實驗2研究生PCR產(chǎn)物鑒定及PCR原理應(yīng)用.pptVIP

生化與分子生物學(xué)技術(shù),周 倜 中山醫(yī)學(xué)院生化教研室,實驗室秩序 （時間，物品保管，工作服，分組與值日） 儀器與設(shè)備的使用 實驗室安全環(huán)保,實驗室管理與操作規(guī)程,實驗二 apoB基因多態(tài)性分析-PCR產(chǎn)物電泳檢測, 電泳的概念,帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象。 廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定, 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質(zhì)分類）, 紙電泳 醋酸纖維膜電泳 凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳, 電泳的基本原理,利用物質(zhì)的兩個差異來分離物質(zhì),電荷差異 電荷性質(zhì) 電荷數(shù)量,分子差異 分子大小 分子形狀,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45 開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小、構(gòu)象及電荷數(shù)不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶 DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長為254nm365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。,DNA瓊脂糖電泳基本原理,1.1 影響DNA在凝膠中遷移速率的因素,DNA分子的大小 構(gòu)象 凝膠濃度 電壓 緩沖液,1.2 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍,瓊脂糖濃度（，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（kb),0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2,一、電泳前準(zhǔn)備,二、制膠,三、上樣電泳,基因組DNA 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭， 微波爐，紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X加樣緩沖液 ： 0.25%溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液,實驗材料,PCR-apoB基因多態(tài)性產(chǎn)物的鑒定,取PCR產(chǎn)物全部上樣,1.5%膠，電泳（80mA, 120min）,1：Marker 2：待測樣品1 3：待測樣品2 4: 待測樣品3 5: 待測樣品4 6: 待測樣品5 7：待測樣品6,-DNA瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果,瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、1%膠3mm、凝固后拔梳）,倒緩沖液，加樣（取基因組DNA樣品液8l+2l上樣緩沖液（5），混勻, 上樣 ）,電泳（恒壓100V 1小時） 檢測（紫外檢測）,四.操作步驟 （1人1孔）,其余DNA樣品交給老師保存，以后實驗用。,有關(guān)PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)體系 PCR過程 PCR的基本原理,有關(guān)PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的基本原理,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,一、最初的理論描述Khorana Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因?！?但由于當(dāng)時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上70年代初分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴增基因的途徑，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了,二、PCR技術(shù)的發(fā)明Kary Mullis 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱 1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,PCR從構(gòu)想成為現(xiàn)實 1983年12月， Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的第一個PCR片斷； 1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號4,683,202 ），Mullis是第一發(fā)明人； 1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的基本原理,有關(guān)PCR反應(yīng),94,55,37,?,Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus),酶活性(%),溫度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,Saiki, 1988年,PCR技術(shù)的發(fā)展,72,94,55,PCR循環(huán),普通PCR儀、梯度PCR儀,全新4通道實時熒光定量PCR儀,1988年第一臺PCR儀問世，PCR逐步實現(xiàn)自動化 1989年美國Science雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此項技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎。,PCR技術(shù)的發(fā)展,Kary B. Mullis（1944）,,PCR儀的變遷,三個水浴鍋，用手移動 （Mullis等人當(dāng)時用的） 電加熱塊 自來水冷卻 （PE，1988） 電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PE，1989） 三個加熱塊 機械手 （Strategene，1994） 半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf） 空氣加熱 (Roche) 梯度PCR儀, 實時熒光定量PCR儀 Lab-on-chip式的PCR儀(芯片PCR),全新4通道實時熒光定量PCR儀,普通PCR儀、梯度PCR儀,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,過 程,變 性,退 火,延 伸,經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,4 forever,PCR技術(shù)的特點,靈敏度高 30輪循環(huán),擴增量達(dá)230個拷貝（109拷貝） 將模板從皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平 能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞 病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個PFU 細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌 特異性強 引物序列與模板結(jié)合的特異性 快速簡便 一次性加好反應(yīng)液，24小時即可完成擴增,生物學(xué)基礎(chǔ)研究 目的基因擴增和鑒定 、DNA測序、定點突變 醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用 遺傳疾病基因診斷、致病病原體檢測 、組織配型 人類基因組工程 遺傳圖譜的構(gòu)建、DNA測序、表達(dá)圖譜 法醫(yī)學(xué)物證鑒定 個體識別、親子鑒定 其他 動植物檢疫、系統(tǒng)進(jìn)化研究、分子考古學(xué),PCR的應(yīng)用領(lǐng)域,分子克?。