反義RNA的原理及其應(yīng)用.ppt

反義RNA的原理及其應(yīng)用實(shí)例,制作人：余萍,反義RNA,反義RNAA( a n t i s e n s e R N A）：一種本身缺乏編 碼能力， 但能與特異靶 R N A( 主要是mR N A) 互補(bǔ)的 R NA分子， 它可通過配對堿基間氫鍵作用與靶 R N A的特定互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物， 抑制靶 RNA的功能， 從而調(diào)控基因的正常表達(dá) 。,基本原理,反義 R N A技術(shù)的基本原理：利用自然存在的或人工合 成的反義 RNA， 通過基因重組技術(shù)反向插入到合適 的表達(dá)載體形成重組DN A， 然后轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞， 則 這一反插入的序列就會隨細(xì)胞周期產(chǎn)生大量反義 R NA， 對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控， 從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達(dá)。,一、復(fù)制水平,DNA復(fù)制 中的作用 反義 R N A作為D N A復(fù)制的抑制因子， 與引物 R N A結(jié)合或作用于引物前體而抑制 D N A復(fù)制，從 而降低D N A的復(fù)制效率。E c o l i 的 c o l e 1 質(zhì)粒復(fù) 制的前提是合成適當(dāng)?shù)腞 N A( R N A) ， 它自動折疊 后與 D N A模板結(jié)合形成 D N A復(fù)制的引物， 從復(fù)制起始點(diǎn)上游一4 4 5 b p 處開始， 以另一 D N A為模板反 向轉(zhuǎn)錄的RN A I正好與 RNA1 I的結(jié)合， 阻止了正 常引物的產(chǎn)生， 從而干擾復(fù)制的進(jìn)行。,作用機(jī)制,反義 R N A的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在D N A復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄 和翻譯 3個(gè)水平上。,二、轉(zhuǎn)錄水平,轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的作用 反義 R NA與 m RNA 5 末端互補(bǔ)結(jié)合， 阻斷帽 子結(jié)構(gòu)形成； 作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)， 阻礙前 m R N A剪接； 作用于 p o l y A形成位點(diǎn)， 阻礙 mRN A的成熟及其向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。在 c r p 基因的t i c R NA ( t r a n s c r i p t i o n i n h i b i t o r y c omp l e me n t a r y RNA) 負(fù) 向 自我調(diào)控中， t i c R N A與 e r p m R N A的 5 端結(jié)合， 形 成類似于R N A聚合酶識別的轉(zhuǎn)錄終止信號的二級 結(jié)構(gòu)， 以反式作用對轉(zhuǎn)錄過程本身進(jìn)行調(diào)控 J,三、翻譯水平,翻譯水平的作用 反義 R NA可直接與 m R N A的 S D序列( 含 R B S ) 或編碼區(qū)( 主要是 A U G) 結(jié)合， 從空間上直接 阻止核糖體的正常結(jié)合或可直接降解靶 mR N A。 反義R N A與 m R N A在 S D序列配對形成吻觸復(fù)合體或在互補(bǔ)區(qū)段結(jié)合形成 R N AR N A雙鏈結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控翻譯的進(jìn)行。在真核生物細(xì)胞中有許多 R N A在翻譯水平上表現(xiàn)反義R N A的功能。如雞胚 胎肌漿中存在的富含 U的小分子 R N A稱為 t c RNA， 它們可以與肌球蛋白重鏈的 RN A的 p o l y A尾雜交而抑制正常的翻譯過程。A u d r e y等 J 的研究表明 F GFAS R NA在翻譯過程能有效地抑制F GF一2在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。,反義 RNA的重組 DNA中只有啟動子及終止子， 當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， 重組 D N A能 自動表達(dá)反義R N A， 并且重組 D NA自身可以整合到宿主的基因組 D NA中， 或作為“ 附加體” 長期存在。在原核細(xì)胞中， 反義 R N A以針對 S D序列效果最好， 而在真核細(xì)胞中以5 端非編碼區(qū)為標(biāo)靶最有效。