王清洪低氧模擬劑氯化鈷.ppt

低氧模擬劑氯化鈷對胃癌細(xì)胞BGC823中S100A4基因表達(dá)的影響,王清洪 制作 學(xué)號：092406102,摘要,S100A4基因是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因, 該基因高表達(dá)與胃癌浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌細(xì)胞體外侵襲力密切相關(guān)。,為探討S100A4基因高表達(dá)的機(jī)制, 用低氧模擬劑氯化鈷處理胃癌細(xì)胞BGC823, RT-PCR、免疫組化、免疫熒光及Western blotting方法分別檢測BGC823細(xì)胞中S100A4 mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 氯化鈷處理胃癌BGC823細(xì)胞后, S100A4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。,提示低氧模擬劑氯化鈷可促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC823中S100A4 基因表達(dá)。,低氧是實體腫瘤的共同特征, 它是癌細(xì)胞快速增殖與血液供應(yīng)相對滯后的結(jié)果。低氧引起腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變, 如細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增加, 并可能對放化療產(chǎn)生耐受。低氧對細(xì)胞的影響主要通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)而實現(xiàn), 因此研究低氧環(huán)境下轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)變化具有重要意義。,S100A4蛋白是鈣離子結(jié)合蛋白S100家族的成員之一, 可降低腫瘤細(xì)胞間黏附能力、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)水解和重塑、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運動能力、促進(jìn)血管生成等, 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用?，F(xiàn)已證實S100A4高表達(dá)與胃癌浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌細(xì)胞體外侵襲力密切相關(guān), 但是目前關(guān)于S100A4表達(dá)調(diào)控的研究報道甚少。低氧是否可調(diào)節(jié)S100A4表達(dá), 尚未見報道。,我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件在S100A4 基因的調(diào)控區(qū)預(yù)測到低氧反應(yīng)元件, 推測微環(huán)境低氧可能上調(diào)S100A4 基因表達(dá)。因此本實驗觀察了低氧模擬劑氯化鈷處理對人胃癌細(xì)胞系BGC823中S100A4表達(dá)的影響, 旨在研究微環(huán)境低氧對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制, 并探討S100A4基因表達(dá)調(diào)控的新途徑。,材料和方法,主要材料: BGC823細(xì)胞系; RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清; 氯化鈷; 兔抗人S100A4 多克隆抗體; b-actin抗體; 總RNA 提取試劑Trizol; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒; PCR引物。,細(xì)胞培養(yǎng)和低氧誘導(dǎo): 取低分化的人胃腺癌細(xì)胞系BGC823, 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液, 另加青霉素 (100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL), 37、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長至60%70%融合度后, 實驗組加入含低氧模擬劑氯化鈷(終濃度為100500 mmol/L)的培養(yǎng)基, 對照組為正常培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。,方法,RT-PCR檢測BGC823細(xì)胞中S100A4 mRNA表達(dá),收集實驗組和對照組細(xì)胞, 應(yīng)用 Trizol提取總RNA, 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, 取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 mL進(jìn)行PCR反應(yīng)。S100A4引物序列: 上游: 5-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3; 下游: 5-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3。,擴(kuò)增片段長度為277 bp, 復(fù)性溫度為58; 內(nèi)參照b-actin引物序列: 上游: 5- CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3; 下游: 5- TTGAAGGTA GTTTCGTGGAT- 3。,擴(kuò)增片段長度為480 bp, 復(fù)性溫度為58。