錄摘 要IAbstractII引 言III1 材料與方法- 1 -1.1 實(shí)驗(yàn)材料- 1 -1.1.1 主要原料- 1 -1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑- 1 -1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備- 1 -1.1.4 試劑的配置- 2 -1.2 實(shí)驗(yàn)方法- 2 -1.2.1 清除羥基自由基的測(cè)定- 2 -1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理- 2 -1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟9-11- 2 -1.2.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定- 3 -1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理- 3 -1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟12-13- 3 -1.2.3 還原力的測(cè)定- 3 -1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理- 3 -1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟14-15- 4 -2 結(jié)果與分析- 4 -2.1 GASeNPs對(duì)體外羥基自由基的清除率分析- 4 -2.2 GASeNPs對(duì)體外ABTS+自由基清除率分析- 5 -2.3 GASeNPs的總還原力測(cè)定分析- 5 -3 小結(jié)與討論- 6 -參 考 文 獻(xiàn)- 7 -致 謝- 8 -摘 要 本文通過采用分光光度法對(duì)沒食子酸納米硒（GASeNPs）體外清除羥基自由基、ABTS+自由基和還原力進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)其抗氧化性。結(jié)果表明，與沒食子酸（Gallic acid,GA）、維生素C(Vc)相比，100-300 g/mL的GASeNPs對(duì)羥基自由基的清除率為49.90%-96.86%，其清除率高于同等濃度下的Vc及GA；5-25 g/mL的GASeNPs對(duì)ABTS+自由基的清除率47.02%-97.57%，其清除率高于同等濃度下的Vc及GA；20-100 g/mL的GASeNPs對(duì)還原力的測(cè)定吸光度為0.362-0.911，在同等濃度下其還原力大于Vc，略低于GA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GASeNPs具有較強(qiáng)的抗氧化活性。關(guān)鍵詞：沒食子酸納米硒；抗氧化；自由基；清除率；還原力 AbstractIn this paper, the antioxidation of GASeNPs to hydroxyl free radicals, ABTS+ free radicals and reductive forces in vitro was determined by spectrophotometry with the Spectrophotometric method. The results showed that compared with Gallic acid (Gallic acid,GA) and Vitamin C(Vc), 100-300 g/mL GASeNPs to hydroxyl radical scavenging rate of 49.90%-96.86%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA; 5-25 g/mLGASeNPs to ABTS+ free radicals scavenging rate 47.02%-97.57%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA. The GASeNPs of 20-100 g/mL to the determination of reducing power absorbancy is 0.362-0.911, in the same concentration its reducing power is greater than Vc, slightly lower than GA. The experimental results show that GASeNPs has strong antioxidant.Key words:gallic acid modified selenium nanoparticles; anti-oxidant; free radical; scavenging rate; reducing powerI引 言沒食子酸(Gallic acid,GA),化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸,是一種天然的多酚類化物,廣泛存在于中草藥和水果類植物中,包括葉下珠、五倍子、余甘子、葡萄、甜茶、報(bào)春黃甙葉等提取物1。沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗腫瘤、抗自由基等多種生物活性,在食品、生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用2-3。硒是動(dòng)物和人體健康生長發(fā)育所必需的微量元素4。納米硒是納米級(jí)的單質(zhì)硒5。硒的缺乏還會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，造成對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，進(jìn)而干擾各類激素、生長因子和細(xì)胞活性素在體內(nèi)執(zhí)行的各項(xiàng)功能6。長期以來，關(guān)于硒的報(bào)道主要集中在納米硒源和無機(jī)硒源作用比較和劑量確定上，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了納米硒比無機(jī)硒毒性作用低，生物轉(zhuǎn)化率高7。