微生物的實驗室培養(yǎng).pptVIP

到目前為止， 幾十項Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，化學(xué)獎 都與微生物學(xué)有關(guān),微生物的類群,微生物,原核類:,真核類,非細胞類：,細菌、支原體、衣原體、放線菌、藍藻,個體微小、結(jié)構(gòu)簡單,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,病毒、類病毒、朊病毒等,微生物的共同特點：,微生物基礎(chǔ)知識,單細胞的動植物,如草履蟲、單細胞藻類等,幾種菌落及其形態(tài),幾種菌落及其形態(tài),課題1 微生物的實驗室培養(yǎng),專題2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,培養(yǎng)微生物需要解決的兩個問題是什么？,1、為其提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件 2、防止雜菌的入侵,思考:,一、培養(yǎng)基,1.營養(yǎng)成分：,思考：微生物“吃”什么？,水、無機鹽、碳源、氮源,此外，還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)（如:生長因子)以及氧氣等的要求。,一、培養(yǎng)基：,1.基本成分：,碳源,無機碳源：,有機碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏,自養(yǎng)微生物,異養(yǎng)微生物,氮源,無機氮源：,有機氮源：,N2、NH4、NO3-,蛋白胨,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。,分析其營養(yǎng)構(gòu)成？,C,課堂練,.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是( ) A碳源 B氮源 C無機鹽 D特殊營養(yǎng)物質(zhì),A,課堂練,.概念： .種類：,一、培養(yǎng)基,人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。,（1）按物理性質(zhì)來分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 （2）按功能來分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基：菌落,back,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基 不加氮源的無氮培養(yǎng)基 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基,分離酵母菌、霉菌等真菌 （抑制細菌、放線菌的生長）,分離金黃色葡萄球菌,分離固氮菌,分離自養(yǎng)型微生物,back,伊紅美藍培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，因為的代謝產(chǎn)物與伊紅美藍結(jié)合，使菌落呈黑色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。,例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基,大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無金屬光澤,back,獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？,二、無菌技術(shù),防止外來雜菌污染,1. 目的：,2. 方法：,消毒與滅菌,消毒與滅菌的概念和區(qū)別？,2.無菌范圍：,實驗操作空間消毒,操作者的手、衣著消毒,實驗用具滅菌,實驗操作過程,酒精燈旁操作,超凈工作臺,芽孢,有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。（抗逆性極強） 注：不是繁殖體,干熱滅菌,接種環(huán)、接種針等 金屬用具,7075、30min 80、15min,100、56min,較為溫和理化方法，,殺死部分有害菌體,（不包括芽孢、孢子）,強烈的理化方法，,殺死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化學(xué)藥劑,紫外線,灼燒滅菌,高壓蒸汽滅菌,二.無菌技術(shù)：,防止外來雜菌的污染,2.消毒與滅菌：,1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,高壓蒸氣滅菌的原理是（ ） A高壓使細菌DNA變性 B高壓使細菌蛋白質(zhì)凝固變性 C高溫燙死細菌 D高溫使細菌DNA變性,B,二、微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,涂布器,接種環(huán),接種針,四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：,制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1.計算,2.稱量,3.溶化,牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋,4.調(diào)pH、分裝、封口,5.滅菌,6.倒平板 7.無菌檢查：37培養(yǎng)24-48h,培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿,防瓊脂糊底,倒平板,約50,防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染,灼燒滅菌， 防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,問題討論,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,b.純化大腸桿菌,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,微生物的接種技術(shù)：,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,一、 平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.,將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_,在_旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞,將試管口通過火焰,.將已_的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液,左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃_條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。,.將試管通過火焰，并塞上棉塞,火焰,冷卻,三至五,灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。,末端,燒紅,將平板_放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,倒置,二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：,純化大腸桿菌：,平板劃線法：,菌種,劃3個平板,1個不劃線,1.接種：,接種環(huán),防止劃破培養(yǎng)基,（重復(fù)實驗）,（空白對照）,1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次. 2.劃線首尾不能相接 3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng),劃線分離法注意事項:,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,二、稀釋涂布平板分離法,涂布分離法:是指將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個的細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。,6支試管，分別加入9ml無菌水,101,102,103,104,105,106,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液：,菌液,微量 移液器,稀釋涂布平板法：,a.梯度稀釋菌液：,b.涂布平板：,不超過0.1ml,各梯度分別涂布3個平板,1個不涂布作空白對照,滴,灼,涂,答：應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？,2、純化大腸桿菌,平板劃線法:,稀釋涂布平板法:,(1) 接種方法,.連續(xù)劃線，.逐步稀釋.,.梯度稀釋，.分別涂布.,平板劃線法：,稀釋涂布平板法：,2.培養(yǎng)：,將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基,放入37恒溫箱中培養(yǎng)12h24h后，,觀察并記錄,結(jié)果分析與評價,.培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 .接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 .是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。,三.菌種的保藏：,1.臨時保藏：,試管固體斜面培養(yǎng)基上,4,2.長期保存：,菌種易被污染、變異,甘油管藏,1ml甘油1ml菌液,20,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例:關(guān)于微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是( ) A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。,D,例2：下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是( ) A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。,B,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答： （1）右表培養(yǎng)基可培