蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定.pptVIP

第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定,第一節(jié) 概述 1，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)： 是構(gòu)成細(xì)胞的組成成分：細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器上的結(jié)構(gòu)蛋白或酶，染色體中的核蛋白，血液中的血紅蛋白，也是激素和抗體的基本成分。 2， 擔(dān)當(dāng)重要的生理功能： 是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織時(shí)所需氨基酸的來(lái)源， 物質(zhì)代謝的生物催化劑， 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氣體的運(yùn)輸 遺傳信息的傳遞與表達(dá) 人體內(nèi)的組質(zhì)液pH（健康pH在7.37.5之間）及水分的平衡 為免疫系統(tǒng)制造對(duì)抗細(xì)菌和感染的抗體； 一般認(rèn)為成人每人每天營(yíng)養(yǎng)需要量為：75克蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)的組成: 蛋白質(zhì)由很多的AA單體以肽鍵結(jié)合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的含氮有機(jī)化合物，有的含有P、S、 Cu、Fe、I等元素，分子量高達(dá)數(shù)萬(wàn)數(shù)百萬(wàn)。含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其它有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 蛋白質(zhì)系數(shù)：一般而言，蛋白質(zhì)含氮量約為16%，即1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。 氨基酸的種類: 自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的氨基酸約有170多種，其中組成蛋白的氨基酸只有22種（都是-AA），其中對(duì)人而言的必需氨基酸有8種（犬的必需氨基酸有9種）。 組成蛋白的氨基酸（-AA）的通式及AA兩性電解質(zhì)特性：,部分食品的蛋白質(zhì)含量,谷類和面食： （%） 大米（糙米、長(zhǎng)粒、生） 7.9 大米（白米、長(zhǎng)粒、生） 7.1 小麥粉（整粒） 13.7 玉米粉（整粒、黃色） 6.9 玉米淀粉 0.3 豆類： 大豆（成熟的種子、生） 36.5 豆（腰子狀、所有品種） 23.6 豆腐（生、普通） 8.1 水果和蔬菜： 蘋果（生、帶皮） 0.2 蘆筍（生） 2.3 草莓（生） 0.6 萵苣（冰、生） 1.0,肉、家禽、魚： 牛肉（頸肉、烤前腿） 18.5 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 雞（可供煎炸的雞胸肉、生） 23.1 火腿（切片、普通的） 17.6 雞蛋（生、全蛋） 12.5 魚（太平洋鱈魚、生） 17.9 魚（罐裝金槍魚滴干的固體） 26.5 乳制品： 牛乳（全脂、液體） 3.3 牛乳（脫脂、干） 36.2 干酪 24.9 酸奶（普通的、低脂） 5.3,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)（對(duì)人類而言）,必需氨基酸： 在組成蛋白的氨基酸中，在人體內(nèi)不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人類而言,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的定義: l 蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量高,且總體氨基酸的組成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白質(zhì)。動(dòng)物來(lái)源和豆類食品是很好的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。 一般而言：動(dòng)物性蛋白所含必需氨基酸的種類及數(shù)量較多,而植物性蛋白所含必需氨基酸的種類及數(shù)量較少。,若蛋白質(zhì)或某些必需氨基酸供給不足： l 會(huì)導(dǎo)生物體生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，體重減輕，抵抗力下降，容易患病； l 男性精液品質(zhì)下降，精子數(shù)量減少，性欲降低； l 女性引起不孕，即使懷孕，胎兒也常發(fā)育不良而發(fā)生死胎或畸胎。 開發(fā)蛋白質(zhì)的生理效價(jià)高的食品及合理配膳等 是食品科學(xué)從業(yè)者的一項(xiàng)重要任務(wù)！,常用的蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定方法,常用的蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定方法： 蛋白質(zhì)含量測(cè)定最常用的方法是凱氏定氮法，準(zhǔn)確、操作較費(fèi)時(shí)，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。 雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法等也常用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定，由于方法簡(jiǎn)便快速，故多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。 另外，國(guó)外采用近紅外分析儀，利用波長(zhǎng)在0.753m范圍內(nèi)的近紅外線具有被蛋白質(zhì)組分吸收及反射的特性，建立了近紅外光譜快速定量方法。 在一般的常規(guī)檢驗(yàn)中多進(jìn)行氨基酸總量的測(cè)定，通常采用酸堿滴定法來(lái)完成。 本章重點(diǎn)： 凱氏定氮法的原理及注意事項(xiàng)，雙縮脲法、印三酮法及氨基酸自動(dòng)分析儀的原理及注意事項(xiàng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法，氨基酸總量的測(cè)定。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測(cè)定,考馬斯亮藍(lán)法 (Stain with Coomassie blue)：考馬斯亮藍(lán)法靈敏度比氨基黑高五倍，尤其適用于SDS電泳的微量蛋白質(zhì)的染色。在549nm有最大吸收值，蛋白質(zhì)在110g呈線性關(guān)系?？梢詸z測(cè)出0.1 ug 的蛋白質(zhì)條帶. 但銀染法可以檢測(cè)出 2 ng的蛋白質(zhì)條帶.,Coomassie Blue STAINING PROCEDURES,1. Reagents Coomassie Blue R-250 Methanol Glacial acetic acid 2. Gel Stainning solution, 1 L 1.0 g Commassie Blue R-250 450 ml water 450 ml methanol 100 ml Glacial acetic acid 3. Gel destaining solution, 1 L 100 ml Methanol 100 ml Glacial acetic acid 800 ml Water 4. Staining Procedure 1. Pick up the gel into (20 ml, usually enough) Staining solution in a container and agitate for 10 min for 0.75 mm Gel and 20 min and 1.5 mm gel. The staining solution can be reused several times. 