GB15193.7-2003小鼠精子畸形試驗(yàn).pdf

I C S 0 7 . 1 0 0C 5 3中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB 1 5 1 9 3 . 7 -2 0 0 3 代替 G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4小鼠 精子畸 形試驗(yàn)Mi c e s p e r m a b n o r ma l i t y t e s t2 0 0 3 - 0 9 - 2 4發(fā)布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 實(shí)施華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 化 管 理 委 員 會(huì)發(fā) 布中中GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3月 IJ舌本標(biāo)準(zhǔn)全文強(qiáng)制。本標(biāo)準(zhǔn)代替G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 相比主要修改如下:在“ 范圍” 中增加了受試物的具體內(nèi)容: 食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運(yùn)輸和銷售過(guò)程中所涉及的可能 對(duì)健康造成危害的化學(xué)、 生物和物理因素， 檢驗(yàn)對(duì)象包括食品添加劑( 含營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑) 、 食品新 資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設(shè)備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等;在“ 劑量及分組” 中: 在高劑量組的設(shè)計(jì)方法中增加“ 急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量( 最大 使用濃度和最大灌胃 容量) 動(dòng)物無(wú)死亡而求不出L D。 時(shí)， 則按以下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人的可能攝人量的1 0 。 倍; 或 c ) 一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)，:在“ 操作步驟” 中: 增加了“ 受試物配制” 的內(nèi)容;將“ 鏡檢” 改為“ 閱片” ， 內(nèi)容分列為: “ 閱片要求” 、 “ 精子畸形的類型” 和“ 閱片注意事項(xiàng)” 三部分;- “ 統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果判定” 分列為“ 數(shù)據(jù)處理” 和“ 結(jié)果判定”自 本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施之日 起， G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 同時(shí)廢止。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所、 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人: 徐晉康、 龔幼菊、 陳似蘭。本標(biāo)準(zhǔn)于 1 9 9 4 年首次發(fā)布， 本次為第一次修訂。GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3小鼠精子畸形試驗(yàn)范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小鼠精子畸形試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運(yùn)輸和銷售過(guò)程中所涉及的可能對(duì)健康造成危害的化學(xué)、生物和物理因素的遺傳毒性， 檢驗(yàn)對(duì)象包括食品添加劑( 含營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑) 、 食品新資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設(shè)備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等。2 原理 小鼠精子畸形受基因控制， 具有高度遺傳性， 許多常染色體及 X , Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常， 已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。小鼠精子畸形試驗(yàn)可檢測(cè)環(huán)境因子對(duì)精子生成、 發(fā)育的影響， 而且對(duì)已知的生殖細(xì)胞致突變物有高度敏感性， 故本試驗(yàn)可用作檢測(cè)環(huán)境因子在體內(nèi)對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用 。3 儀器與試劑 全部試劑除注明外， 均為分析純， 試驗(yàn)用水為蒸餾水3 . 1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。3 . 2 生物顯微鏡。3 . 3 甲醇。3 . 4 1 %-2 % 伊紅染色液: 稱取伊紅1 g ,2 g , 溶于1 0 0 m L 蒸餾水備用。4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性小鼠, 6 周8 周齡、 體重 2 5 g -3 5 g 。動(dòng)物購(gòu)買后適應(yīng)環(huán)境 3 天一5 天。5 劑量及分組 受試物應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組， 最高劑量組原則上為動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和/ 或個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量 一般可取 1 1 2 L D s， 低劑量組應(yīng)不表現(xiàn)出毒性， 分別取 1 / 4和1 / 8 L D s 作為中、 低劑量。急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量( 最大使用濃度和最大灌胃容量) 動(dòng)物無(wú)死亡而求不出L D s 。 時(shí)， 高劑量組則按以下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人的可能攝人量的1 0 。 倍; 或c ) 一次最大灌胃劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)， 再下設(shè)中、 低劑量組。另設(shè)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。每組至少有 5 只存活動(dòng)物。陽(yáng)性物可采用環(huán)磷酞胺4 0 m g / k g 體重一6 0 m g / k g 體重、 甲基磺酸甲醋( MMS ) 5 0 m g / k g體重或絲裂霉素C ( MMC ) 1 . 0 m g / k g體重一1 . 5 mg / k g體重經(jīng)口或腹腔注射( 首選經(jīng)口) 給予6 操作步驟6 . 1 受試物配制 一般用蒸餾水作溶劑， 如受試物不溶于水， 可用食用油、 醫(yī)用淀粉、 梭甲基纖維素等配成乳化液或懸濁液受試物應(yīng)于灌胃前新鮮配制， 除非有資料表明以溶液( 或懸濁液、 乳濁液等) 保存具有穩(wěn)定性6 . 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 5 7GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3 經(jīng)口給予， 連續(xù) 5 天。各種致突變物作用于精子的不同發(fā)育階段， 可在接觸某種致突變物后不同時(shí)間出現(xiàn)精子畸形， 故有條件時(shí)， 可于給受試物后第 1 , 4 , 1 0 周處死動(dòng)物， 檢查精子形態(tài)。因?yàn)榇蟛糠只瘜W(xué)致突變物對(duì)精原細(xì)胞后期或初級(jí)精母細(xì)胞早期的生殖細(xì)胞較為敏感， 故一般均是于首次給受試物后的第 3 5 天處死。6 . 3 標(biāo)本制備 用頸椎脫臼法處死小鼠， 取出二側(cè)副肇， 放人有適量生理鹽水( 約 1 m L ) 的小燒杯中或放人盛有2 m L生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副肇縱向剪 1 刀一2 刀， 靜止 3 m i n -5 m i n， 輕輕搖動(dòng)。用四層擦鏡紙或合成纖維血網(wǎng)袋過(guò)濾， 吸濾液涂片。空氣干燥后， 用甲醇固定5 m i n以上干燥， 用1 % - 2 %伊紅染色1 h ， 用水輕沖， 干燥。6 . 4 閱片6 . 4 . 1 閱片要求 在低倍鏡下( 用綠色濾光片) 找到背景清晰、 精子重疊較少的部位， 用高倍鏡順序檢查精子形態(tài)， 計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子。 精子有頭無(wú)尾( 輪廓不清) 或頭部與其他精子或碎片重疊， 或明顯是人為剪碎者， 均不計(jì)算， 每只動(dòng)物至少檢查1 0 0 0 個(gè)精子6 . 4 . 2 精子畸形的類型 精子畸形， 主要表現(xiàn)在頭部， 其次為尾部。畸形類型可分為無(wú)鉤、 香蕉形、 胖頭、 無(wú)定形、 尾折疊、 雙頭、 雙尾等。6 . 4 . 3 閱片注意事項(xiàng) 異常精子均應(yīng)記錄顯微鏡的坐標(biāo)數(shù)， 以備復(fù)查。并分別記錄異常類型， 以便統(tǒng)計(jì)精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。判斷雙頭、 雙尾畸形時(shí)， 要注意與兩條精子的部分重疊相鑒別， 判斷無(wú)定形時(shí)要與人為剪碎及折疊相鑒別。7 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)劑量組應(yīng)分別與相應(yīng)