循環(huán)條件: 95預(yù)變性5 min, 94變性30 s, 58復(fù)性30 s, 72延伸30 s, 30個循環(huán), 72延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳, LabWORKS凝膠圖像分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的光密度值, 并通過S100A4光密度值與b-actin光密度值的比值反映S100A4 mRNA表達(dá)量的高低。,Western blotting檢測BGC823細(xì)胞中S100A4蛋白表達(dá),收集實驗組和對照組細(xì)胞, 立即置于冰上,吸凈培養(yǎng)基并以4預(yù)冷的PBS 漂洗細(xì)胞12次, 提取細(xì)胞總蛋白, 以Bradford 法作蛋白定量后, 取 50 mg 蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%積層膠, 10%分離膠),電轉(zhuǎn)膜后, 加入兔抗人S100A4 多克隆抗體( 11000 )和羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體, b-actin作為內(nèi)參照,利用ECL顯色試劑盒顯色, 應(yīng)用圖象分析儀測定條帶光密度值, 以S100A4光密度值與b-actin光密度值的比值來反映S100A4蛋白表達(dá)的高低。,免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光檢測S100A4蛋白在BGC823細(xì)胞中的表達(dá),將BGC823細(xì)胞接種于玻片上, 200 mmol/L氯化鈷處理24 h后, 取出玻片, 4%甲醛固定。一抗為兔抗人S100A4多克隆抗體(11000稀釋), 4孵育過夜。免疫組化采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司SP檢測試劑盒進(jìn)行, DAB顯色, 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果; 免疫熒光二抗為FITC標(biāo)記的鼠抗兔IgG(12000稀釋), 室溫孵育2 h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。,統(tǒng)計學(xué)分析,采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行檢驗, P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。,結(jié)果與分析,氯化鈷對BGC823細(xì)胞S100A4 mRNA表達(dá)的影響 氯化鈷對BGC823細(xì)胞S100A4蛋白表達(dá)的 影響 免疫組化和免疫熒光檢測S100A4在BGC823細(xì)胞中的表達(dá),RT-PCR結(jié)果顯示, 不同濃度氯化鈷處理24 h后, BGC823細(xì)胞中S100A4 mRNA表達(dá)改變?nèi)缦? 100 mmol/L、500 mmol/L氯化鈷處理后, S100A4 mRNA表達(dá)無明顯變化, 200 mmol/L氯化鈷處理后S100A4 mRNA表達(dá)明顯升高。采用200 mmol/L氯化鈷處理細(xì)胞重復(fù)實驗3次, 結(jié)果顯示實驗組mRNA表達(dá)(1.55670.2676)顯著高于對照組(0.82670.1850)(P0.05), 可見200 mmol/L 氯化鈷處理可以使S100A4 mRNA表達(dá)顯著增高。,氯化鈷對BGC823細(xì)胞S100A4 mRNA表達(dá)的影響,氯化鈷對BGC823細(xì)胞S100A4蛋白表達(dá)的 影響,Western blotting結(jié)果顯示, 200 mmol/L CoCl2處理24 h后, S100A4蛋白表達(dá)明顯增高, 實驗組S100A4蛋白表達(dá)(1.66330.3496)顯著高于對照組(0.73000.1868)(P 0.05)。,免疫組化和免疫熒光檢測S100A4在BGC823細(xì)胞中的表達(dá),免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示, 氯化鈷處理后S100A4蛋白表達(dá)明顯高于對照組。,討 論,近年來微環(huán)境低氧與腫瘤的關(guān)系倍受關(guān)注, 低氧通過調(diào)控多種基因表達(dá)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。為探討低氧對胃癌細(xì)胞中S100A4表達(dá)是否具有調(diào)控作用, 本實驗首先應(yīng)用不同濃度低氧模擬劑氯化鈷對胃癌BGC823細(xì)胞進(jìn)行體外模擬低氧處理, RT-PCR結(jié)果顯示:,氯化鈷處理后S100A4蛋白表達(dá)較對照組明顯增高, 表明微環(huán)境低氧可使胃癌細(xì)胞S100A4基因表達(dá)增高; 而S100A4作為一種重要轉(zhuǎn)移相關(guān)基因, 其高表達(dá)可使胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生變化, 如侵襲轉(zhuǎn)移等能力增加, 因而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展, 可見S100A4是低氧對胃癌細(xì)胞影響的一個重要介導(dǎo)者。,本研究首次證明低氧模擬劑氯化鈷處理可以使胃癌細(xì)胞BGC823中S100A4基因表達(dá)增高, 該結(jié)果加深了低氧對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移影響分子機(jī)制的認(rèn)識, 同時也發(fā)現(xiàn)了S100A4 基因表達(dá)調(diào)控的新途徑-微環(huán)境低氧。該結(jié)果為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治研究提供了重要科學(xué)依據(jù), 也為其他腫瘤的研究提供了新思路。,參考文獻(xiàn),1 Graham CH, Forsdike J, Fitzgerald CJ, Macdonald- Goodfellow S. 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