2017_2018年高中生物第1章微生物培養(yǎng)技術(shù)第3節(jié)測(cè)定微生物的數(shù)量學(xué)案.doc

第三節(jié) 測(cè)定微生物的數(shù)量一、測(cè)定微生物數(shù)量的方法測(cè)定微生物數(shù)量的方法可分為兩類：直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。前者常用的是顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，這種方法是先將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。后者最常用的是稀釋平板計(jì)數(shù)法，需要將待測(cè)樣品配制成均勻的系列稀釋液并使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù)，從而推算出樣品中的活菌數(shù)。利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)出的菌體數(shù)與平板計(jì)數(shù)法相比哪個(gè)多些？【提示】血球計(jì)數(shù)板測(cè)出的是全部菌體數(shù)，而平板計(jì)數(shù)法只能測(cè)出活菌數(shù)，而且比實(shí)際數(shù)偏少。二、間接計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1制備土壤稀釋液取土壤表層510 cm處的土樣。準(zhǔn)確稱取1 g土樣，放入盛有99 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩20 min后制成102倍的稀釋液。然后進(jìn)行系列稀釋，得到103、104、105、106倍的系列稀釋菌液。2取樣及倒平板3培養(yǎng)4觀察記錄(1)計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)于細(xì)菌、放線菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有30300個(gè)菌落為宜，霉菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有10100個(gè)菌落為宜。(2)計(jì)算每克樣品菌數(shù)公式為：每克土壤樣品菌數(shù)稀釋倍數(shù)。預(yù)習(xí)完成后，請(qǐng)把你認(rèn)為難以解決的問題記錄在下面的表格中問題1問題2問題3問題4一、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定 1.測(cè)重量法 干重法：將單位體積待測(cè)的培養(yǎng)液離心后，用清水洗滌15次，放入干燥器中加熱干燥，加熱溫度一般在100105 之間，再稱重。以細(xì)菌為例，一個(gè)細(xì)胞一般重約10121013g，也可在較低溫度(如40 )下進(jìn)行真空干燥。 濕重法：將一定量的菌懸液離心或過濾，得到菌體，反復(fù)洗滌后稱濕重，干重一般為濕重的20%25%。2計(jì)數(shù)法(1)直接計(jì)數(shù)法這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌與活菌。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積1 mm2和高0.1 mm的計(jì)數(shù)室，在1 mm2的面積里又被劃分成25個(gè)(或16個(gè))中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)(或25個(gè))小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成。將稀釋的樣品滴在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)45個(gè)中格的細(xì)菌數(shù)，并求出每個(gè)小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)4001 000稀釋倍數(shù)(2)間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)稀釋平板涂布法，常用來統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)。此法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)先將待測(cè)樣品做一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。說明：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。將待測(cè)樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取0.1 mL接種到已制備好的平板上，然后用無(wú)菌涂布器將菌液涂布整個(gè)平板表面，放入適宜的溫度下培養(yǎng)計(jì)算菌落數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布、培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。二、測(cè)定土壤中的微生物數(shù)量土壤中生活的微生物種類和數(shù)量是極其豐富的，這些數(shù)量眾多的微生物對(duì)提高土壤肥力有重要作用。因此，測(cè)定土壤的含菌量可以作為判定土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)。1實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)定的微生物樣品按比例作一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，吸取一定量某幾個(gè)稀釋度的菌液接種到平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成單個(gè)菌落，根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣接種量和菌落數(shù)即可換算出樣品的含菌數(shù)。