2. Take the gel out and rinse the gel with a few changes of water in a new container 3. Add 50 ml destaining solution. Strong bands are visiable immediately on a light box, and 1 hour usually is enough. 4. To destain completely, change destaining solution 2-3 times and agitate overnight. 5. Scan or take photo to record the result.,Coomassie Blue STAINING PROCEDURES,4. 銀染法(Silver staining): can detect as little as 2 ng of protein in a single band in SDS-PAGE Gel. Reagents: Silver nitrate Sodilum hydroxide 30% ammonium hydroxide citric acid 38% formaldehyde Methanol Acetic acid Staining procedure 1. Sock gel in 50% Methanol-10% acetic acid for at least 1 hour with 2-3 chan ges of socking solution 2. Rinse gel with 3 changes of water for total 30 minutes. 3. silver staining for 15 mins 4. Rinse gel with twice in deionized water 5. Develop gel with developing solution 6. stop development by ringsing in 1% acetic acid. 7。 wash gel in water for at least 1 hour.,2DE,2-DE: the technique to separate proteins in the first dimension according to their isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the second dimension according to their molecular weight, by SDS-PAGE. 2-DE combined with protein identification basing on microsequencing, amino acid composition and Mass spectrometry, provides an invaluable tool for proteomic studies. Step 1 Sample Prep Step 2 First-Dimension (IEF) Separation Step 3 Second-Dimension (SDS-PAGE) Separation Step 4 Protein Detection by Staining /Destaining,凱氏定氮法 凱氏定氮法是先測(cè)定總氮量, 然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即可得到粗蛋白質(zhì)含量?？捎糜谒袆?dòng)、植物食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。 凱氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期改進(jìn)，迄今已演變成常量法、微量法、自動(dòng)定氮儀法、半微量法及改良凱氏法等多種，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。在此主要介紹常量凱氏定氮法的原理及步驟。 原理: 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被還原成二氧化硫，樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與過(guò)量的硫酸結(jié)合成硫酸銨; 然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)酸如鹽酸或硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。,催化劑 煮沸,1、消化：NCOC + 濃H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、氨化： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 3、吸收: 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O 4、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ),凱氏定氮法原理（方程式）,凱氏定氮法注意事項(xiàng),圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置 a消化裝置 b蒸餾吸收裝置,1、硫酸鉀 及硫酸銅的作用 2、火候控制 3、裝置的氣密性 4、何時(shí)加堿 5、難消化的 對(duì)策 6、停止蒸餾,說(shuō)明及注意事項(xiàng) 0: 當(dāng)濃硫酸的用量為30ml時(shí)，硫酸銅，硫酸鉀，氫氧化鈉等試劑應(yīng)按比例增加。 所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘附在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮損失。 消化過(guò)程中應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全。 樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并不停地?fù)u動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過(guò)氧化氫23mL后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g，可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量（何時(shí)會(huì)必要？）。 一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。 硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40，否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。 11蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1min后關(guān)掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。 (12)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。,氨基酸的分析,什么是氨基酸? 氨基酸的分類 氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)? 氨基酸的兩性電解質(zhì)的特性,氨基酸的結(jié)構(gòu),氨氨基酸的一般顯色反應(yīng) 茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經(jīng)典的常用顯色法，后一種是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點(diǎn)。 