質(zhì)粒DNA的提取和鑒定.ppt

第一部分 堿裂解法提取質(zhì)粒,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。,提純的思路,質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA 要去除的物質(zhì)： 蛋白 基因組DNA 脂類及小分子雜質(zhì) RNA,二、實(shí)驗(yàn)原理,堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。 堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）,三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑,（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋 （二）材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基 （三）試劑： 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTrisHCl（pH8.0）10mM EDTA 作用:分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鮮配制） 作用:細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解,核酸和蛋白質(zhì)變性。 溶液III 5M KAC 作用:酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS線性DNA沉淀， K可中和DNA,平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫） 注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。 無(wú)水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀 TE緩沖液：溶解DNA,三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑,1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g離心30秒。 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 3、菌體沉淀重懸浮于100l溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。 4、加入新配制的200l溶液, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴5分鐘。 5、加入150l預(yù)冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4下12000g離心5-10分鐘。,四、操作步驟,四、操作步驟,6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4下12000g離心5分鐘。 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g離心5-10分鐘。 9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。 10、將沉淀溶于20l TE緩沖液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20冰箱中。,堿裂解法流程圖,對(duì)數(shù)期菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,質(zhì)粒DNA溶液,五、注意事項(xiàng)材料準(zhǔn)備,使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）,五、注意事項(xiàng)細(xì)胞裂解,菌體量適當(dāng)。 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。 變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。 復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染。 G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。,五、注意事項(xiàng)核酸分離、純化,采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法,五、注意事項(xiàng)核酸沉淀、溶解,當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥） 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,菌體老化 堿裂解不充分 菌體中無(wú)質(zhì)粒 溶液使用不當(dāng),請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng) 可減少菌體用量或增加溶液的用量 不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。 溶液在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，置于37保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。,六、質(zhì)粒DNA提取常見問(wèn)題,問(wèn)題一：未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？,原因,對(duì) 策,混有蛋白 混有RNA 混有基因組DNA,不要使用過(guò)多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì) 加入RNaseA室溫放置一段時(shí)間 加入溶液II 和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò)16小時(shí)。,六、質(zhì)粒DNA提取