2材料用具土壤樣品：尿素，酵母粉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉、酚紅、瓊脂，1 mol/L NaOH溶液，無(wú)菌吸管，盛有9 mL無(wú)菌水的試管，盛有90 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶，試管架，無(wú)菌培養(yǎng)皿，記號(hào)筆，燒杯等。3方法步驟(1)制備尿素固體培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取尿素20 g，酵母粉0.1 g，磷酸二氫鉀9.1 g，磷酸氫二鈉9.5 g，酚紅0.01 g，瓊脂20 g，依次加入盛有900 mL蒸餾水的燒杯中，加熱溶解后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.27.4，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。(2)制備土壤樣品稀釋液稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩約20 min，使土樣和水充分混合，將土壤懸液制成101、102、103、104、105、106不同稀釋度的稀釋液。制備土壤樣品稀釋液時(shí)應(yīng)注意每個(gè)吸管只能接觸一個(gè)濃度的稀釋液，且取樣前需充分搖勻。(3)加樣取10套無(wú)菌培養(yǎng)皿，取104、105和106每種稀釋度做3個(gè)重復(fù)平板，留下一個(gè)平板作空白對(duì)照。分別用1 mL無(wú)菌移液管精確吸取104、105、106三個(gè)稀釋度菌懸液各0.2 mL，加至相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中(如圖)。微生物數(shù)量測(cè)定的流程圖(4)倒平板將菌液移入培養(yǎng)皿后立即倒入溶化并冷卻至45 左右的尿素培養(yǎng)基(倒入量約15 mL)，隨即快速晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基充分混勻后平置，待凝。(5)培養(yǎng)待平板完全凝固后，倒置于恒溫箱中37 培養(yǎng)。(6)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)培養(yǎng)48 h后取出平板，統(tǒng)計(jì)各皿中的菌落數(shù)，將結(jié)果記錄在表格中，計(jì)算結(jié)果時(shí)，應(yīng)選取每皿菌落數(shù)在30300(如圖)的一組平板為代表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每皿菌落數(shù)示意圖(7)計(jì)算樣品中菌數(shù)的公式每克樣品的菌數(shù)同一稀釋度的菌落平均數(shù)0.2稀釋度10直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)菌數(shù)在探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化的實(shí)驗(yàn)中，需利用計(jì)數(shù)板對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一個(gè)特制的可在顯微鏡下觀察的玻片，樣品就滴在計(jì)數(shù)室內(nèi)。計(jì)數(shù)室由2516400個(gè)小室組成，容納液體總體積為0.1 mm3。某同學(xué)操作時(shí)將1 mL酵母菌樣品加99 mL無(wú)菌水稀釋，用無(wú)菌吸管吸取少許使其自行滲入計(jì)數(shù)室，蓋上蓋玻片并用濾紙吸去多余菌液，進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。(1)在實(shí)驗(yàn)中，某同學(xué)的部分實(shí)驗(yàn)操作過程是這樣的：從靜置試管中吸取酵母菌培養(yǎng)液加入計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)；把酵母菌培養(yǎng)液放置在冰箱中；第七天再取樣計(jì)數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析繪成曲線。請(qǐng)糾正該同學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中的3處錯(cuò)誤：_。_。_。(2)在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該對(duì)計(jì)數(shù)板、吸管等器具進(jìn)行_處理。(3)如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)采取的措施是_。(4)如果觀察到如圖所示a、b、c、d、e 5個(gè)大格共80個(gè)小室內(nèi)共有酵母菌48個(gè)，則上述1 mL酵母菌樣品中約有酵母菌_個(gè)；要獲得較為準(zhǔn)確的數(shù)值，減少誤差，你認(rèn)為該怎么做？_?！窘馕觥繉?duì)各小題逐項(xiàng)分析如下題號(hào)分析(1)在從試管中吸取酵母菌之前，應(yīng)將試管輕輕振蕩幾次，目的是使酵母菌在培養(yǎng)液中均勻分布。酵母菌的培養(yǎng)液應(yīng)置于適宜條件下，并且每隔24小時(shí)就要統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目(2)為了避免雜菌污染，實(shí)驗(yàn)中所用吸管、計(jì)數(shù)板等器具需進(jìn)行滅菌處理(3)(4)解答時(shí)要注意以下兩點(diǎn)：統(tǒng)一單位；注意體積的變化。400個(gè)小室共容納液體總體積為0.1 mm3，則80個(gè)小格容納體積為：2102 mm3，含酵母菌48個(gè)，又因酵母菌培養(yǎng)液總體積為100 mL，統(tǒng)一單位后即可求出酵母菌個(gè)數(shù)【答案】(1)應(yīng)將試管輕輕振蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)應(yīng)將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng)應(yīng)連續(xù)七天，每天觀察、取樣計(jì)數(shù)并記錄數(shù)據(jù)(2)滅菌(3)適當(dāng)稀釋(4)2.4108多次計(jì)數(shù)，求平均值1上題中某同學(xué)用一支移液管連續(xù)三次取1 mL菌液進(jìn)行稀釋，(過程如圖)中間忘記沖洗移液管，計(jì)數(shù)結(jié)果將()A偏低B偏高C不變 D無(wú)法判斷【解析】由于移液管未沖洗，下一次使用時(shí)會(huì)帶有上次的高濃度菌液，使計(jì)數(shù)結(jié)果偏高?！