《細胞工程》PPT課件 (2).pptVIP

第三章 細胞工程與食品產業(yè),第三章 細胞工程與食品產業(yè),一、細胞工程的基本原理 二、細胞培養(yǎng)技術 三、細胞融合技術 四、動物細胞工程及其在食品中的應用 五、植物細胞工程及其在食品中的應用 六、固定化細胞及其在食品中的應用,一、細胞工程的基本原理,1.1 細胞工程的概念及研究范疇 1.2 細胞工程的基礎知識 1.3 細胞工程的理論核心,1.1 細胞工程的概念及研究范疇,概念：應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的試驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體的有關理論和技術方法的學科。 研究范疇：廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養(yǎng)技術，狹義的細胞工程則是指細胞融合和細胞培養(yǎng)技術。根據研究對象不同，細胞工程可分為動物細胞工程、植物細胞工程和微生物細胞工程。,1.2 細胞工程的基礎知識,生物界有兩大類細胞：原核細胞與真核細胞。 原核細胞：DNA裸露于細胞質中，不與蛋白質結合，易于人們的遺傳操作；生長迅速；胞內無膜系構造細胞器；生長迅速；是細胞改造的良好材料。 真核細胞：胞內有細胞核和眾多膜系構造細胞器；一般都有明顯的細胞周期，處于有絲分裂時期的染色包體呈現高度螺旋緊縮狀態(tài)，既不利于基因外釣，也不利于外源基因的插入?？刹扇∫欢ǖ拇胧┱T導真核細胞同步化生長。植物細胞外還有數層以纖維素為主要成分的細胞壁。,動物細胞結構圖,細菌細胞模式圖,1.3 細胞工程的理論核心,1.3.1 細胞全能性概念 1902年，德國植物學家Haberlandt提出了細胞全能性的假想。 1934年，White首次定義為: 每個植物活細胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。 70年代，擴大了以上定義范圍，認為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。 80年代初，認為：任何植物的離體細胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細胞的藥物生物合成的能力。,目前細胞全能性定義： 每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應激性和自體復制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現這些特征屬性。,1.3.2 植物活細胞具有生命特征屬性 生命特征屬性 細胞具有生命特征屬性 離體培養(yǎng)細胞展現該物種的生命特性,生命特征屬性：新陳代謝、應激性、自我復制,1.新陳代謝：是指維持生命各種活動過程中的化學變化的總稱。 生物體總是不斷地從環(huán)境中攝取物質和能量，來維持自身。又有同等量的能，以熱或者其他形式排出體外。一旦新陳代謝停止，生命活動也就停止，生物體就會瓦解。 即，生物體要維持生命，必須吐故納新。,2. 應激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應反應的特征。 生物體的生存離不開環(huán)境條件，而環(huán)境又是不斷變化的。除四季有規(guī)律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。生物體具有“某種機制”來感知和正確估計環(huán)境的變化，以便在體內加以校正，保證體內平衡，來應付突變的環(huán)境。,3. 自我復制：是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復制出完全相同的結構，或產生也具有相同的自體繁殖能力的突變結構。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。 “遺傳”保證了物種的純化，“變異”為物種的進化提供依據。自我復制實現了遺傳與變異的矛盾統(tǒng)一。,細胞具有生命特征屬性 生物體由細胞組成，所以細胞也具有生命特征屬性。 細胞是生物體結構和功能的基本單位。核酸是構成細胞的重要物質，攜帶著遺傳信息，并具有自我復制的能力，但當單獨存在時，不能表現出生命特征屬性。只有組成細胞時，才能表現完整的生命活動。,同一個體每一個體細胞所含的基因是相同的，但細胞結構和功能往往不同（如根細胞具有吸收水分和養(yǎng)分的作用；葉片具有光和、蒸騰作用等）。 所以說，并非每個細胞能把全部遺傳信息都表達出來。有的基因在這些細胞中表達，另一些基因在另一些細胞中表達。即，生命的全部屬性在不同的細胞中分別表達。,細胞全能性的相對性,離體培養(yǎng)細胞展現該物種的生命特性 1.