PDTC對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織ICAM-1mRNA表 的調(diào)節(jié)作用1.doc

精品論文 pdtc對(duì)lps誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織icam-1mrna表 的調(diào)節(jié)作用1王大龍冷玉芳蘭州大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，蘭州（730000）摘要：目的：探討二硫代氨基吡咯烷 (pyrrolidine dithiocarbamate，pdtc)對(duì)內(nèi)毒素（lps）誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞間黏附分子-1（icam-1）mrna 表達(dá)的影響及其可能 的保護(hù)機(jī)制。方法：72 只 wista 大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組（c 組 ），lps 組(l 組)，pdtc+lps 組(p 組)。其中根據(jù)腹腔注射內(nèi)毒素到取肺組織的時(shí)間分為 1、3、6、12h 亞組，每組六只。 觀察大鼠肺組織病理變化，肺組織濕/干重(w/d)比變化，同時(shí)使用 rt-pcr 法檢測(cè)大鼠肺組 織 icam-1mrna 表達(dá)。結(jié)果：與 c 組比，l 組大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后，肺組織 icam-1mrna 表 達(dá)明顯增強(qiáng)（p0.05），病理學(xué)顯示肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺組織濕 /干重比（w/d）明顯 增大（p0.05）。與 l 組比，p 組應(yīng)用 pdtc 后 icam-1mrna 表達(dá)明顯減少（p0.05）,肺組 織結(jié)構(gòu)的破壞有明顯減輕，肺組織濕/干重比（w/d）明顯減?。╬0.05）。結(jié)論：應(yīng)用 pdtc 能明顯抑制 icam-1mrna 表達(dá)，對(duì) lps 誘導(dǎo)急性肺損傷有一定保護(hù)作用。提示 pdtc 的肺保 護(hù)作用機(jī)制可能與抑制 icam-1 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。關(guān)鍵詞：pdtc；核因子-b；icam-1；內(nèi)毒素；肺損傷中圖分類(lèi)號(hào)：r655.31. 引 言：急性肺損傷（ali）/急性呼吸窘迫綜合征 (ards)是由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷和體克等多種病 因所致的彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷，其在分子水平上表現(xiàn)為眾多促炎性細(xì)胞因子、粘附分子的過(guò) 度表達(dá)，伴有多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。炎癥形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織廣泛損害，并累及諸 多肺外器官，其中，核因子 -b（nf-b）在調(diào)控炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)上起著關(guān)鍵作用。 多種炎癥介質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中含有b 位點(diǎn)，如細(xì)胞間黏附因子-1（icam-1）、白 細(xì)胞介素-1（il-1）、白細(xì)胞介素-6（il-6）、腫瘤壞死因子-（tnf-）等?；罨?nf- b 可調(diào)控上述介質(zhì)基因的表達(dá) 1,2。研究證明，抗氧化劑二硫代氨基吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，pdtc)能夠通過(guò)抑制重要的核轉(zhuǎn)錄因子-b(nuclearfactor-kappab，nf- b)活化，減少致炎細(xì)胞因子表達(dá)與合成釋放3.4 ，因此本實(shí)驗(yàn)建立大鼠內(nèi)毒素性肺損傷模 型，研究 pdtc 對(duì) lps 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織 icam-1mrna 影響，以探討 pdtc 肺損傷的 保護(hù)作用及其機(jī)制。1 本課題得到甘肅省基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助（0710rjza038 ）- 7 -精品論文2. 材料與方法2.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑： wista 大鼠（由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供） 72 只，雌 雄各半，200250g，lps（ecoli055:b5）購(gòu)自 sigma 公司，pdtc 購(gòu)自 sigma 公司，核酸提 取試劑購(gòu)自百泰克，rna 試劑盒購(gòu)自 fermentas 公司。72 只 wista 大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組（ c 組），lps 組(l 組)，pdtc+lps 組(p 組)。 其中根據(jù)腹腔注射內(nèi)毒素到取肺組織的時(shí)間分為 1、3、6、12h 亞組，每組六只。l 組和 p 組采用腹腔注射 lps8mg/kg（5mg/ml）制作內(nèi)毒素性肺損傷模型，c 組注射同體積的生理鹽 水。p 組在腹腔注射內(nèi)毒素前 30min，尾靜脈注射 pdtc120mg/kg（60mg/ml），l 組和 c 組 給予同體積的生理鹽水。按分組規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，10水合氯醛 350mg/kg 腹腔注射麻醉，開(kāi) 胸心臟放血處死，采集標(biāo)本。2.2方法221rt-pcr 檢測(cè)用 pcr 專(zhuān)用器械迅速取右肺下葉，經(jīng)預(yù)冷的 depc 水沖洗表面的血液后立即置于液氮中 速凍，-80冰箱保存，待用于 rt-pcr。