還原糖-砷鉬酸比色法.ppt

實(shí)驗(yàn)五,還原糖含量的測(cè)定 -砷鉬酸比色法,基礎(chǔ)生物化學(xué),一、糖,1. 糖的生理功能 (1)分布廣泛的有機(jī)化合物,它是某些植物種子、根、莖的重要組成部分，也是蔬菜、水果等的重要組成部分。 (2)維持生命活動(dòng)的主要能量來(lái)源。 (3)是許多植物和微生物細(xì)胞壁的重要組成部分。,2.測(cè)定的意義,(1)在植物組織中，糖含量可高達(dá)80%左右，在動(dòng)物和人組織中，含量較少，約為干重的2%。 (2)植物中糖的種類(lèi)和含量分析，對(duì)于選種及控制培育條件有重要的意義。 (3)在微生物發(fā)酵中控制培養(yǎng)基中糖等物質(zhì)的含量，對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐很重要。 (4)在醫(yī)學(xué)方面根據(jù)血糖或尿糖含量的高低診斷某些疾病。,3.測(cè)定的方法,(1)根據(jù)糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性質(zhì)，可用折射儀、波美比重計(jì)、旋光儀來(lái)測(cè)定糖含量。 (2)根據(jù)糖的化學(xué)性質(zhì)可用滴定法、比色法定量測(cè)定，此外還有氧電極、酶電極等快速微量的定糖方法。,二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解還原糖的生理意義及作用。 2.掌握砷鉬酸比色法測(cè)定還原糖的基本原理和操作方法。,三、實(shí)驗(yàn)原理,還原糖：指含有自由醛基或酮基的糖類(lèi)，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。 利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)。 對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。,1、砷鉬酸比色原理,（1）還原糖在堿性條件下加熱，可以定量地還原二價(jià)銅離子為一價(jià)銅離子，即產(chǎn)生磚紅色地氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：,（酒石酸鉀鈉）,磚紅色,（2）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型地鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍(lán)色復(fù)合物即砷鉬藍(lán)，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖地含量(即被還原的Cu2O)成正比，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標(biāo)準(zhǔn)，就可測(cè)得樣品還原糖含量。,2、測(cè)定還原糖其它方法,(1)蒽酮比色法： 強(qiáng)酸可使糖類(lèi)脫水生成糠醛，糠醛與蒽酮脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍(lán)綠色，其顏色的深淺與糖含量成正比關(guān)系，在620nm波長(zhǎng)下可測(cè)定其光密度值。,(2) 3,5-二硝基水楊酸： 還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。,(3)費(fèi)林試劑滴定法 費(fèi)林試劑由甲乙兩種溶液混合而成，甲液(硫酸銅)與乙液(氫氧化鈉)生成天藍(lán)色沉淀，在堿性溶液中，乙液(酒石酸鉀鈉)使氫氧化銅溶解生成一種絡(luò)合物，還原糖在堿性加熱條件下，可以定量還原費(fèi)林試劑中Cu2+為Cu1+,使費(fèi)林試劑脫色，其脫色的程度與還原糖含量成正比關(guān)系。,四、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑,1實(shí)驗(yàn)材料 ：蘋(píng)果 2儀器 （1）恒溫水浴鍋 （2）Spc22-可見(jiàn)分光光度計(jì)（3）容量瓶（4）漏斗（5）研缽 3試劑 （1）銅試劑：CuSO4、酒石酸鉀鈉、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3 （2）砷鉬酸試劑：（NH4)6Mo7O244H2O、Na2HAso47H2O （3） 200g/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線: 取7支試管，按下表操作，然后以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,五、實(shí)驗(yàn)步驟,標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度(ug/ml),OD值,0,樣品OD,C0,2、還原糖的提取,稱取0.25g蘋(píng)果于研缽中加約30ml蒸餾水由漏斗沖入50ml容量瓶，搖勻80水浴浸提30min冷卻加3mlZnSO4加3ml0.3N的Ba(OH)2振蕩后靜置上層出現(xiàn)清液后再加一滴Ba(OH)2至無(wú)白色沉淀定容至50ml。,3、還原糖含量的測(cè)定,過(guò)濾提取液取濾液0.5ml于50ml容量瓶中定容取稀釋液2ml于刻度試管中加銅試劑2ml煮沸10min加砷鉬酸試劑2ml振蕩2min定容到20ml620nm下比色測(cè)定記錄結(jié)果查標(biāo)準(zhǔn)曲線。,五、結(jié)果與計(jì)算,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算出樣品中還原糖百分含量。 還原糖(%)=,W106,100,稀釋倍數(shù)