培養(yǎng)細胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細胞具有光自養(yǎng)能力；培養(yǎng)細胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。,2.培養(yǎng)細胞的應激性 在適宜培養(yǎng)條件下，離體細胞具有應激性:植物組織切割損傷后，應激于培養(yǎng)條件而出現脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。,3.培養(yǎng)細胞展現自體復制特性,二、細胞工程的基本技術,2.1 無菌操作技術 2.2 細胞培養(yǎng)技術 2.3 細胞融合技術,2.1 無菌操作技術,細胞工程培養(yǎng)中最重要的，也是最基本的要求就是各項操作應從無毒害、無污染的培養(yǎng)環(huán)境來考慮。培養(yǎng)基、器皿材料、接種工具、操作環(huán)境、培養(yǎng)室和超凈工作臺等各個環(huán)節(jié)都應注意。,瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口,正 確 錯 誤,接種過程中盡可能達到懸空要求,防止操作帶來的污染,正 確 錯 誤,接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口,正 確 錯 誤,接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中,正 確 錯 誤,2.2 細胞培養(yǎng)技術,2.2.1 細胞培養(yǎng)技術概述 2.2.2 植物細胞培養(yǎng)技術 2.2.3 動物細胞培養(yǎng)技術,2.2.1 細胞培養(yǎng)技術概述,細胞培養(yǎng)：是指在動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件下的保存和生長。 細胞培養(yǎng)一般步驟： 首先，要取材和除菌。用一定的化學試劑對材料進行嚴格的表面清洗、消毒。有時還要借助某些特定的酶，對材料進行預處理，以期得到分散生長的細胞。 其次，根據各類細胞的特點，配制細胞培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進行滅菌或除菌。采用無菌操作技術，將生物材料接種于培養(yǎng)基中。 最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各類細胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件。當細胞達到一定生物量時應及時收獲或傳代。,2.2.2 植物細胞培養(yǎng)技術,材料準備 植物細胞培養(yǎng)基 植物細胞培養(yǎng)方法,材料準備,外植體：用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段。 來自溫室或田間開放培養(yǎng)的種子、幼苗、器官、組織中帶有各種微生物，當與培養(yǎng)基接觸時，微生物就會迅速生長而抑制培養(yǎng)物的生長，故在培養(yǎng)前必須進行嚴格的消毒處理。 常用的消毒滅菌劑效果較好的有幾種化學試劑，如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。,植物細胞培養(yǎng)基,用于植物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求。 植物細胞的培養(yǎng)基通常包括無機鹽、碳源、維生素、生長調節(jié)素、有機添加劑等。,無機鹽：有不少鹽可用來提供“大量元素”和“微量元素”，表中給出了常用培養(yǎng)基中無機鹽的含量。,碳源和能源：培養(yǎng)中的細胞對蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。 維生素：培養(yǎng)中的植物細胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生質體培養(yǎng)通常需要大多數必需維生素。 氨基酸：雖然植物細胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。 植物生長激素：激素分為兩類，生長素和分裂素。生長素促進細胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促進細胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-芐氨基嘌呤和玉米素，對芽的誘導具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進細胞的分裂、生長。,3.