用 rna 提取試劑 trizol 提取肺組織總 rna，反轉(zhuǎn) 錄合成 cdna 第一條鏈。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2l 進(jìn)行 pcr 反應(yīng)（94變性 5min，59復(fù)性 30s，72延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增組織中 icam-1 的引物為:5-aggtatccatccatcccaca-3和 5-agtgtctcattcccacggag-3，片段長(zhǎng)度為 388bp；擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照-actin 的引物為: -actin 引物 5-gtgggccgctgtaggcaccaa-3和 5-ctctttgatgtcgcacgatttc-3，片 段長(zhǎng)度為 540bp。由上海賽百盛有限公司合成。pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙 錠染色顯示，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以 icam-1mrna/-actinmrna 電泳帶的熒光強(qiáng)度比 值作為 icam-1mrna 的表達(dá)量指標(biāo)。222肺組織病理檢查取左肺下葉，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，he 染色后光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。223 肺組織濕/干重比值（w/d）取左肺下葉，濾紙拭去表面血液，稱(chēng)濕重后（w）置于 80烤箱烘烤 48 小時(shí)使肺組織 達(dá)恒重后稱(chēng)干重（d），計(jì)算 w/d 比值，224 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 spss11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ x s）表示。統(tǒng)計(jì) 分析采用單因素方差分析（anova），p0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. 結(jié)果31rt-pcr 檢測(cè) icam-1mrna 表達(dá)結(jié)果c組大鼠肺組中icam-mrna只有少量表達(dá)；l組icam-1mrna表達(dá)量從注射內(nèi)毒素后1h就開(kāi) 始顯著增加，與c組有差異（p0.05），直到12h達(dá)到高峰；在p組，icam-mrna隨時(shí)間的變化規(guī)律與l組相同，但是應(yīng)用pdtc后能明顯的抑制內(nèi)毒素引起的icam-1mrna的表達(dá)。與l組相比，p組在1、3、6、12h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)icam-1mrna的表達(dá)量都顯著的降低（p0.05）。見(jiàn)表1、 圖1。表 1 各組肺組織中 icam-mrna 的表達(dá)水平比較（n=6， x s）組別1h3h6h12hc組l組p組0.400.0180.720.028*0.520.023*0.410.0260.920.023*0.650.037*0.390.0191.020.054*0.730.032*0.410.0201.120.039*0.810.020*與 c 組相比，*p0.05；同一時(shí)間點(diǎn)與 l 組相比，p0.05圖 1 各組肺組織中 icam-mrna 的表達(dá)水平1，2為c組；3，4，5，6分別為lps1h、3h、6h、12h組；7，8，9，10分別為pdtc+lps1h、3h、6h、12h組。32肺組織光鏡病理學(xué)結(jié)果c組在光鏡可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無(wú)水腫，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；l組可見(jiàn)片狀出血， 光鏡下可見(jiàn)基本上看不到完整的肺泡結(jié)構(gòu)，肺間質(zhì)有嚴(yán)重的水腫、淤血，大量的炎癥細(xì)胞 浸潤(rùn)；p組，肺泡結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，能看到代償增大的肺泡，無(wú)明顯的水腫、淤血，僅有 少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。圖.2 各組腹腔注射內(nèi)毒素 6 小時(shí)后病理（he200）33 肺組織濕/干重比值（w/d）與c組相比，p組和l組w/d比值在相同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（p0.05），與l組相比p組， w/d比值在相同時(shí)間點(diǎn)均明顯降低（p0.05）。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1 各組肺組織中w/d比值（ x s，n=6）組別1h3h6h12hc組l組p組4.270.164.610.08*4.360.10*4.260.114.830.12*4.560.24*20.14*4.830.16*4.260.235.750.27*5.240.38*與 c 組相比，*p0.05；同一時(shí)間點(diǎn)與 l 組相比，p0.054. 討論在ali時(shí)，影響肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的有害物質(zhì)可破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，誘導(dǎo)其血液動(dòng)力 學(xué)和血液流變學(xué)的改變，促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞與循環(huán)血細(xì)胞的相互作用，導(dǎo)致血管通透性增加， 肺水腫形成。因此，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的評(píng)估較為重要，而其釋放的粘附分子是損傷活 化的標(biāo)志物，肺組織w/d的變化可以很好的反映肺泡血管的通透性及肺間質(zhì)的改變程度。