[地方標(biāo)準(zhǔn)]-DB33T 556-2005 乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定 酶聯(lián)免疫吸附法.doc

db33/t 2005浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布2005-07-15實(shí)施2005-07-01發(fā)布乳和乳粉中黃曲霉毒素m1的測定 酶聯(lián)免疫吸附法determination of aflatoxin m1 in milk and milk powder-enzyme-linked immunosorbent assaydb33/t 5562005db33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ics 67.040c 53備案號：1db33/t 5562005前 言本標(biāo)準(zhǔn)由杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、杭州市農(nóng)業(yè)局共同提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由杭州市農(nóng)產(chǎn)品檢測站負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡學(xué)肖、楊華、袁謙、吳玲玲、李容、姚建紅。i引 言黃曲霉毒素m1是黃曲霉毒素b1在動物體內(nèi)的羥基化代謝產(chǎn)物，具有劇毒性和致癌性。目前我國有關(guān)黃曲霉毒素m1的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和熒光光度法等，本方法是用于定性和半定量的快速測定法，適合快速檢測和批量樣品的篩選。ii乳和乳粉中黃曲霉毒素m1的測定 酶聯(lián)免疫吸附法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳和乳粉中黃曲霉毒素m1的酶聯(lián)免疫吸附測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、乳粉等乳品中黃曲霉毒素m1的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。gb/t 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品試液加入各自板孔，游離的黃曲霉毒素m1與微孔中包被的黃曲霉毒素m1抗體結(jié)合，沒有結(jié)合的物質(zhì)在洗滌中被清除。再加入黃曲霉毒素m1酶標(biāo)記物，將沒有結(jié)合的抗體位點(diǎn)全部覆蓋，結(jié)合的酶標(biāo)記物通過顯色液顯示出來。最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度值，吸光度值與樣品中的黃曲霉毒素m1含量成反比。4 試劑和溶液4.1 本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為去離子水。4.2 黃曲霉毒素m1試劑盒注：不同品牌的黃曲霉毒素m1試劑盒其操作步驟可能有所不同，溶液配制和測試程序等可根據(jù)其試劑盒使用說明書略作調(diào)整。：最低檢出限不大于0.02g/kg。4.2.1 微孔板。4.2.2 黃曲霉毒素m1標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度范圍00.10g/kg。4.2.3 酶標(biāo)記物濃縮液。4.2.4 酶標(biāo)記物稀釋用緩沖液。4.2.5 顯色劑。4.2.6 檸檬酸緩沖液。4.2.7 終止液。4.2.8 樣品稀釋緩沖液。4.2.9 洗板濃縮液。4.3 酶標(biāo)記物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算用量，用酶標(biāo)記物稀釋用緩沖液（4.1.4）將其濃縮液（4.1.3）以1：100稀釋，切勿渦旋混合，配制后放回試劑盒放置4h以上，備用。4.4 顯色反應(yīng)液：顯色劑（4.1.5）用檸檬酸緩沖液（4.1.6）以1：10稀釋，在使用前配制，避光保存。4.5 洗板工作液：洗板濃縮液（4.1.9）用水以1：20稀釋，備用。4.6 0.36mol/l亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.2g k4fe(cn)63h2o，用水溶解、定容至100ml。4.7 1.04mol/l硫酸鋅溶液：稱取29.9g znso47h2o,用水溶解、定容至100ml。5 儀器和設(shè)備5.1 微孔板酶標(biāo)儀（帶450nm濾光片）。5.2 天平：最小感量0.01g。5.3 冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速不小于3000rpm。5.4 旋渦混合器。5.5 連續(xù)可調(diào)移液器及配套吸頭：5l50l、20l200l、200l1000l。5.6 脫脂棉簽。5.7 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃器皿。6 分析步驟6.1 樣品前處理6.1.1 生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳以下簡稱液態(tài)乳：將待測樣品搖勻，平行稱取兩份5.0g試樣（精確到0.1g）到10ml離心管中，2 oc8 oc 以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，用脫脂棉簽除去上層脂肪。加入150l亞鐵氰化鉀溶液（4.5），短暫渦旋混合后加入150l硫酸鋅溶液（4.6），渦旋振蕩3min。10oc15 oc 以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液供測試用。6.1.2 乳粉：平行稱取兩份10.0g待測乳粉（精確到0.1g）到各自小燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，定容至刻度。以下步驟同6.1.1。6.2 測試程序6.2.1 以下操作均須在20 oc25 oc溫度下進(jìn)行。6.2.2 取出試劑盒，放置1h以上，使其溫度恢復(fù)到20 oc25 oc。將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，并記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品對應(yīng)的位置。6.2.3 加100l標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.1.2）和已處理好的樣品試液到各自微孔中，孵育60min。6.2.4 倒除微孔中的液體，注入洗板工作液（4.4）約300l，重復(fù)洗滌5次，最后在吸水紙上輕輕拍干。6.2.5 在所有微孔中加入100l酶標(biāo)記物工作液（4.2），孵育20min。6.2.6 重復(fù)6.2.3步驟。6.2.7 在所有微孔中加入100l顯色反應(yīng)液（4.3），孵育30min。6.2.8 在所有微孔中加入50l終止液（4.1.7），混勻后60min內(nèi)在450nm處測定吸光度值。7 分析結(jié)果計(jì)算和表述7.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值（c）為橫坐標(biāo)，相對吸光度值（b/b0）為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。相對吸光度值（%）= b/b0 100 - (1)式中： b 標(biāo)準(zhǔn)（或樣品）的吸光度值；b0 空白（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值。7.2 結(jié)果計(jì)算7.2.1 液態(tài)乳中黃曲霉毒素m1的含量按式（2）計(jì)算：x1 = k1cx - (2)式中：x1 液態(tài)乳中黃曲霉毒素m1的含量，g/kg； k1 液態(tài)乳在前處理過程中的稀釋倍數(shù)。 cx 由測試用上清液的相對吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的黃曲霉毒素m1的濃度，ng/ml；7.2.2 乳粉中黃曲霉毒素m1的含量按式（3）計(jì)算：x2 = k2cyv/m - (3)式中：x2 乳粉中黃曲霉毒素m1的含量，g/kg； k2 乳粉定容后分取液在前處理過程中的稀釋倍數(shù)。 cy 由測試用上清液的相對吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的黃曲霉毒素m1的濃度，ng/ml； m 乳粉稱樣量，g； v 乳粉定容體積，ml。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。8 檢出限與允許差8.1 檢出限 液態(tài)乳和乳粉中黃曲霉毒素m1的檢出限分別為0.02g/kg和0.20g/kg。8.2允許差每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。其分析結(jié)果的相對偏差應(yīng)不大于15%。9