植物細胞培養(yǎng)方法,植物細胞培養(yǎng)類型：按培養(yǎng)對象可分為單倍體細胞培養(yǎng)和原生質體培養(yǎng)；按培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式又可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。,(1)植物細胞懸浮細胞培養(yǎng),懸浮細胞培養(yǎng)技術：是指把離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行的無菌培養(yǎng)。 懸浮培養(yǎng)優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產生的有害物質在局部積累而對細胞自身產生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體的交換。,植物細胞懸浮培養(yǎng)與微生物有許多相似的地方，但兩者又存在著明顯的不同。例如，植物細胞對剪切力敏感、易結團、需光照等條件。此外，植物細胞生長緩慢，發(fā)酵時間長，維持無菌操作更為困難。 對剪切力敏感：植物細胞的個體大，細胞壁僵脆且具有大的液泡，這些特性決定了其對剪切力十分敏感。過高的剪切力可使細胞受到機械損傷，細胞體積變小，細胞形態(tài)和聚集狀態(tài)改變；或使細胞自溶，胞內化合物釋放；也可能導致細胞的活性喪失。 結團：絕大多數植物細胞在懸浮培養(yǎng)時是結成直徑小至100 m，大至幾毫米的小團。其主要原因是細胞分化后不能很好地分開，另外生長后期分泌的多糖類物質也有助于結團。過大的細胞團容易下沉，造成混合困難，而且還影響傳質，使中心的營養(yǎng)和供氧不足，影響產物的合成能力。 需光照：大多數植物細胞，次級代謝產物的合成受光照的影響，一些研究顯示光照對于胡蘿卜素、黃酮、花青素等的合成有促進作用。,一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足的基本條件：一是懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小；二是均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細胞團；三是生長迅速，懸浮細胞的量一般2-3天甚至更短時間便可增加一倍。,在建立懸浮細胞系時需注意以下事項： 1.選擇合適的外植體：由外植體直接誘導的愈傷一般是不適合懸浮培養(yǎng)的，需要通過一定的途徑進行篩選、改良，獲得適合懸浮培養(yǎng)的愈傷，其影響因素有： (1)外植體：對于不同植物，外植體的選擇差異較大，如樹木和花卉的葉片、莖尖、芽尖等都可作為外植體誘導愈傷，草坪草用幼穗往往可獲得較成熟種子更高的愈傷誘導率。在誘導率較高的基礎上更容易快速建立起高頻再生的懸浮細胞系。 (2)基因型：適合懸浮培養(yǎng)的基因型在連續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中表現出好的適應性，在震蕩培養(yǎng)兩個月后，細胞團逐漸變小，均勻，生長旺盛。而不適合懸浮培養(yǎng)的基因型在連續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中，細胞團大而致密，生長速度慢，生長狀態(tài)不均勻。,2.3 細胞融合技術,2. 繼代挑選與培養(yǎng)技術：對于愈傷的挑選，是建立良好懸浮體系的關鍵。誘導出的初代愈傷組織一般可分為三種：I為質地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織。II為質地疏松、易分散、不分泌粘液的顆粒狀胚性愈傷。III為柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷。其中II是適合懸浮培養(yǎng)的愈傷。在進行最初懸浮培養(yǎng)時，挑選那些生長力強表面有顆粒突起、疏松易碎的胚性愈傷進行液體培養(yǎng)，并用鑷子盡量夾碎。 3.選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：愈傷組織培養(yǎng)基有時不適合作為懸浮細胞培養(yǎng)基，這時需在基本培養(yǎng)基的基礎上重新選擇培養(yǎng)基。選擇合適的轉速、培養(yǎng)溫度、適宜的光照。,(2)植物細胞固定化培養(yǎng),固定化培養(yǎng)技術：植物細胞固定化是將植物細胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進行培養(yǎng)，并生產有用代謝物的技術。,與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)具有很多優(yōu)點： （1）有利于次生物質的合成、積累； （2）能長時間保持細胞活力； （3）減弱營養(yǎng)液流動引起的剪切力； （4）后處理難度小，便于次生代謝物的收集； （5）更好的光合作用； （6）促進或改變產物的釋放。