高效液相色譜法教學(xué)課件【全】.ppt

高效液相色譜法,High Performance Liquid Chromatography （HPLC）,前言:,HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個(gè)分析化學(xué)分支，現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。,我國：,開始僅為少數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室擁有， 現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門都擁有。 廣泛應(yīng)用于： 質(zhì)量控制、分析化驗(yàn)、制備分離。 講課目的：入門 教材：實(shí)用色譜法（詹益興 編著） 學(xué)習(xí)要求：記好筆記， 以課堂教學(xué)內(nèi)容為主。,課時(shí)安排： 第一章：高效液相色譜的基本原理 4學(xué)時(shí) 第二章：高效液相色譜的儀器裝置 2學(xué)時(shí) 第三章：液固、鍵合相色譜 3學(xué)時(shí) 第四章：離子交換色譜和離子對(duì)色譜 3學(xué)時(shí) 第五章：凝膠滲透色譜 1學(xué)時(shí) 第六章：實(shí)驗(yàn)技術(shù)和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù) 1學(xué)時(shí) 復(fù)習(xí) 1學(xué)時(shí),參考書籍：,1.色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編） 2.高效液相色譜法 （鄒漢法、張玉奎、 盧佩章編著） 3.高效液相色譜方法及應(yīng)用 （色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、 于世林編著),11 概述 一、色譜法,混合物最有效的分離、分析方法。 是一種分離技術(shù)。 混合物分離過程：試樣中各組分在 固液兩相間不斷進(jìn)行著的分配。 一相固定不動(dòng)，稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定 相的液體，稱為流動(dòng)相。,第一章 高效液相色譜法基本原理,液相色譜儀,高效液相色譜儀流程圖,二、色譜法原理,混合物中各組份在不互溶的兩相中溶解、吸附等化學(xué)性能存在差異； 當(dāng)兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),各組分在兩相中 反復(fù)多次進(jìn)行平衡分配而達(dá)到相互 分離。,分離原理:,分離是一個(gè)物理過程。,固定相(Stationary Phase) 流動(dòng)相(Mobile Phase) 進(jìn)樣 (Injection) 洗脫 (Elution) 相互作用(Interaction),三、高效液相色譜法的特點(diǎn),高壓: 以液體作為流動(dòng)相，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到阻力較大 必須對(duì)流動(dòng)相施加高壓。 一般可達(dá)到150300kgcm2， 甚至可達(dá)700kgcm2以上。,高速: 分析時(shí)間較經(jīng)典液相色譜少得多（交換速度快），一個(gè)復(fù)雜樣品的分析僅需幾分鐘到幾十分鐘。,高效: 氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高（化學(xué)鍵合相），一般約可達(dá) 6000理論塔板米,高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)(10-9 g)； 熒光檢測器的靈敏度可達(dá)（10-11g）。 所需試樣很少；微升數(shù)量級(jí) 高選擇性 可分離不同類型化合物和異構(gòu)體，也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物 (同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物）,高效液相色譜法的特性:,高壓、高效、高速、高靈敏。 適用：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定樣品,四、HPLC與GC區(qū)別,1分析對(duì)象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)低的樣 品， 占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品. 對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差 樣品均可檢測 。 占有機(jī)物的80%,2流動(dòng)相的區(qū)別 GC：流動(dòng)相為惰性，組分與流動(dòng)相無相互作用 力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有相互作用 力，參與和影響色譜分離. 對(duì)分離起主要作用。 3操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓 說明：氣相、液相地位同樣重要 兩種互補(bǔ)不足的色譜方法 靈敏度：氣相液相 應(yīng)用范圍：液相氣相,五、色譜法的分類,吸附色譜(Absorption Chromatography) 組分對(duì)固定相表面吸附力的不同而分離 分配色譜(Partition Chromatography) 組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度不同而分離 離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography) 組份離子交換親和力的差異而分離 體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography) 組分分子量大小不同,對(duì)固定相的滲透力不同而分離, 基本概念 一、色譜圖,記錄儀所記錄的濃度對(duì)分離時(shí)間的函數(shù)，稱為色譜圖。,色譜過程特點(diǎn)：,濃度對(duì)分離時(shí)間呈高斯曲線型 色譜條件一定時(shí)，各組分都有一特定時(shí)間在圖譜中出現(xiàn)，稱為組分的保留時(shí)間。 柱效一定時(shí)，組分保留值越小，峰越窄；保留值越大，峰越寬。 相鄰峰的保留時(shí)間相差越大，越易分離。,二、色譜參數(shù),1. 保留時(shí)間-tR 從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時(shí)間，用tR表示。,2.分配系數(shù)K,在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度比（單位：g/mL），稱為分配系數(shù)K,分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。,K值小，先流出柱子； K值大，保留作用強(qiáng)，后 流出柱子。,分配系數(shù)K 的討論,一定溫度下，組分分配系數(shù)K越大，出峰越慢； 每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K 不同； 選擇適宜的固定相可改善分離效果； 各組分有不同K 值是分離的基礎(chǔ)（差移速度） 某組分的K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流 出。,3.容量因子k (capacity factor),一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。,1.與k都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有 關(guān)的常數(shù), 隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化 2. 容量因子可以由實(shí)驗(yàn)測得。 3.色譜的保留作用：組分理化性質(zhì)不同兩相間 分配量不同柱內(nèi)保留時(shí)間不同,4. 