GASeNPs 具有較好的穩(wěn)定性，然而對(duì)GASeNPs 的抗氧化能力的評(píng)價(jià)還未見報(bào)道，對(duì)此本文選用GASeNPs作為研究對(duì)象，特別針對(duì)其體外其體外對(duì)各種自由基 (羥基自由基、ABTS+自由基及還原力的測(cè)定)的清除效果進(jìn)行考察，并與Vc 這個(gè)公認(rèn)的自由基清除劑和GA做對(duì)比研究，評(píng)估GASeNPs的抗氧化能力，以期為GASeNPs抗氧化作用在食品保鮮、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域提供理論依據(jù)。IV1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 主要原料GASe溶膠的制備參考已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行GASe的合成制備8。稱取0.19 g沒食子酸至250 mL燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用蒸餾水定容，配成0.01 mol/L的沒食子酸儲(chǔ)備液。稱取0.17 g亞硒酸鈉至50 mL燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶并用蒸餾水定容，配成0.1 mol/L的亞硒酸鈉儲(chǔ)備液。然后在25 mL燒杯中按1：6的濃度加入Na2SeO3與沒食子酸，利用鹽酸將pH調(diào)至3.0后，加熱揮干后得到橙紅色固相樣品。將此樣品加蒸餾水溶解，在透析袋中過夜透析除去未反應(yīng)的沒食子酸后，定容于10 mL容量瓶中得到GASe溶膠。 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑綠礬分析純天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心水楊酸分析純天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心磷酸氫二鈉十二結(jié)合水分析純天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心雙氧水分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠無水乙醇分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠磷酸二氫鈉二結(jié)合水分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠鐵氰化鉀分析純天津市福晨化學(xué)試劑廠三氯乙酸分析純天津市福晨化學(xué)試劑廠過硫酸鉀分析純阿拉丁試劑（中國）有限公司ABTS分析純上海源葉生物科技有限公司三氯化鐵分析純西隴化工股份有限公司1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備電子分析天平奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司移液槍Genex BetaCL3型恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司石英比色皿宜興市偉鑫儀器有限公司低速大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠可見分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱常州國華電器有限公司超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司1.1.4 試劑的配置6 mol/L綠礬（FeSO4.7H2O):稱取0.17 g綠礬溶于燒杯中，并用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中搖勻。 6 mol/L雙氧水(H2O2):稱取0.07 g30%的雙氧水用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中搖勻。 6 mol/L水楊酸(C7H6O3)：稱取0.08 g水楊酸用無水乙醇溶解于燒杯中，并用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中。 1 mg/mL過硫酸鉀：稱取0.10 g過硫酸鉀于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。 80%的乙醇：取40 mL無水乙醇加入到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。ABTS工作液：精密稱取40 mgABTS，加入1 mg/mL的過硫酸鉀溶液8 mL，密封后避光靜置反應(yīng)16 h，定量轉(zhuǎn)移到250 ml的容量瓶中，加入32 mL蒸餾水，用無水乙醇定容至刻度，放置10 h后使用。0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）：甲液（磷酸氫二鈉十二結(jié)合水），稱取7.16 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中；乙液（磷酸二氫鈉二結(jié)合水），稱取3.12 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。取40 mL甲液，60 mL乙液混合，即配置成所需的0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液。1%鐵氰化鉀:稱取1 g鐵氰化鉀溶于燒杯中，加蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。0.1%三氯化鐵:稱取0.10 g的三氯化鐵溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。