1. 茚三酮法 原理: 氨基酸或蛋白質(zhì)能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物. 步驟： 將點(diǎn)有樣品的層析濾紙充分除盡溶劑， 用5g/L茚三酮無(wú)水丙酮溶液噴霧，充分吹干， 65,30min（空氣中的氨可使背景泛紅色），氨基酸斑點(diǎn)呈紫紅色。 為了使各種氨基酸呈現(xiàn)不同顏色，可用下列方法： 用0.4g茚三酮，10g酚和90g正丁醇的混合液顯色。 用1g/L茚三酮無(wú)水丙酮溶液顯色完畢后，再用鹽酸蒸汽熏1min (HOW ?)。 為了使顯色穩(wěn)定，可用下列方法： (何謂貯存液及工作液?) 貯存液A：醋酸鎘2g、冰醋酸40mL、蒸餾水200mL 貯存液B：茚三酮2g、丙酮200mL 顯色液：A/B=1.2:1 (按需制備) 點(diǎn)有樣品的濾紙上浸有此顯色液后，放置于盛有一小杯濃硫酸的密閉玻璃容器中25，18h，或較高溫度下適當(dāng)縮短時(shí)間。背景色淺，氨基酸斑點(diǎn)也比較穩(wěn)定。拍照記錄!,2吲哚醌法 各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認(rèn)氨基酸。氨對(duì)吲哚醌顯色沒有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對(duì)干燥的環(huán)境中才能保存。 3鄰苯二甲醛法 鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和455nm。在手提式紫外燈(254/365)下觀察. * 鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量.氨基酸紙上層析靈敏度達(dá)0.5moL，在硅膠薄層層析上為0.050.2moL (不嚴(yán)密,因?yàn)楦鞣N氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同,所以因指明是什么AA.) * 各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對(duì)熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。 說(shuō)明 在濾紙上顯現(xiàn)氨基酸時(shí)，鄰苯二甲醛濃度以0.1%為宜。顯色時(shí)必須有一定的濕度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞機(jī)率，并使極性基團(tuán)解離，促進(jìn)反應(yīng)趨于完全。濕度太低，顯不出熒光。溫度對(duì)顯現(xiàn)的熒光延時(shí)有顯著影響，溫度高熒光延時(shí)短，溫度低熒光延時(shí)長(zhǎng)。,個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng) 利用個(gè)別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應(yīng)定性氨基酸可應(yīng)用于紙層析和紙電泳顯色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和羥賴氨酸、羥脯氨酸,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、組氨酸。,氨基酸定量,一、氨基酸的一般定量測(cè)定 （一）甲醛滴定法 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸總量。 反應(yīng)式如下：,3操作方法 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0mL置于200mL燒杯中，加水60mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液mL數(shù)，供計(jì)算總酸含量。 加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)(V1)。 同時(shí)取80mL蒸餾水置于另一200mL潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至pH82，（此時(shí)不計(jì)堿消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)(V2),作為試劑空白試驗(yàn)。 4結(jié)果計(jì)算 氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）= f(V1-V2) 式中：V1樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至pH9.2時(shí)所消耗氫氧化鈉溶液的體積； V2空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至pH9.2時(shí)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 5.說(shuō)明 本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測(cè)定, 渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定, 在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，來(lái)了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。 脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會(huì)消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高,茚三酮比色法 1原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸反應(yīng)成黃色），該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長(zhǎng)為570nm，故據(jù)此可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。 2操作方法 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取相當(dāng)于0、100、200、300、400、500、600g氨基酸(單或混合氨基酸)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25mL容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH為8.04）各1mL，混合均勻，于水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標(biāo)線，搖勻。靜置15min后，在570nm波長(zhǎng)下，以試劑空白為參比液測(cè)定各溶液的吸光度A。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (2)樣品測(cè)定 吸取澄清的樣品溶液14mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測(cè)定吸光度A值，用測(cè)得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得對(duì)應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。 3結(jié)果計(jì)算 4說(shuō)明及注意事項(xiàng) 通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎樣品510g或吸取樣液樣品510mL，置于燒杯中，加入50mL蒸餾水和5g左右活性炭，加熱煮沸，過(guò)濾，用3040mL熱水(磷酸緩沖液效果如何呢?)