,反義RNA的應(yīng)用,隨著基因組草圖的完成, 人們研究的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ艿难芯? 反義核酸技術(shù)無疑為這項(xiàng)宏偉的工程提供了一種有力的工具。,抗病毒作用,病毒是 對人 和動植 物危 害極大 的病原體 ,然而對病毒引起 的疾病的治療 ,目前 尚無特效藥物與方法。反義 R N A 卻能特異性阻斷病毒基因表達(dá) 和抑制病毒的復(fù)制 ,從而激起許多科學(xué)工作者去探索反義 R N A 治療病毒性疾病的有效方法?？共《痉戳x R N A 技術(shù)是將特定的病毒基因反 向插人到表達(dá)險(xiǎn)載體中,以構(gòu)建反義 R N A 表達(dá)載體 ,再將重組體導(dǎo)人真核細(xì)胞(病毒宿主細(xì)胞)中表達(dá)特異性反義 R N A,從而抑制特異有 害基 因的表達(dá)或抑制病毒復(fù)制。文獻(xiàn)報(bào)道 ,運(yùn)用反義 R N A技術(shù) 己經(jīng)成功地抑制疤病毒 、流感病毒 、人類免疫缺陷病毒 (H I V )等對培養(yǎng)的組織細(xì)胞的侵襲。用針對植物病 毒的反義 R N A 已培育出具有抗病毒能力 的植 物。,姚志強(qiáng)等針對不同靶位設(shè)計(jì)了1 0 段互補(bǔ)反義核酸( D NA片段) ， 經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對S基因起始區(qū)、 S P 2增強(qiáng)子帽區(qū)和 p o l y A信號編碼區(qū)的a s O Ns 作用最強(qiáng)， 揭示反調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。 G a b o r 等( 1 9 9 8 ) 使用內(nèi)源性表達(dá)抗HI V一1po1 vif和 enr 基因，以及 3 L T R序列的反義 R N A方案， 構(gòu)建了 Mu L V L T R啟動子逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)錄 C D 4 淋巴細(xì)胞系， 結(jié)果表明反義 R N A能高效地穩(wěn)定表達(dá)， 反義 e n v R N A能夠最有效地抑制HI V一1 的復(fù)制， 并且反義 p o l R NA使P 2 4 抗原減少 了 1 0 01 0 0 0倍。 另外， 國內(nèi)外在應(yīng)用反義R N A技術(shù)培育抗病( 如豬瘟、抗雞馬立克氏病等) 動物品系方面也取得比較明顯的進(jìn)展。,反義 R N A 的抗腫瘤作用,腫瘤 的發(fā)生是多因素引起的,其中細(xì)胞癌基因或/和某些病毒癌基因的異常激活和過度表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)胞惡變的原因之一。如何控制細(xì)胞有害基 因的表達(dá)而在基因水平上治療惡性腫瘤呢? 在目前基 因治療的眾多方案中,反義R N A 技術(shù)是 最具吸引力的手段之一?？梢栽O(shè)計(jì)出針對腫瘤細(xì)胞 的癌基因、突變基因 、非正常表達(dá)基因及某些腫瘤相關(guān)病毒的癌基因反義 R N A,以阻斷這些有害基因的表達(dá) ,達(dá)到治療腫瘤的目的。許多證據(jù)表明,反義R N A 可使腫瘤 細(xì)胞的表型逆轉(zhuǎn) ,形態(tài)變化 ,增殖速度減慢,生存期縮短,軟瓊脂中克隆能力下降及體內(nèi)成瘤能力減弱等,而不影響細(xì) 胞生存所必需的其它基因的表達(dá)。,Tr o j a n 等利用 E B 病毒游離體表達(dá)載體克隆胰島素樣生 長因子 ( I G F )反 義基因 ,將此重組體轉(zhuǎn)染 大鼠 C 6 細(xì)胞系,在大鼠模型上實(shí)現(xiàn)了膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤的基因治療和預(yù)防。 我國學(xué)者趙曉航等報(bào)道互補(bǔ)于 G r n yc基 因第二外顯子及其兩側(cè)序列的反義 R N A 能特異性誘發(fā)人食管癌細(xì)胞程序性死 亡。 黃 賢 明等利用 G e t s一2、G m y c和 N一r as三個(gè)癌基 因聯(lián)合反義 R N A 能使人肝 癌細(xì) 胞 株 S M M C 77 2 1 生長速率下降約70 %,軟瓊脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力顯著下降,提示針對多個(gè)癌基 因的聯(lián)合反義R N A 可能給腫瘤基因治療提供新的途徑。,反義 RNA技術(shù)還可用于腸道疾病( R o t b a r t e t a 1 ， 1 9 8 8 ) 、 心血管疾病、 B 一地中海貧血、 調(diào)節(jié)衰弱心臟中肌細(xì)胞的 C a2 泵體內(nèi)平衡u 、 G蛋白防止高血壓、 肝纖維化等多種疾病的研究。,參考文獻(xiàn) 1 張西鋒，沈偉,潘慶杰,白丁平，耿社 民反義 R NA技術(shù)原理及其在疾病治療中的應(yīng)用 J .萊陽農(nóng)學(xué)院