,2.2.3 動物細胞培養(yǎng)技術,動物細胞培養(yǎng)：是指將動物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長與增殖。在細胞培養(yǎng)中，細胞不再分化成組織。 根據細胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養(yǎng)的細胞類型：懸浮型和貼附型。,動物細胞培養(yǎng)基,（1）種類：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩大類。 天然培養(yǎng)基使用最早，營養(yǎng)成分高，也最為有效。但成分復雜，個體差異大，來源也缺乏，因而使用受到限制。動物血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，血清含有豐富的營養(yǎng)物質，對動物細胞的生長繁殖具有促進作用。同時，血清對細胞貼壁和保護亦有明顯作用，且能中和有毒物質的毒性，使細胞不受傷害。 合成培養(yǎng)基是根據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成的，具有一定的組成。但這種合成培養(yǎng)基只能維持細胞的生存，要想使細胞更好地生長和繁殖，還要補充部分天然培養(yǎng)基，通常是采用血清。,（2）無血清培養(yǎng)基 血清是由血漿除去纖維蛋白而形成的，其中含有各種血漿蛋白質、肽、脂肪、碳水化合物、無機物質等，以及血小板凝集時所釋放的各種因子、轉化生長因子，這些因子能誘導某些細胞的繁殖，而且也可以抑制其細胞生長并誘導另一些細胞分化。 在細胞培養(yǎng)中，血清的主要作用是提供各種激素。這個假設首先在垂體細胞株GH4的培養(yǎng)中得到證實。此后，無血清細胞培養(yǎng)技術得到迅速發(fā)展，十多年來已報道有幾十種細胞株系在無血清培養(yǎng)基中生長和增殖獲得成功。,無血清培養(yǎng)基一般是由基礎培養(yǎng)基和替代血清的補充因子組成的。 基礎培養(yǎng)基是各種營養(yǎng)物質的混合物，是維持組織或細胞生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等一系列生命活動必不可少的物質。 補充因子的種類很多，包括大分子、小分子和微量元素等。,必需補充因子：幾乎所有的細胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時，都需要胰島素和轉鐵蛋白存在。 特殊補充因子：包括生長因子、貼壁因子和激素。 生長因子：是維持細胞生存和增殖所必需的物質。依照化學性質可分為肽類生長因子和甾體生長因子。 貼壁因子：絕大多數真核細胞在體外生長時需要固著于適當的基底。細胞固著作用是一個復雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿表面，細胞與貼壁因子的結合等。 激素：很多細胞在無血清培養(yǎng)時需要加入激素，如生長激素、胰高血糖素等。 無血清細胞培養(yǎng)技術是細胞培養(yǎng)研究中的一個里程碑。,2.細胞培養(yǎng)常用術語,初始培養(yǎng)：指直接由機體取得材料（細胞、組織或器官）、到第一次傳代前即為初始培養(yǎng)。經初始培養(yǎng)后的細胞將形成“細胞系”。 細胞系：指起始于第一次傳代時的初始培養(yǎng)物，它由初始培養(yǎng)中的許多細胞系列所組成。 體外培養(yǎng)的動物細胞可分為原代細胞和傳代細胞。原代細胞是指從機體取出后初次培養(yǎng)的細胞，也有人把培養(yǎng)的第一代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)；適應在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。,3.常用的動物細胞培養(yǎng)方法,動物體外培養(yǎng)的細胞有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細胞，來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞屬于這一類型。這一類可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮培養(yǎng)。另一類是貼壁依賴性細胞，大多數動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞都屬于這一類型。它們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。,（1）懸浮培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)是指利用旋轉、振搖或攪拌的方法使細胞始終處于懸浮狀態(tài)，在此狀態(tài)下生長繁殖的方法。