地中海貧血診斷和治療的進(jìn)展.ppt

地中海貧血診斷和治療的進(jìn)展,中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科 李文益,發(fā)病率(含雜合子)： 全世界約1.5億人攜帶血紅蛋白病基因 全國：異常血紅蛋白0.33% -地貧 2.64% -地貧 0.66% 廣東：-地貧 7.3% (9.64%) -地貧 1.833.36% (3.54%) 廣西：-地貧 14.9% 繼發(fā)性-地貧,遺傳學(xué) 珠蛋白基因簇位于16號染色體上 珠蛋白基因簇位于11號染色體上,IVSI IVS 16號染色體 5 3 1 31 32 99 100 141 5 3 1 2 1 Kb 0 10 20 30,IVS IVS 11號染色體 5 3 1 30 31 104 105 146 5 3 2 G A 1 kb 0 10 20 30 40 50 60,缺失型-地貧,全世界缺失型已達(dá)31種 其中4 .2(左側(cè)缺失)和3.7(右側(cè)缺失)缺失型是遍布全世界的類型，其余突變則隨地理和人群分布的不同而異。 在我國，除上述二種缺失外，尚有SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失3034kb)和2.7等。,非缺失型-地貧 目前已報道42種 包括啟動子突變、剪接點突變、移碼突變、無義突變、終止密碼子突變、核苷酸信號位點改變等 中國人非缺失型： HbCS終止密碼子突變2 TAACAA HbQO 2 CD125 (Lcu Pro) 其他：Hb Duan，Hb westmead, Hb Hekinan, HbH-CD30, HbH-CD31, HbH-CD59,獲得性-地中海貧血,繼發(fā)于惡性血液病/MDS 機制： acquired deletion of the -globin gene cluster limited to the neoplastic clone more commonly, inactivating somatic mutations of the trans-acting chromatin-associated factor ATRX, which cause dramatic down-regulation of -globin gene expression.,-地貧 以點突變?yōu)橹?，少?shù)為缺失所致 全世界報告突變類型170，中國28種 中國常見類型：(9省區(qū)檢測資料) CD41-42 (41.6%)、IVS-654(21.8%) CD17 (18.0%)、TATA-nt-28(8.0%) CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%) CD26(HbE),診斷,臨床表現(xiàn) 地貧： 輕型常無臨床癥狀或輕微貧血。 重型患者在嬰兒期出現(xiàn)慢性進(jìn)行性貧血、輕度黃疸（間歇性）、肝脾腫大；常有發(fā)育不良和骨骼改變，出現(xiàn)地中海貧血面容。 中間型多在幼兒期出現(xiàn)貧血，其癥狀比重型輕。,地貧： 靜止型無臨床癥狀， 輕型常無臨床癥狀或輕微貧血。 中間型（HbH）多在幼兒期或以后出現(xiàn)貧血、黃疸、肝脾腫大；感染常使貧血加重甚至出現(xiàn)溶血危象。 重型多出現(xiàn)死胎或胎兒水腫綜合征。,實驗室檢查 血象：貧血為小細(xì)胞低色素性，MCV80fl，MCH28pg，MCHC32%。網(wǎng)織紅細(xì)胞正常或增高。外周血細(xì)胞涂片染色示紅細(xì)胞大小不等，中央淺染色區(qū)擴大，出現(xiàn)異型、靶形、碎片紅細(xì)胞和有核紅細(xì)胞、點彩紅細(xì)胞、嗜多染性紅細(xì)胞、豪-周小體等。,地貧篩查： 地貧5項：溶血度（脆性），正常值：60%；HbF；Hb電泳：HbA2,HbH；紅細(xì)胞形態(tài)（參見上）；ZPP，以排除缺鐵性貧血 地貧6項： ：溶血度（脆性）； Hb電泳；HbF；HbA2；MHb；G6PD活性。,-地貧的基因診斷 缺失型： Southern印跡雜交限制性酶譜分析法： 主要用于較大片段缺失 PCR法： 跨越斷裂點的PCR擴增法(gap-PCR)： 可診斷、區(qū)分地貧1純合子和雜合子 由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR擴增能 夠明確缺失突變形成的各種地貧基因型 或臨床類型。