康幕虻墨@取和鑒定）,PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究,5,5,Bam H I,EcoR I,Bam H I,EcoR I,PCR(5端引入限制酶識別位點),圍繞二硫鍵構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的K5缺失突變體（PCR缺失突變）,Yang X（楊霞）, et al. J Cell Mol Med (IF:5.2), 2010.,PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究,2、臨床基因診斷,A,內(nèi)源性病變基因,正常人,A,病 人,PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷,遺傳疾病的基因診斷,基因缺失、插入或置換等,地中海貧血,珠蛋白鏈合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,A,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),登革病毒的檢測,DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因,A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子819缺失,B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者,C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式,多重PCR檢測DMD基因缺失,PCR-RFLP法：(PCR產(chǎn)物限制性酶切片斷多態(tài)性分析),Ras癌基因,限制性內(nèi)切酶,突變,限制性內(nèi)切酶,正常,突變,電泳,個體識別；親子鑒定 方法：PCR-RFLP（限制片段長度多態(tài)性） DNA指紋 PCR-ASO （等位基因特異性寡核苷酸） PCR-VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列）多態(tài)性 PCR-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）多態(tài)性 PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性） 線粒體DNA測序,PCR技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定,性別鑒定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,PCR-STR(short tandem repeat)多態(tài)性檢測,PCR；電泳檢測,PCR技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定,現(xiàn)場血跡 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3,個體識別,PCR技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定,父 父 子 母,親子鑒定,PCR技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定,1：Marker 2：陽性模板 3：待測樣品1 4：已確診乙肝病人樣品 5: 待測樣品2 6: 待測樣品3 7: 陽性模板,結(jié)果分析,陰性,陰性,PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多態(tài)性檢測,PCR；電泳檢測,3VNTR位于該基因3端下游第2個Poly A信號以下位置的一個可變數(shù)目串連重復(fù)序列，也稱小衛(wèi)星區(qū)（minisatellite）。 根據(jù)重復(fù)序列長度的不同，可分為不同的等位基因型，自從1989年首先發(fā)現(xiàn)14種Apo B基因3VNTR等位基因以來，國內(nèi)外至今已發(fā)現(xiàn)22種等位基因，長度在4001200 bp之間. 根據(jù)重復(fù)序列的內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為兩類：ATAATTAAATATTTT，稱為X型；ATAATTAAAATATTT，稱為Y型。其序列中發(fā)生單核苷酸取代（即G或C取代T）， 又可產(chǎn)生X或Y的變異體Xi、Yi、Xii和Yii等。 VNTR重復(fù)序列數(shù)目的不同，以及每一重復(fù)序列內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化決定了VNTR的高度多態(tài)性。apoB 3VNTR序列由兩端152個保守序列和中間以15bp核心序列多次重復(fù)組成。,有關(guān)3 VNTR多態(tài)性,小 結(jié),掌握PCR技術(shù)的原理及基本步驟 熟悉apoB基因多態(tài)性的基本原理和操作步驟 了解PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,思 考 題, Taq DNA 聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)？ 根據(jù)自己的實驗觀察，你認(rèn)為哪些事項是 PCR 操作成功的關(guān)鍵所在？,1）不對稱PCR 2) 反向PCR 3）多重PCR 4）錨定PCR 5）逆轉(zhuǎn)錄PCR 6）原位PCR 7) 熒光定量 PCR,PCR的類型,目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限 制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制 性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,不對稱PCR,高濃度引物,低濃度引物,反向PCR (reverse PCR),用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴增。 可對未知序列擴增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,多重PCR（復(fù)合PCR）,用于檢測特定基因序列的存在或缺失。,電泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因,A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子819缺失,B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者,C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式,多重PCR檢測DMD基因缺失,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、熒光素等對引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,標(biāo)記引物,觀察,PCR產(chǎn)物,錨定PCR（anchored PCR, A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段兩側(cè)的序列,對于未知序列怎么辦？,cDNA,末端核酸轉(zhuǎn)移酶,3GGGG,5,CCCC 錨定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴增,PCR固相分析法,檢測探針信號,可用于基因芯片的制作,原位,原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行擴增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列,既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。,原位PCR的作用,操作步驟 1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