此法主要用于懸浮生長的細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。對于小規(guī)模培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)可采用轉瓶和滾瓶培養(yǎng)方式。大規(guī)模培養(yǎng)則可采用發(fā)酵罐式的細胞培養(yǎng)反應器。 該培養(yǎng)方法優(yōu)點在于：對設備的要求簡單，并可借鑒微生物發(fā)酵的部分經驗和放大規(guī)律。缺點是培養(yǎng)的細胞密度低且容易發(fā)生變異，因此有潛在的致癌危險。對于貼壁依賴性細胞，不能進行懸浮培養(yǎng)。,（2）貼壁培養(yǎng),細胞貼壁：分散的細胞懸浮液在培養(yǎng)器中要貼附于壁上的現象。 原來是圓形的細胞一經貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細胞就開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般在數天后就鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層，這種培養(yǎng)方法又叫單層細胞培養(yǎng)。 有一個非常有趣的現象是細胞的接觸抑制，當貼壁生長的細胞生長到表面相互接觸時，就停止分裂增殖。因此長成單層的細胞經過一段時間，一定須再重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。,貼壁培養(yǎng)：是指必須貼附在固體介質表面上生長的細胞培養(yǎng)。大多數哺乳動物細胞屬于貼壁依賴性細胞。 通常，細胞貼壁的步驟包括：貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細胞在培養(yǎng)表面上擴展等幾個。,細胞在培養(yǎng)表面貼壁過程,優(yōu)點：單層細胞培養(yǎng)比較容易完全換液，經清洗單層細胞后便可加入新鮮的培養(yǎng)液。 缺點：擴大培養(yǎng)比較困難，花費較大；使用更多的空間；不能有效地監(jiān)測細胞的生長；在測定和控制培養(yǎng)參數上比較困難的。,（3）微載體系統(tǒng),培養(yǎng)方法：細胞可貼附在微載體表面上，并懸浮于培養(yǎng)基中，逐漸生長成細胞單層。 優(yōu)點：具有比表面積大，由于微載體的比表面積大，單位體積培養(yǎng)基細胞產率高。微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細胞生長環(huán)境均一，簡化了這些環(huán)境因素的監(jiān)測和控制。收獲過程簡單，勞動強度小和占用空間小等特點。,（4）固定化培養(yǎng),在體內，細胞是在三維間質組織之中的，而固定培養(yǎng)正是模擬這個生理狀態(tài)。用此法可達到較高的細胞密度，并且很多固定材料可保護懸浮細胞免受由于培養(yǎng)液流動產生剪切力的損害。 固定化培養(yǎng)既適用于懸浮生長的細胞，也適用于貼壁生長的細胞培養(yǎng)。,各種固定化方法的特點,(i)吸附：選擇適當的條件，將細胞和支持物混合，細胞便貼附在支持物表面。缺點主要是負荷能力低，有細胞脫落的危險。 (ii)共價貼附 ：細胞和支持物通過化學鍵結合，減少了細胞泄漏，但需要化學試劑處理，這對細胞活性不利。 (iii)離子共價交聯 ：如果用聚合物(聚胺等)處理細胞懸液，聚合物則會在細胞之間形成橋使之絮結。通常細胞活性高，但機械穩(wěn)定性差，時常還發(fā)生細胞泄漏。 (iv)微膠囊化 ：用一些無機溶劑和乳化劑將細胞包在半透膜中，這些試劑對細胞存在著潛在危險。微囊化的細胞具有抗機械剪切的能力，但由于半透膜孔徑通常較小，大分子量的基質通常難以進入，由于這種擴散障礙，并不是使所有細胞都處于最佳狀態(tài)。 (v)包埋 ：將細胞和多聚物或單體混合，隨著凝膠的形成，細胞嵌入多聚物的網絡中。此法步驟簡單，條件溫和，且負荷量大，細胞泄漏減少，多聚物網絡能保護細胞抗機械剪切。當然，它亦存在一些缺點，如擴散限制并非所有細胞都能接觸最佳基質濃度。由于大分子基質不能滲透多聚物網絡，因而往往有一些物質被排斥在外。,2.3 細胞融合技術,細胞融合：是指不同的細胞在離體條件下接觸，用無性的方法使其成為一體而產生雜種細胞的技術。植物細胞和微生物細胞常因有細胞壁不能直接用于融合，須經酶法除去細胞壁而得原生質體而后再進行融合，又稱原生質體融合。,細胞融合的過程：細胞在促融因子的作用下，出現凝集現象，然后，細胞之間的質膜發(fā)生粘連，細胞開始融合，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生核融合，形成雜種細胞。,促融因子,生物學法：采用病毒促進細胞融合。如仙臺病毒。但這種方法存在著許多問題，如病毒 制備困難、操作復雜等，目前，這種方法主要適用于動物細胞融合，用于實驗室研究。 