,非缺失型 Southern印跡雜交診斷法 PCR-酶解法： 擴建酶切點法： PCR-ASO 其他方法：聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）也曾用于地貧點突變的基因分析，一般多用于點突變的研究而不是基因診斷和產(chǎn)前診斷。,-地中海貧血的基因診斷 PCR結(jié)合ASO探針斑點雜交技術(shù) 擴增不應(yīng)突變系統(tǒng)法（ARMS法） DNA芯片技術(shù)（DNA chip） 反向點雜交（Reverse dot blot,RDB）,-地貧的鑒別診斷,與小細(xì)胞低色素性貧血的鑒別 缺鐵性貧血 感染或炎癥性貧血 肺含鐵血黃素沉著癥 鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血 鉛中毒 銅缺乏 先天性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥, 缺鐵性貧血 多于6月2歲發(fā)病，無家族史 不當(dāng)喂養(yǎng)史 無溶血證據(jù)，網(wǎng)織紅N/ SI、TS、SF TIBC、FEP 骨髓內(nèi)、外鐵減少, 慢性感染性貧血 有感染、炎癥史及相應(yīng)臨床表現(xiàn) 貧血有時僅為小細(xì)胞性 無溶血，網(wǎng)織紅N/ SI、TIBC、TS ，SF、FEP 鐵粒幼細(xì)胞，外鐵, 鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血 頑固貧血，鐵劑治療無效，個別病例母 系 B6治療有效 無溶血，網(wǎng)織紅N/ BM、外鐵，鐵粒幼紅，可見環(huán)狀 鐵粒幼紅細(xì)胞 SI、SF、FEP、TIBC N/, 肺含鐵血黃素沉著癥 發(fā)作性蒼白，無力，咳嗽，痰中帶血 X線胸片肺野中可見網(wǎng)點狀陰影 痰和胃液中可找到含鐵血黃素細(xì)胞 小細(xì)胞低色素性貧血，網(wǎng)織紅 SI、TS、TIBC SR, 鉛中毒 紅細(xì)胞中可見嗜堿性點彩 長骨X線改變 FEP 銅缺乏性貧血 脂溢性皮炎，皮膚毛發(fā)色素少 淺表靜脈擴 張，自發(fā)性骨折 精神障礙 貧血、WBC，血銅藍(lán)蛋白, 轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥 自幼 貧血，1歲時貧血嚴(yán)重 肝脾輕度大，鐵劑治療無效 網(wǎng)織紅，BM內(nèi)、外鐵 SI、TIBC、TS、SF 其他：Coombs 陰性自溶,* 地中海貧血的預(yù)防 人群普查 遺傳咨詢 產(chǎn)前診斷,治 療 紅細(xì)胞輸注和去鐵治療,本療法仍是最基本治療方法 高、中量輸血配合鐵螯合劑 能活到成年并達(dá)到正常人的生活能力 缺點：需終身治療，費用昂貴 易出現(xiàn)輸血副反應(yīng)，尤其是輸血傳染病等,紅細(xì)胞輸注, 低量輸血法：目前已不用此法 中量輸血法(moderate transfusion) 維持輸血之前的Hb濃度90105g/L 高量輸血法(hypertransfusion): 維持輸血前Hb100g/L 超量輸血法(supertransfusion)： 維持輸血前Hb120 g/L,紅細(xì)胞輸注, 每次輸濃縮紅細(xì)胞1020ml/kg ,每24周1次 使輸注后Hb濃度達(dá)130135g/L 無論何種方法，每次輸注之后Hb不能超過 150g/L 濃縮紅細(xì)胞輸注速度應(yīng)45ml/（kgh） 重度貧血者輸注的速度應(yīng)更慢2ml/kg h）,去鐵治療,鐵螯合劑 去鐵胺(deferoxamine,DFO) 過早使用（歲）可產(chǎn)生骨骼畸形、生長抑制等副作用，在規(guī)則輸血年或輸紅細(xì)胞1020單位之后進(jìn)行鐵負(fù)荷的評估,鐵負(fù)荷的評估方法：, 測定血清鐵蛋白(SF),簡便可行，但影響因 素 較多； 肝穿刺后測定肝組織的鐵含量，此法較準(zhǔn)確,但屬損傷性檢查，一般醫(yī)院難于實行； 影像學(xué)方法如MRI，此法雖簡便但準(zhǔn)確度 不夠且費用高 如有鐵超負(fù)荷，則開始使用鐵螯合劑(3.2mg/g干肝組織或血清鐵蛋白,DFO劑量, 2060mg/kg.d，每周應(yīng)用56天 長期應(yīng)用以控制鐵蛋白在10002000g/L 之間為 