《MSI檢測技術》PPT課件.ppt

MSI 檢測技術,微衛(wèi)星簡要介紹 現(xiàn)用微衛(wèi)星檢測技術流程 多重熒光PCR技術概略介紹 毛細管電泳概略介紹 微衛(wèi)星檢測的臨床檢測可行性,MSI 檢測技術摘要,MS,Simple repeat sequences of 1 to 6 base pairs 單核苷酸型:AAAAAAAA 雙核苷酸型:ATATATAT 三核苷酸型:ATCATCATC .,MS,Prone to replication errors,Defection of MMR,MS instability,LS,Sporadic MSI,LS,MS,錯誤產生機制,Stutter 又被稱為影子帶，或者DNA聚合酶滑脫產物。表現(xiàn)為PCR產物比主要擴增產物增加或減少一個或幾個重復單位。,MSI MAKERS IN LS,National Cancer Institutesponsored workshop in 1997 2 mononucleotide repeats(BAT25 and BAT26) 3 dinucleotide repeats (D2S123,D5S346, and D17S250) Revised in 2002 5 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,NR-21, NR-22, and NR-24) Promega MSI Analysis System 5 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,MONO-27, NR-21 and NR-24） 2 pentanucleotide repeats(Penta-C and Penta-D),criteria,MSI-H Replication errors2 makers MSI-L 1 MSS 0,實驗流程,1、基因DNA的提取 2、多重熒光PCR 3、毛細管電泳檢測 4、分析數(shù)據(jù),基因DNA的提取流程,Promega試劑盒法,分別挑選正常、腫瘤組織,顯微切割,多重熒光PCR,Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,上游引物的5端作熒光標記,JOEGreen FL Blue TMRBlack,多重熒光PCR,PCR反應體系（25l）： 2.5l GoldSTR 10X Buffer 0.1-1 M each primers 0.05 l AmpliTaq Gold DNA Polymerase(5Units/ l) 1-2ng DNA PCR條件：1 cycle 95C for 11minutes; 1 cycle 96C for 1 minute; 10 cycles 94C for 30 sec-onds, ramp 6 seconds to 56C, hold for 30 seconds,ramp 50 seconds to 70C, hold for 45 seconds; 20 cycles at 90C for 30 seconds, ramp 60 seconds to 56C,hold for 30 seconds, ramp 50 seconds to 70C, hold for45 seconds; 60C for 30 minutes final extension; 4C hold.,Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,毛細管電泳檢測、分析,微衛(wèi)星位點經(jīng)過熒光標記PCR擴增后，取適量PCR產物、分子內標(ILS 600)溶于緩沖液（甲酰胺）中經(jīng)遺傳分析儀毛細管電泳進行掃描，通過檢測片段長度來判斷微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。 利用Genescan和Genetyper軟件進行圖像收集和分析，計算出微衛(wèi)星等位變異擴增片段的大小。,Promega MSI Analysis System, Version 1.2,橫坐標代表片段長度 縱坐標代表熒光強度,多重熒光PCR優(yōu)點,多重PCR技術是指在一個單一反應體系中加入一對以上的特異引物對，同時擴增多個序列，從而產生高度特異性的反應過程，該技術對DNA模板要求量小、高通量分析且省時、省力、省材。 應用不同熒光標記可以解決不同PCR擴增位點長度的重疊，極大的提高效率。,多重熒光PCR前提條件,所有引物對的退火溫度必須接近； 在同一反應體系中，所有引物對之間不能有相互作用（形成引物寡聚體）； 同色引物擴增產物應長度有別，這樣才可同時對多個位點進行片段分析。,清洗毛 細管,更換電泳 緩沖液,進樣,電泳并同時 在線檢測,操作步驟,毛細管電泳優(yōu)點,熒光標記毛細管電泳(FCE) 快速、準確、敏感性強、可重復性好、結果易分析、高通量檢測、客觀性強 聚丙烯凝膠電泳加放射顯影或銀染 (傳統(tǒng)方法）費時、步驟繁瑣、判斷結果主觀性較強,MSI 直腸癌的臨床檢測可行性,99% con-cordance with IHC Nearly 100% accuracy Lower cost bacause of the use of a single multiplex fluorescent MSI assay Find out those misclassified only based on IHC (about 5% MSI-H tumors had normal levels of four MMR proteins ),Disease Markers 20 (2004) 237250 Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan,關于突變的一些概念,Germline mutation ：由父母傳給后代的突變，由于此種突變發(fā)生在精細胞和卵細胞中，故稱為生殖系突變。 Consititutive mutation :突變發(fā)生在配子或合子過程中，并且這種突變在合子分裂