lps 主要與巨噬細(xì)胞表面的toll受體結(jié)合，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)傳遞鏈，促進(jìn) ib亞型的降解并活 化nf-b的dna結(jié)合能力，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)和釋放多種細(xì)胞因子，發(fā)揮其毒性作用5,6,7。 本研究中，l組注射lps后，大鼠呼吸加快，肺組織的 icam-mrna表達(dá)增強(qiáng)，w/d增加，并且 光鏡觀察到明顯的肺損傷的形態(tài)學(xué)變化，證明了成功的建立了ali模型。icam-1 是一類(lèi)大分子糖蛋白，屬于免疫球蛋白基因超家族，可以表達(dá)于多種類(lèi)型的細(xì) 胞，它通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附作用，參與一系列生理及病理 過(guò)程8。目前的研究認(rèn)為大量的多形核白細(xì)胞（pmn）黏附于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、在肺內(nèi)扣押 并釋放生物活性介質(zhì)是 ali 發(fā)生的主要機(jī)制之一；通過(guò)有效的減少或清除肺內(nèi)的 pmn 而控 制炎癥反應(yīng)，可以減輕 ali9。icam-1 在肺組織中的表達(dá)增強(qiáng) ,一方面通過(guò)與其配體即表達(dá) 于 pmn 表面的 cd11/cd18 相結(jié)合有助于 pmn 與血管內(nèi)皮細(xì)胞相黏附 ,促使 pmn 移行于血 管外;另一方面 pmn 與靶細(xì)胞黏附結(jié)合后 ,形成了 pmn 與靶細(xì)胞之間的一個(gè)較緊密且相對(duì)穩(wěn) 定的微環(huán)境 ,此微環(huán)境有利于 pmn 釋放的毒性介質(zhì)在局部保持較高濃度 ,從而對(duì)靶細(xì)胞發(fā) 揮有效的毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷及持續(xù)細(xì)胞因子釋放 10。本研究中，與 c 組 比較，l 組的 icam-1mrna 表達(dá)增加，光鏡下可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)基本消失，肺間質(zhì)淤血水腫，肺 組織間隙有大量的 pmn 聚集扣押，表明在 lps 的刺激下，大量激活的 pmn 向肺組織轉(zhuǎn)移， 聚集在肺組織并激活，繼而產(chǎn)生肺損傷。同時(shí) icam-1mrna 表達(dá)隨時(shí)間變化增強(qiáng)，炎癥反應(yīng) 加重。icam 的表達(dá)受到多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控。目前研究認(rèn)為 icam-1 的表達(dá)可能與 nf- b 的活化有關(guān)。nf-b 是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，具有和某些基因啟動(dòng)子區(qū)固定 核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能；正常情況下，與其抑制物 ib 結(jié)合，存在于靜止期細(xì)胞的胞漿中。已證實(shí)，icam-1 基因啟動(dòng)子上含有 nf-b 結(jié)合位點(diǎn)，各種細(xì)胞外的刺激信號(hào)使胞漿中未活化的 nf-b 激活進(jìn)入胞核，促進(jìn)其細(xì)胞粘附分子的表達(dá)；細(xì)胞粘附分子又可反過(guò)來(lái)進(jìn)一步活化 nf-b，由此形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)，使炎癥不斷放大。nf-b 誘導(dǎo) icam-1 表達(dá)和增強(qiáng) pmn 粘附的作用已通過(guò)很多試驗(yàn)證實(shí)11、12。研究證明，pdtc 是一種抗氧化劑， 也是 nf-b 的特異性抑制劑，可在 nf-b 活化通道的不同水平發(fā)揮抑制作用，如抑制 nf- bp65 亞單位，抑制ib（nf-b 抑制劑）的降解或減少 nf-b 的核移位，從而減少致炎 細(xì)胞因子表達(dá)與合成釋放3.4。本研究中，與 c 組相比，p 組 icam-1mrna 表達(dá)仍有增加，病 理學(xué)顯示肺泡結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，能看到代償增大的肺泡，無(wú)明顯的水腫、淤血，僅有少 量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，w/d 比值也較大，可能與 pdtc 只干預(yù)了部分 ali 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。與l 組相比，icam-1mrna 表達(dá)減輕，病理學(xué)損傷減少，w/d 減小。表明 pdtc 通過(guò)減少 icam-1mrna 表達(dá)，進(jìn)而減輕 pmn 在肺組織內(nèi)的聚集和激活，抑制肺損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)。綜上所述，pdtc 預(yù)先給藥對(duì) lps 誘導(dǎo)的大鼠 ali 有一定的保護(hù)作用，可能與減少肺組 織的 icam-1mrna 表達(dá)，進(jìn)而抑制 pmn 的聚集和激活有關(guān)。參考文獻(xiàn)1. wilkins paseahorn t. acute respiratory distress syndrome. vet clin 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group, l group and p group were divided 1h,3h , 6h,12 h subgroups(n=6) in accordance with the time between intraperitoneal injection of endotoxin to take the lung tis sue. observation of pathological changes in lung tis sue, lung wet / dry we