《ChIP實驗》PPT課件.ppt

黃文鋒,2009年7月27日,主要內(nèi)容,何謂ChIP實驗技術(shù),ChIP技術(shù)基本步驟及注意事項,ChIP實驗技術(shù)的應(yīng)用,何謂ChIP實驗技術(shù),染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是 研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體反應(yīng)的特 異性，可以真實地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結(jié)合的狀況。,是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的 蛋白質(zhì)的重要方法。,是深入分析癌癥，心血管等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。,何謂ChIP實驗技術(shù),在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理，,將染色質(zhì)切成小段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相 結(jié)合的DNA片段沉淀下來。通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白,原理,質(zhì)與DNA相互作用的信息。,何謂ChIP實驗技術(shù),主要內(nèi)容,何謂ChIP實驗技術(shù),ChIP技術(shù)基本步驟及注意事項,ChIP實驗技術(shù)的應(yīng)用,ChIP技術(shù)的基本步驟,基本步驟,染色質(zhì)的斷裂,細(xì)胞的固定,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)及DNA的純化,細(xì)胞的固定,交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時， 具體時間根據(jù)實驗而定。,ChIP實驗利用甲醛在生理狀態(tài)下使蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)， 形成生物復(fù)合體，避免了DNA結(jié)合蛋白在染色質(zhì)上的 重新定位，或者在后續(xù)的生化分離中丟失。,甲醛是一種高分辨率的可逆的交聯(lián)劑,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)本身是動態(tài)的， 并且DNA與非組蛋白相互作用常是瞬時的。,注意事項,交聯(lián)時間過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響實驗結(jié)果。,交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。,甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。,ChIP技術(shù)的基本步驟,基本步驟,染色質(zhì)的斷裂,細(xì)胞的固定,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)及DNA的純化,染色質(zhì)的斷裂,超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引 起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。,交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波切成400600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電 泳檢測），以便暴露目標(biāo)蛋白，利于抗體識別。,注意事項,在超聲波斷裂染色質(zhì)時，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計時斷時續(xù)的 超聲程序，保證低溫。,超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生 泡沫。,總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。,ChIP技術(shù)的基本步驟,基本步驟,染色質(zhì)的斷裂,細(xì)胞的固定,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)及DNA的純化,染色質(zhì)免疫沉淀,Input 對照,Beads 選擇,抗體的選擇,陽性與陰性對照,Input 對照,Input對照可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶 序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取 樣比例換算出ChIP的效率。,在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對照。 Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng) 過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。,必不可少的步驟,染色質(zhì)免疫沉淀,Input 對照,Beads 選擇,抗體的選擇,陽性與陰性對照,Beads選擇,Magna beads是近年來出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便， 不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單， 而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時間。Millipore公司最新推 出的Magna ChIP試劑盒就是采用這種Magna beads。,利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體 復(fù)合物，然后使用Agarose beads（瓊脂糖小球）或Magna beads沉 淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次 洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù) 合物。,染色質(zhì)免疫沉淀,Input 對照,Beads 選擇,抗體的選擇,陽性與陰性對照,抗體的選擇,因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時，抗體的抗原表位可能因為與結(jié)合 位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫 沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。,不是所有的抗體都能做ChIP實驗的， 只有經(jīng)過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結(jié)果的可靠性，,實驗成功的關(guān)鍵,染色質(zhì)免疫沉淀,Input 對照,Beads 選擇,抗體的選擇,陽性與陰性對照,陽性和陰性對照,陽性抗體和陰性抗體 對照是最基本的實驗 對照,陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG。,陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體， 常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。,目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能 得出正確結(jié)論。,沒有對照就很難對實驗結(jié)果的可靠性進(jìn)行評估， 所以實驗對照顯得尤為重要。,陽性與陰性對照,還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能， 所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合 的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。,最佳的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。,注意,ChIP技術(shù)的基本步驟,基本步驟,染色質(zhì)的斷裂,細(xì)胞的固定,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)及DNA的純化,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化,用不含DNase的RNase和Proteinase K， 65oC保溫6小時逆轉(zhuǎn)交聯(lián)， 經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。,純化DNA的質(zhì)量越高，越有利于下一步PCR等方法的檢測。,ChIP技術(shù)的基本步驟,基本步驟,染色質(zhì)的斷裂,細(xì)胞的固定,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)及DNA的純化,DNA的分析鑒定,如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是 目的蛋白的序列，可以采用狹縫雜交和PCR分析。,如果目的蛋白質(zhì)的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因 組上的分布情況，找出反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)，可以采用 Southern 雜交，ChIP克隆和DNA芯片方法。,主要內(nèi)容,何謂ChIP實驗技術(shù),ChIP技術(shù)基本步驟及注意事項,ChIP實驗技術(shù)的應(yīng)用,ChIP技術(shù)的發(fā)展,其應(yīng)用范圍已經(jīng)從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用， 發(fā)展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用；,從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用， 發(fā)展到研究兩個蛋白與DNA共同結(jié)合的相互作用；,從研究啟動子區(qū)域的組蛋白的修飾，發(fā)展到 研究結(jié)合在DNA序列上的