10%三氯乙酸:稱取10 g三氯乙酸溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 清除羥基自由基的測(cè)定1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)Fenton方法產(chǎn)生OH自由基的模型，H2O2與亞鐵離子反應(yīng)生成OH自由基,該反應(yīng)為：H2O2+Fe2+OH+OH+Fe3+自由基一般存活時(shí)間比較短而且具有較高活性的特點(diǎn)，而水楊酸能有效地捕捉羥基自由基且產(chǎn)生有色產(chǎn)物，因此，若在該體系加入一定量的水楊酸，將發(fā)生顏色反應(yīng)。生成的有色產(chǎn)物在510 nm處被較強(qiáng)地吸收。1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟9-11 （1）各取1 mL的0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的樣品溶液于5支離心管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，6 mol/L H2O21 mL，混勻后靜置10 min，再加入6 mol/L水楊酸溶液1 mL混勻后靜置30 min，然后于510 nm處測(cè)其吸光度值A(chǔ)i。在其他處理不變的情況下，以1 mL蒸餾水代替水楊酸測(cè)吸光度Aj，空白對(duì)照組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液測(cè)吸光度A0。羥基自由基的清除率計(jì)算公式：E=(A0Ai+Aj)/A0 （2）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，羥自由基清除率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。1.2.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理ABTS法是使用最廣泛的間接檢測(cè)方法，可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中，在734 nm處有最大吸收。被測(cè)物質(zhì)加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在ABTS+的最大吸收波長（一般選擇734 nm）檢測(cè)吸光度的變化。1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟12-13 （1）各取0.50 mL的0.005 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL的樣品溶液于5支離心管中，用80%乙醇補(bǔ)至2 mL，再加入2 mLABTS+工作液，搖勻，避光反應(yīng)6 min，然后在734 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)i，在其他處理不變的情況下，以80%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，測(cè)吸光度A0。計(jì)算提取液對(duì)ABTS+自由基清除率:W=(A0Ai)/A0 （2）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。1.2.3 還原力的測(cè)定1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理 K3Fe(CN)6 (赤血鹽）+樣品K4Fe(CN)6(黃血鹽）+樣品氧化物 K4Fe(CN)6+Fe3+Fe4Fe(CN)63（普魯士藍(lán)）普魯士藍(lán)為沉淀，700 nm是普魯士藍(lán)的最大吸收，在波長700 nm處測(cè)吸光度Ai，Ai越大，還原力越大。1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟14-15 （1）各取1 mL的0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的樣品溶液于5支離心管中，加入0.20 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL（PH=6.6）和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，混勻后于50 水浴中保溫20 min后，快速冷卻，再加入1 mL10%三氯乙酸，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液0.50 mL,加入0.1%三氯化鐵溶液0.25 mL，再加入1.75 mL蒸餾水，充分混勻，在700 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)i。 （2）以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)i為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出他們之間的關(guān)系。2 結(jié)果與分析2.1 GASeNPs對(duì)體外羥基自由基的清除率分析圖1 羥基自由基的測(cè)定GASeNPs對(duì)羥基自由基清除效果由圖1所示，100,150,200,250,300 g/mL的GASeNPs對(duì)羥自由基清除率分別為：49.90%、83.42%、91.35%、93.36%、96.68%。并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系，而Vc在相同濃度下的清除率分別為：40.42%、51.29%、52.94%、53.09%、53.20%,GA的清除率分別為：50.72%、62.82%、82.03%、90.58%、93.41%。結(jié)果表明Vc清除率較低，GASeNP在相同濃度下對(duì)羥自由基清除率優(yōu)于Vc和GA,最高清除率可達(dá)96.68%。2.2 GASeNPs對(duì)體外ABTS+自由基清除率分析ABTS2,2聯(lián)氨雙（3乙基苯并噻唑咻6磺酸）二胺）是一種供氫體。該方法作為測(cè)定抗氧化性的一種新方法，以Vc為陽性對(duì)照，測(cè)定其清除率如圖2所示。