理想，采用連續(xù)皮下注射12小時， 或持續(xù)靜脈滴注812小時等方法 缺點是使用較麻煩,病兒依從性差，如使用 不當(dāng)(鐵負(fù)荷輕而用大劑量DFO）, 可致白 內(nèi)障、聽力喪失、長骨生長障礙等副 作用,口服鐵螯合劑, deferiprone(L1) 化學(xué)名羥基吡啶1，二齒狀分子結(jié)構(gòu) 以3:1與Fe3+ 結(jié)合，結(jié)合效率差些 吸收快，迅速轉(zhuǎn)化成活性形式，排泄快 1984年臨床實驗，1995年上市(卬度) 常用量75mg/kg.d 短期療效較差，長期療效仍有爭議 副作用：關(guān)節(jié)痛、(常見)粒細(xì)胞減少(嚴(yán)重)、 鋅缺乏、胃腸反應(yīng)、肝功能異常, ICL670 三齒狀分子結(jié)構(gòu)三氮唑化合物 以2:1與Fe 3+結(jié)合 吸收快，在血循環(huán)中存活幾小時 效果為DFO的5倍，L1的10倍 劑量20mg/kg.d 副作用：胃腸反應(yīng)，皮疹。肝腎功能無影響。動物實驗?zāi)I小管上皮細(xì)胞有改變(非鐵超負(fù)荷),造血干細(xì)胞移植（HSCT） 是目前能夠根治重型地貧的一種治療方法 HSCT分為骨髓移植(BMT)、臍血移植(UCBT) 和外周血干細(xì)胞移植（PBSCT） 胎兒期予HSCT: 宮內(nèi)造血干細(xì)胞移植 (IUSCT),BMT治療重型地貧, 1982年首例成功 至今全世界應(yīng)用已達(dá)1000余例 長期生存率達(dá)80 供體來源困難，費用昂貴血,UCBT治療重型地貧, 1989年首例UCBT治療范可尼貧血成功 1995年泰國治療HbE地貧獲得成功 1998年1月中山二院在內(nèi)地開展首例 不少醫(yī)院開展，總數(shù)已超過100例 由血緣相關(guān)發(fā)展至無血緣相關(guān) HLA位點由全相合發(fā)展至13個位點不合,異基因外周血干細(xì)胞移植(Allo-PBSCT）, 1989年治療1例慢性白血病取得成功，血細(xì)胞分離機從外周血可采到足夠的造血干細(xì)胞供者無需麻醉，安全 PBSCT治療地貧國外從1996年開始，香港1998報告例，內(nèi)地1999年中山二院首例，各地陸續(xù)開展,宮內(nèi)造血干細(xì)胞移植,國外于1996年開始報告，但至目前僅數(shù)例 國內(nèi)尚未開展,基因治療, 根治性基因治療（基因矯正治療） 基因矯正治療是把正常的目的基因?qū)塍w內(nèi)，并達(dá)到適當(dāng)、有效、持久的表達(dá)，以完全取代原來的病態(tài)基因 地貧是珠蛋白基因的單基因缺陷遺傳病， 理論上是基因治療最理想的模型 1984年開始基因治療的研究，進(jìn)展緩慢，其原因之一是載體問題，二是轉(zhuǎn)導(dǎo)的珠蛋白基因片段的大小。,珠蛋白基因族 非常龐大，調(diào)控也非常復(fù)雜 珠蛋白基因組 上游基因調(diào)節(jié)元件即位點調(diào)控區(qū)(locus control region,LCR)的DNase敏感（hypersensitive,HS）片段（包括HS2、 HS3、HS4）對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達(dá)非 常重要。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 常用癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒（onco-retroviral vector）攜帶珠蛋白基因及其調(diào)節(jié)元件 將人珠蛋白基因?qū)胄∈蠹t白血病(MEL)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可成功表達(dá)珠蛋白 在小鼠動物模型上將基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染鼠造血干細(xì)胞,在受體紅細(xì)胞中獲得表達(dá)。