血清總蛋白和白球比值測定.ppt

血清總蛋白和白/球比值測定,一、血清總蛋白的測定（雙縮脲法） 二、血清白蛋白的測定（溴甲酚綠法）,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、熟悉血清總蛋白的測定方法：雙縮脲法 2、掌握血清總蛋白測定的臨床意義 3、熟悉血清白蛋白的測定方法：溴甲酚綠法 4、掌握血清白蛋白測定和白蛋白與球蛋白的含量比（A/G）測定的臨床意義,一、血清總蛋白的測定,實(shí)驗(yàn)原理： 1、雙縮脲反應(yīng)：兩個(gè)尿素分子縮合生成雙縮脲（H2NOCNHCONH2)，在堿性溶液中與銅離子作用，生成穩(wěn)定的紫紅色配合物，即雙縮脲反應(yīng)。CuSO4的堿性溶液稱雙縮脲試劑。 雙縮脲+銅離子 紫紅色 2、蛋白質(zhì)的定量測定：蛋白質(zhì)與雙縮脲相似，分子中的肽鍵能與雙縮脲試劑形成紫色配合物。這種紫色配合物在540nm處有明顯吸收峰。吸光度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量成正比，常用于蛋白質(zhì)的定量測定。,生理鹽水,雙縮脲試劑,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,待測血清稀釋液,生理鹽水：氯化鈉0.9g溶于10ml蒸餾水。 雙縮脲試劑：硫酸銅3.0g溶于500ml蒸餾水， 加酒石酸鉀鈉9.0g，完全溶解后，加入24%氫氧化鈉100ml，用蒸餾水稀釋到1L，置于聚氯 乙烯瓶內(nèi)蓋緊保存。 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：收集混合血清，經(jīng)凱氏定 氮法定值，用作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。儲(chǔ)存于冰箱中備用。也可用10mg/mL牛血清白蛋白替代。 待測血清用生理鹽水按1:10稀釋。,實(shí)驗(yàn)步驟：,混勻，37度水浴放置10min，以空白管調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長處進(jìn)行比色，分別讀取各管的吸光度。 計(jì)算:血清總蛋白含量= *蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度*稀釋倍數(shù)（g/L）,取3支試管，按下表操作。,臨床意義：,1、血清總蛋白濃度增高 （1）血液濃縮，導(dǎo)致總蛋白濃度相對(duì)增高：嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、高燒時(shí)急劇失水、休克、慢性腎上腺皮質(zhì)功減退，血清總蛋白濃度可明顯升高。 （2）血漿蛋白質(zhì)合成增加：主要見于球蛋白合成增加，如多發(fā)性骨髓瘤患者，其蛋白含量可超過50g/L。,2、血清總蛋白濃度降低 （1）血液稀釋，導(dǎo)致總蛋白濃度相對(duì)降低：如靜脈注射過多低滲溶液或因各種原因引起的鈉、水潴留。 （2）攝入不足和消耗增加：食物中長期缺乏蛋白質(zhì)，慢性胃腸道疾病引起的消化吸收不良，患消耗性疾病等，均可造成血清蛋白濃度降低。 （3）合成障礙：主要見于肝臟患疾。血漿清蛋白及大部分球蛋白均由肝臟合成，肝功能嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，血漿蛋白質(zhì)的合成量減少，其中以清蛋白濃度降低最為明顯。 （4）蛋白質(zhì)丟失：嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)大量血漿滲出，大量失血。,1、雙縮脲試劑中酒石酸鉀鈉的作用是配合銅離子，以維持銅離子在堿性溶液中的溶解性；碘化鉀是抗氧化劑，防止堿性酒石酸自動(dòng)還原。 2、由于各種血清蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量不同，古其濃度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。 3、高脂、黃疸及溶血標(biāo)本應(yīng)做血清空白對(duì)照來校正誤差。 4、本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條通過原點(diǎn)的直線，在濃度小于100g/L時(shí)呈良好的線性關(guān)系。,注意事項(xiàng)：,二、血清白蛋白的測定,實(shí)驗(yàn)原理： 1、溴甲酚綠法：在不分離血清中白蛋白的情況下直接測定白蛋白的一種方法。白蛋白具有與陰離子染料結(jié)合的性質(zhì)，在pH=4.2的環(huán)境中，帶正電荷的白蛋白（pI=4.9）與陰離子染料溴甲酚綠結(jié)合，由黃色變?yōu)樗{(lán)綠色。 白蛋白+溴甲酚綠 藍(lán)綠色復(fù)合物 2、白蛋白含量的測定：藍(lán)綠色的深淺與白蛋白的濃度成正比，因此可直接測定血清白蛋白的含量。,溴甲酚綠儲(chǔ)存液：BCG 419mg溶于10ml 0.1mol/L NaOH，加NaN3 100mg，定容至1L，儲(chǔ)存于棕色瓶中備用。 0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH=4.2）：分別配制 0.1mol/L檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，按體積比 12.3 : 7.7 混合。每1L混合液加入NaN3 100mg。 30%聚氧化乙烯月桂醚溶液：取Brij-35 30g，加少量水，60度水浴溶解加水至100ml。 BCG應(yīng)用液：BCG儲(chǔ)存液 250ml、0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH=4.2) 750ml、30% Brij-35混合而成。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(10mg/ml)：稱取人白蛋白 1.00g，用生理鹽水溶解并定容至100ml。,實(shí)驗(yàn)試劑：,實(shí)驗(yàn)步驟：,1、白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取4支試管，按下表稀釋標(biāo)準(zhǔn)液。,各管混勻后，另取5支試管，按下表操作。,混勻后以空白管校零，立即比色，比色波長為620nm,以吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)管中的白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、血清白蛋白的測定 用生理鹽水按 1:10 的比例稀釋血清，取稀釋后的血清0.2ml，加入BCG應(yīng)用液 5.0ml，混勻后立即同上比色，讀取吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的白蛋白濃度。 3、白蛋白與球蛋白的含量比(A/G) 用雙縮脲法測定血清標(biāo)本中的總蛋白濃度，用總蛋白濃度減去白蛋白濃度即得球蛋白濃度，并可求得白蛋白與球蛋白的含量比： 白蛋白與球蛋白含量比= ,臨床意義：,（1）血清白蛋白濃度增高：常見于嚴(yán)重脫水所導(dǎo)致的血漿濃縮。 （2）血清白蛋白濃度降低：在臨床上比較重要和常見，通常與總蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要見于大出血和嚴(yán)重?zé)齻宦越档鸵娪谀I病蛋白尿、肝功能受損、腸道腫瘤及結(jié)核病伴慢性出血、營養(yǎng)不良和惡性腫瘤等。當(dāng)血清白蛋白低于20g/L時(shí)，臨床上出現(xiàn)水腫。 （3）白蛋白與球蛋白的含量比：正常范圍為1.52.5。某些病人可同時(shí)出現(xiàn)白蛋白減少和球蛋白升高的現(xiàn)象，嚴(yán)重者白蛋白與球蛋白的含量比小于1.0，這種情況稱為A/G倒置。,（1）BCG除與白蛋白結(jié)合外，還可與球蛋白及球蛋白結(jié)合，但與后者結(jié)合速度較慢，其顯色強(qiáng)度分別為白蛋白的20%及1