敬鸢浮緽土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)圖甲是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過程，圖乙是脲酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA部分序列。(1)圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以_為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加_作指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周圍的指示劑將變成_色。(2)在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過程采取的接種方法是_，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為_108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較_。(3)現(xiàn)有一菌株的脲酶由于基因突變而失活，突變后基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在圖乙箭頭所示位置增加了70個(gè)核苷酸，使圖乙序列中出現(xiàn)終止密碼(終止密碼有UAG、UGA和UAA)。突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中，終止密碼為_，突變基因表達(dá)的蛋白含_個(gè)氨基酸?！緦忣}導(dǎo)析】【精講精析】(1)脲酶能夠催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳，因此選擇培養(yǎng)基中應(yīng)以尿素為唯一氮源。挑取單菌落接種到加有酚紅指示劑的鑒別培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，菌落周圍的氨增加，pH升高，酚紅指示劑將變紅。(2)該過程采取的接種方法為稀釋涂布平板法。利用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)選擇菌落數(shù)在30300的平板，因此平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落平均數(shù)為(156178191)3175個(gè)。每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)為1750.11051.75108。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法能將死細(xì)胞計(jì)算在內(nèi)，而稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法只能計(jì)數(shù)活細(xì)胞(只有活細(xì)胞才能在平板上生長(zhǎng))，故一般血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法要比稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果大。(3)箭頭處插入70個(gè)核苷酸，箭頭后密碼子的解讀方式為*AG，UGA，GAA對(duì)比3種終止密碼可發(fā)現(xiàn)，此處的終止密碼為UGA。從起始密碼到終止密碼之前共有27372個(gè)堿基，因此突變基因表達(dá)的蛋白含115個(gè)氨基酸。【答案】(1)尿素酚紅紅(2)稀釋涂布平板法1.75少(3)UGA115稀釋平板計(jì)數(shù)法的誤差分析(1)稀釋時(shí)移液管不沖洗，偏大；(2)平板中菌落數(shù)太多，(可能重復(fù))偏?。?3)稀釋時(shí)未混合均勻，可能大可能小。2在做土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲組實(shí)驗(yàn)用氮源只含尿素的培養(yǎng)基，乙組實(shí)驗(yàn)用氮源除含尿素外還含硝酸鹽的培養(yǎng)基，其他成分都相同，在相同條件下操作、培養(yǎng)與觀察，則乙組實(shí)驗(yàn)屬于()A空白對(duì)照B標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照 C相互對(duì)照 D條件對(duì)照【解析】本實(shí)驗(yàn)甲組為實(shí)驗(yàn)組，乙組為對(duì)照組，給實(shí)驗(yàn)組某種處理，給對(duì)照組另一條件的處理，為條件對(duì)照?！敬鸢浮緿1噬菌斑(如圖1)是在長(zhǎng)滿細(xì)菌的培養(yǎng)基上，由一個(gè)噬菌體侵染細(xì)菌后不斷裂解細(xì)菌產(chǎn)生的一個(gè)不長(zhǎng)細(xì)菌的透明小圓區(qū)，它是檢測(cè)噬菌體數(shù)量的重要方法之一。 現(xiàn)利用培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)取樣的方法， 得到噬菌體在感染大腸桿菌后數(shù)量的變化曲線(如圖2)，對(duì)該曲線的敘述正確的是()A曲線ab段噬菌體數(shù)量不變，說明噬菌體還沒有開始侵染細(xì)菌B曲線ab段，細(xì)菌內(nèi)正旺盛地進(jìn)行細(xì)菌DNA的復(fù)制和有關(guān)蛋白質(zhì)的合成C曲線bc段所對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)噬菌體共繁殖了10代D限制cd段噬菌斑數(shù)量增加的因素最可能是絕大部分細(xì)菌已經(jīng)被裂解【解析】圖中ab段噬菌斑已有一定數(shù)量，說明噬菌體已開始侵染細(xì)菌。bc段噬菌斑增加了10倍，說明噬菌體數(shù)約增加了10倍，而噬菌體繁殖10代，噬菌體數(shù)目應(yīng)增加到210倍。cd段噬菌斑數(shù)目增加減緩，很可能由于絕大多數(shù)宿主細(xì)菌細(xì)胞已被裂解?！敬鸢浮緿2菌種鑒定的重要依據(jù)是()A細(xì)菌的大小、形狀和顏色B菌落的大小、形狀、顏色C有無(wú)鞭毛D培養(yǎng)基的不同【解析】不同種類的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具