化學融合劑法：如PEG法：融合的程序大致有以下幾步：從雙親分別制備原生質體；混合二親本的原生質體；誘導融合處理；緩緩加入幾滴高pH高鈣液，持續(xù)15分鐘，加入沖洗液，最后將稀釋液收集于離心管中，離心收集原生質體；將處理后的原生質體作鏡檢并作培養(yǎng)。 電融合法：這是80年代出現的細胞工程技術。采用直流電脈沖的誘導，可改變原生質體質膜表面的電荷，使異種原生質體粘合，并使原生質膜瞬間破裂，相鄰的原生質體連接、閉合、產生融合體。電融合的優(yōu)點是，對原生質體的損害小，融合率高、重復性強。另外，它省去用PEG誘導后必須洗滌的步驟，方法簡單。缺點是必須購置專用的細胞電融合設備。,植物原生質體的制備,（1）取材與除菌 取活躍生長的器官和組織 較臟的外植體要肥皂水清洗再以清水洗2-3次，再浸入70%酒精消毒，用3%次氯酸鈉處理。最后用無菌水漂洗數次，并用無菌濾紙吸干。 （2）酶解 為除去植物細胞的細胞壁，需經酶解。除菌后的葉片除去下表皮 切塊放入反應液不時輕搖 反應液轉綠。反應液轉綠是酶解成功的一項重要指標，說明已有不少原生質體游離在反應液中。 （3）分離 在反應液中除了大量的原生質體外，還有一些殘留的組織塊和破碎的細胞。為取得高純度的原生質體需進行原生質體的分離。可采用過濾法、低速離心法或比重漂浮法。 （4）洗滌 剛分離得到的原生質體往往還含有酶及其他不利于原生質體培養(yǎng)、再生的試劑，需用新的原生質體培養(yǎng)液離心洗滌2-4次。 （5）鑒定 確認是否已獲得原生質體。比如放入低滲溶液中，很容易脹破的就是原生質體。,融合子的鑒定,雜合細胞的顯微鏡鑒別：根據兩親本原生質體的形狀和結構的差異來鑒別雜合體。如一方細胞基本無色，另一方為綠色，則白綠色結合的細胞就是雜合細胞。 互補法篩選雜合細胞 ：在獲得各種遺傳突變細胞株系的前提下，可用遺傳互補法來篩選雜合子。如甲細胞株缺外源激素A不能生長，乙細胞株需要提供外源激素B才能生長，則甲株與乙株融合，雜合細胞在不含激素A、B的選擇培養(yǎng)基上可以生長。 細胞與分子生物學的方法鑒別雜合體：分子生物學的方法，如染色體核型分析、限制性內切酶片段長度多態(tài)性等分析融合子，以確定其是否結合了雙親本的遺傳素質。 融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征：表型上是否結合了雙親本的遺傳素質。,三、動物細胞工程及其在食品工業(yè)中的應用,1. 動物細胞工程概述 動物細胞工程所涉及的主要技術有組織培養(yǎng)、細胞融合、細胞拆合、染色體或染色體組轉移，以及基因轉移等方面，是從細胞結構的不同層次，也就是說從細胞整體水平、核質水平、染色體水平，以及基因水平上來對細胞進行遺傳操作的。 根據目前動物細胞工程的發(fā)展現況，技術中最成熟、影響也最大的當數細胞融合。其中淋巴細胞雜交瘤在國內外均已普遍開展，其產物單克隆抗體已進入產業(yè)化的生產階段。,2. 動物細胞工程在食品相關領域中的應用,有害物質快速檢測 人工合成產品，以及生產過程中排出的廢水、廢氣、廢渣中所含的化學物質，這些種類繁多的物質，通過呼吸、飲食和體表接觸等途徑攝入體內，其中有些會直接危害健康，有些會對人類的遺傳有潛在的危險。因此，有必要從存在于人們生活和工作環(huán)境中的大量化學物質中，迅速、準確而又簡便地鑒別出哪些是有害的，以采取有效的措施減少或消除人們接觸這類物質的機會。傳統(tǒng)的檢測方法是用動物試驗。由于腫瘤有物種特異性，所以需要同時用幾種動物進行試驗。而且一次實驗要用大量動物。并且，動物的世代較長。目前在人類環(huán)境中的化學物質至少有六、七萬種，每年還有上千種新合成的化合物進入人類社會。 利用動物試驗來檢測遺傳效應遠遠不能適應工業(yè)發(fā)展的需要。目前已建立了多種快速檢測方法，其中之一就是利用離體培養(yǎng)的哺乳動物細胞和人體細胞為材料，可以彌補動物試驗費時長、花錢多、收效慢等不足之處。,四、植物細胞工程及其在食品工業(yè)中的應用,1.植物細胞工程概述 植物細胞工程主要包括原生質體的培養(yǎng)技術、植物細胞雜交技術、植物單倍體的培養(yǎng)技術等。 單倍體生物是指細胞中僅含一組染色體的個體。由于它們種質純、不受顯性等位基因的掩蓋，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體。不過，自發(fā)產生單倍體株的幾率很低，小于千分之一。可以通過實驗室的誘導，大量培育出符合需要的單倍體植株。,2.植物細胞工程在食品工業(yè)中的應用,（1）利用植物細胞工程生產香料 利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術已能生產許多種香料物質。如在洋蔥細胞培養(yǎng)中，從蒜堿酶抑制劑羥基胺中提取出了香料物質的前體-烷基半胱氨酸磺胺化合物。 （2）生產食品添加劑 利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術已能生產較多的天然食品添加劑。如甜味劑-甜葉苷，此