圖2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定由圖2可以看出，GASeNPs對(duì)ABTS+自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 g/mL時(shí)，GASeNPs的清除率為97.57%，GA的清除率為95.39%，而Vc的清除率只有32.48%，可見GASeNPs對(duì)ABTS+自由基具有極強(qiáng)的清除能力。2.3 GASeNPs的總還原力測(cè)定分析抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在關(guān)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。FeCl3/K3Fe(CN)6 法測(cè)定還原力，是通過測(cè)普魯士藍(lán)沉淀在700 nm處的吸光度，而離心之后普魯士藍(lán)還沒有沉淀下去時(shí)測(cè)其吸光度，吸光度處于不斷變化之中，所以測(cè)量應(yīng)先搖晃均勻放進(jìn)去立馬記錄數(shù)據(jù)。 圖3 還原力的測(cè)定 由圖3可以看出，GASeNPs對(duì)普魯士藍(lán)的還原作用曲線大致呈線性關(guān)系，且基本與Vc的曲線平行，直到質(zhì)量濃度為100 g/mL時(shí)兩條曲線呈現(xiàn)遠(yuǎn)離趨勢(shì)，GASeNPs的還原作用在加快，而Vc的則在放緩。GA的還原作用則在質(zhì)量濃度為80 g/mL之后優(yōu)于GASeNPs和Vc。說明GASeNPs的還原力比Vc強(qiáng)，抗氧化性比Vc強(qiáng)。3 小結(jié)與討論抗氧化劑是指能防止或延緩食品氧化性和延長貯存期的食品添加劑。GASeNPs則是外界物質(zhì)通過人為化學(xué)合成的一種抗氧化性納米材料。對(duì)于羥基自由基的清除作用：GASeNPs、GA、Vc對(duì)羥基自由基的清除率都是隨著濃度的增大，清除率增大。濃度范圍在100-300 g/mL時(shí)對(duì)羥基自由基的清除能力：GASeNPsGAVc。對(duì)于ABTS+自由基的清除作用：GASeNPs、GA、Vc對(duì)ABTS+自由基的清除率都是隨著濃度的增大，清除率增大。濃度范圍在5-25 g/mL時(shí)對(duì)ABTS+自由基的清除能力：GASeNPsGAVc。對(duì)于還原力的測(cè)定：GASeNPs、GA、Vc的還原力都是隨著濃度的增大，還原力逐漸增強(qiáng)。濃度范圍在20-100 g/mL時(shí)還原力大?。篏AGASeNPsVc。綜上所述，GASeNPs具有很強(qiáng)的抗氧化性，可應(yīng)用食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景。參 考 文 獻(xiàn)1何文飛, 何大維, 馬超, 等. 沒食子酸抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究J. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, (02):107-110.2李肖玲, 崔嵐, 祝秋德. 沒食子酸生物學(xué)作用的研究進(jìn)展J. 中國藥師, 2004, 7(10):767-769.3Ohno T, Inoue M, Ogihara Y. Cytotoxic activity of gallic acid against liver metastasis of mastocytoma cells P-815J. Anticancer research, 2001, 21(6A):3875.4楊清麗, 陳繼發(fā), 曲湘勇, 等. 納米硒對(duì)蛋鴿生產(chǎn)性能、蛋中硒含量及血清抗氧化指標(biāo)的影響J. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2015, 27(12):3895-3903.5陳劍杰, 曹謹(jǐn)玲, 羅永巨, 等. 納米硒對(duì)氟脅迫下鯉魚肝抗氧化功能及組織結(jié)構(gòu)的影響J. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(10):2970-2976.6Surai P F, Surai P F. Selenium in nutrition and health.J. Selenium in Nutrition & Health, 2006.7Gunter S A, Beck P A, Phillips J K. Effects of supplementary selenium source on the performance and blood measurements in beef cows and their calvesJ. Journal of Animal Science, 2003, 81(4):856-864.8鐘彩玲. 納米硒界面對(duì)草酸鈣晶體生長的調(diào)控作用D. 暨南大學(xué), 2014.9徐建國, 胡青平. 決明子水提物體清除自由基活性的研究J. 食品科學(xué), 2006, 27(6)73-7.10Xu X, Wang W, Li H. Determination of hydroxyl radicals in Fenton reaction by colorimetric assay and its applicationJ. Progress in Biochemistry & Biophysics, 1999, 26(1):67-69.11Jia Z, Wu J, Tang M. Colorimetric determination of hydroxyl radicals from fenton reactionJ. Progress in Biochemistry & Biophysics, 1996, 23(2):184-186.12Binsan W, Benjakul S, Visessanguan W, et al. Antioxidative activity of Mungoong, an extract paste, from the cephalothorax of white shrimp (Litopenaeus vannamei)J. Food Chemistry, 2008, 106(1):185-193.13Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al. Antioxidant activity applying a improved abts