洗滌活性炭，收集濾液于100mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備測(cè)。 茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行純化.,茚三酮,(四)鄰苯二甲醛法(OPT法) 1原理 鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340和455nm?？赡墚a(chǎn)物為： 各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對(duì)熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，-賴氨酸，酪氨酸，NH3,半胱氨酸和脯氨酸，。 本法可用于測(cè)定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高100倍以上，可測(cè)到0.11104mol氨基酸。如用于血清中-氨基氮的測(cè)定，每次血清用量只需510L。與另一種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無(wú)熒光，只有與氨基酸結(jié)合才產(chǎn)生熒光。缺點(diǎn)是與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用于氨基酸自動(dòng)分析定量分析，但由于試劑昂貴及個(gè)別氨基酸反應(yīng)不滿意，目前還未普遍應(yīng)用。,二、個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定,（二）色氨酸的測(cè)定 原理:樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生成哈爾滿化合物（norharman），具有特征熒光值，可以進(jìn)行定量測(cè)定。反應(yīng)式如下：,（一）賴氨酸的測(cè)定 （二）色氨酸的測(cè)定 （三）苯丙氨酸的測(cè)定 （四）酪氨酸的測(cè)定 （五）脯氨酸的測(cè)定 1原理 在丙酮溶劑中，脯氨酸與吲哚醌反應(yīng)形成藍(lán)色化合物，能用以測(cè)定蛋白質(zhì)水解液中的脯氨酸含量，在一定條件下（包括pH、緩沖液濃度和吲哚醌濃度），可以在其他氨基酸存在下直接進(jìn)行測(cè)定，不受羥脯氨酸的干擾。 (六)羥脯氨酸的測(cè)定 （七）胱氨酸的測(cè)定 （八）谷氨酸的測(cè)定 1原理 L-谷氨酸在大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶作用下脫羧釋放出二氧化碳，由測(cè)壓法測(cè)得二氧化碳放出量，計(jì)算出谷氨酸含量。 附 8種氨基酸： 亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、 蛋氨酸、蘇氨酸、 色氨酸、 纈氨酸,第七節(jié) 氨基酸的分離及測(cè)定,一、薄層色譜法 1原理 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，即可鑒別樣品中所含氨基酸的種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。,D1,D2,A,B,C,如何進(jìn)行TLC刮樣法分離氨基酸,2D TLC,二、氨基酸自動(dòng)分析儀法 1原理 氨基酸的組分分析，現(xiàn)在廣泛地采用離子交換法，并由自動(dòng)化的儀器來(lái)完成。其原理是利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽(yáng)離子交換樹脂在色譜柱上進(jìn)行分離。當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的pH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來(lái)，即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸；摩爾質(zhì)量小的比摩爾質(zhì)量大的先被洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。 定量測(cè)定的依據(jù)是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物（570nm）的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物（440nm），故需在另外波長(zhǎng)處定量測(cè)定。,氨基酸自動(dòng)分析儀 3操作方法 樣品處理： 測(cè)定樣品中各種游離氨基酸含量，可以除去脂肪雜質(zhì)后，直接上柱進(jìn)行分析； 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時(shí)樣品必須經(jīng)酸水解（稱取干燥的蛋白質(zhì)樣品數(shù)毫克，加入2mL5.7mol/L鹽酸，置于110烘箱內(nèi)水解24h，然后除去過(guò)量的鹽酸，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻），使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進(jìn)行分析。 如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進(jìn)行酸水解處理。去雜質(zhì)的方法如下： 去糖和淀粉：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗滌，得蛋白質(zhì)沉淀物。 去脂肪：先把干燥的樣品經(jīng)研碎后用丙酮或乙醚等有機(jī)溶劑離心或過(guò)濾抽提，得蛋白質(zhì)沉淀物。 去核酸：將樣品在100g/L氯化鈉溶液中，85加熱6h，然后用熱水洗滌，過(guò)濾后將固形物用丙酮干燥即可。 去無(wú)機(jī)鹽：樣品經(jīng)水解后含有大量無(wú)機(jī)鹽時(shí)還必須用陽(yáng)離子交換樹脂進(jìn)行去鹽處理。 樣品分析：經(jīng)過(guò)處理后的樣品上柱進(jìn)行分析。上柱的樣品量根據(jù)所用自動(dòng)分析儀的靈敏度來(lái)確定。一般為每種氨基酸0.1mol左右（水解樣品干重為0.3mg左右）。測(cè)定必須在pH55.5、100下進(jìn)行，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間為1015min，生成的紫色物質(zhì)在570nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。而生成的黃色化合物在440nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。 * 顯色反應(yīng)用的茚三酮試劑，隨著時(shí)間推移發(fā)色率會(huì)降低，故在較長(zhǎng)時(shí)間測(cè)樣過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)采用已知濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液上柱測(cè)定以檢驗(yàn)其變化情況。 * 采用反相色譜原理制造的氨基酸分析儀，可使蛋白質(zhì)水解出的17種氨基酸在12min內(nèi)完成分離，且具有靈敏度高（最小檢出量可達(dá)1pmol）、重現(xiàn)性好以及一機(jī)多用等優(yōu)點(diǎn)。,三、氣相色譜法 1原理 將本身沒有揮發(fā)性的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于氣相色譜分析的衍生物三氟乙?；□?。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAA）的?；瘍蓚€(gè)步驟。將?；玫陌被嵫苌镞M(jìn)行氣相色譜分析。 四、高效