將人珠蛋白基因?qū)氲刂泻Ｘ氀∈篌w內(nèi),其癥狀可獲得部分改善,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有如下缺點： 載體的容量有限（僅7kb左右），無法完全包含珠蛋白基因組及其上游LCR片段，因而表達(dá)效價低和不穩(wěn)定；不能轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞；病毒隨機插入靶細(xì)胞的基因組中可使插入點附近的基因表達(dá)失控，插入的基因也有可能不恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；病毒可能感染宿主；致癌作用，動物實驗已發(fā)現(xiàn)淋巴瘤發(fā)生。,慢病毒（lentivirus）載體,優(yōu)點是：載體容量大，能包含大片段的珠蛋白基因組及其上游調(diào)節(jié)元件，保證珠蛋白基因的高效、穩(wěn)定表達(dá)；可以轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞,并能永久表達(dá)。 常用的是HIV-1為基礎(chǔ)的慢病毒載體。,2000年May C等首次應(yīng)用攜帶有大片段的調(diào)節(jié)序列的人的珠蛋白基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞，人的珠蛋白基因有效、準(zhǔn)確的整合到宿主DNA中，并能高效表達(dá)，合成正常血紅蛋白可達(dá)17-24%，達(dá)到治療地中海貧血小鼠的目的。文章發(fā)表在Nature,Pawlin等（2001）、Imrens等（2002）、Persons等（2003）、Levasceur等（2003）、Rivella等（2003）報告采用同樣載體，在中間型地貧鼠（Hbbth3/+）模型中顯示每拷貝載體可使Hb增加1.12.3g/dl，血液參數(shù)明顯糾正,紅細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。,以上用的Hbbth3/+鼠為中間型鼠 為了更接近人重型地貧，Rivella等建立了重型地貧鼠模型。這種鼠如不治療將在68周內(nèi)死于嚴(yán)重貧血（Hb23g/dl） 用上述載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后則轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g型地貧鼠。由此提示治療人重型地貧時，采用這些載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或珠蛋白基因還需要更高的表達(dá)。,位點獨立性表達(dá)（position independent expression）：在鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)一個特征，盡管包含了或珠蛋白基因的調(diào)節(jié)元件，但或珠蛋白的表達(dá)在不同的鼠之間差異很大 雞HS4(cHS4)具染色質(zhì)隔離成分（chromatin insulator element），在癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已發(fā)現(xiàn)可減少位點作用差異（position effect variegation,PEV） cHS4元件具有阻斷增強子活性作用，可能有較好的載體生物安全性，對克服載體的致癌作用很重要。,Puthenveetil 等報告采用慢病毒載體，所包含的珠蛋白基因族中加入cHS4染色質(zhì)隔離成分,修正后的人地貧CD34細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中得到一致的紅系分化和糾正異常的地貧特征，移植入免疫缺陷鼠后，34個月后仍是紅系正常分化。,基因調(diào)控治療, 是廣義的基因治療 機理是根據(jù)地貧的病理生理基礎(chǔ)是鏈和非鏈合成速率的不平衡，藥物來激活非鏈珠蛋白基因的功能，增加非鏈珠蛋白的合成速率；或抑制珠蛋白基因功能，降低珠蛋白的成速率的合成速率； 減輕和非珠蛋白的失衡程度減輕臨床癥狀,基因調(diào)控治療主要有：, 藥物基因調(diào)控治療； 反義核酸性基因調(diào)控治療； 造血生長因子治療。 中藥治療,藥物基因調(diào)控治療 1982年首先報告應(yīng)用-氮胞核苷 許多藥物，如羥基脲、丁酸鹽、阿糖胞苷、馬利蘭、雷米封等都有研究報告 羥基脲（HU）的研究報告最多，效果也較好,羥基脲（HU）