容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系,k太小-沒有充分利用填料的分離能力 k太大-分析時(shí)間太長 k范圍： k 1/0（0溶劑強(qiáng)度使組分遷移快慢 的能力） P310 表3-10,tR = to(1+k),5. 選擇性系數(shù),可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度， 用表示。,色譜理論需要解決的問題？,色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。,組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？ 組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制； （組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)） 色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制； （兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散） 兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。,1-3 色譜柱的分離效率,一、塔板理論,塔板理論認(rèn)為: 一根柱子可以分為n段，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。 設(shè)柱長為L，理論塔板高度為H，則 H=L/ 為理論塔板數(shù)。,理論塔板數(shù)一N 色譜峰對(duì)稱 ： 說明： a. 在給定的操作條件下，N幾乎相同 b. N為常量時(shí)，tw 隨 tR 成正比例變化 c. 與柱長有關(guān): 比較不同長度色譜柱的柱效 時(shí)，應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的N值。例 d. 是一種理想狀態(tài), 有拖尾峰時(shí): 可用半峰寬來表示N： N554 ( tR / W1/2 ) 2 W1/2 -半峰寬,例：測得tR=105mm、 W1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.,理論塔板高度H,物理意義：組分在兩相間達(dá)到一次平衡對(duì)應(yīng) 的柱長 H愈小組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多 柱效（不能說明分離一定實(shí)現(xiàn)）,說明：,大，固定相分離潛能大。 （分離與否，還取決于其他色譜條件） 一定色譜條件下，對(duì)k有差異的組 分，則柱效愈高，分離效果愈好。,塔板理論的特點(diǎn)和不足：,(1)當(dāng)L一定時(shí)，N 越大(H 越小)，被測組 分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越 高，所得色譜峰越窄。 (2)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離 效果：如兩組分的分配系數(shù)K 相同， 無論該色譜柱的柱效多大，都無法 分離。,(3)塔板理論無法解釋同一色譜柱在 不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出影響柱效 的因素及提高柱效的途徑。,二.峰擴(kuò)展和速率方程式,1.峰擴(kuò)展-由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱效的降低 峰擴(kuò)展程度：取決于組分在柱內(nèi)的 平衡分配次數(shù) 例： 引起峰擴(kuò)展因素：柱內(nèi)、柱外,2. 速率方程式（范弟姆特方程式）,H = A + B/u + C u H：理論塔板高度， u：流動(dòng)相流速(cm/s)。 減小A、B、C 三項(xiàng)可提高柱效。 A，B，C 三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？,A 渦流擴(kuò)散項(xiàng),A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑 ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp，填充得越均勻，A，H，柱效。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。,B/u 分子擴(kuò)散項(xiàng),B = 2 D D：試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（cm2s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H()，分離變差; (3) B/u與流速有關(guān)：流速 滯留時(shí)間 擴(kuò)散 (0.5ml/min) (4) 擴(kuò)散系數(shù)D，B 值。 液相中，分子擴(kuò)散可忽略,C u 傳質(zhì)項(xiàng),傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度 高的相不斷遷移至濃度低的相，直到 濃度達(dá)到平衡。 根據(jù)傳質(zhì)形式分： 固定相傳質(zhì) 移動(dòng)相傳質(zhì) C =（Cs + Cm）,固定相傳質(zhì)原因： 進(jìn)出固定相速度不同（固相，液相） 減小措施：使用薄的固定相層 小顆粒填料 移動(dòng)相傳質(zhì)原因：遷移 滯留 減小措施 填裝均勻緊密 使用小顆粒填料和表面 多孔性填料,3. 速率理論的要點(diǎn):,(1)柱內(nèi)的峰擴(kuò)展與渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力有關(guān)。,(2) 通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、液膜厚度及流?dòng)相流速可提高柱效。,(3) 為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對(duì)柱效及分離的影響。 選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。,4.獲得高柱效的幾種方法：,選用細(xì)的顆粒填料 流動(dòng)相流速低 流動(dòng)相粘度小 升高溫度 溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān) 大分子，擴(kuò)散系數(shù)小 小分子，擴(kuò)散系數(shù)大,5. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可忽略不計(jì)，即 H = A + C u,降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 氣相和液相區(qū)別, 分離度 (Rs),色譜分離目的： -合理的時(shí)間內(nèi)將樣品中組分成功分離 分離度：表示分離狀況的一種度量 分離度影響因素： 保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素； 峰的寬度色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素。,討論：,色譜分離中的四種情況：, 柱效較高，K(分配系數(shù))較大，完全分離。 K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。 柱效較低，K 較大，但分離的不好。 K 小，柱效低，分離效果更差。,一分離度的數(shù)學(xué)表達(dá)式：,R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%； R=1：分離程度98%(達(dá)到定性定量分析的最低要求) R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰達(dá)到基線分離）。,對(duì)濃度不同組分而言：,兩個(gè)組分的分離度會(huì)隨濃度比的增大而 減小 例： 對(duì)多組分而言： 整個(gè)色譜分離的分離度取決于Rs最小值 的兩個(gè)峰。,二分離度影響因素 峰的寬度（峰寬越小， Rs越大） 峰的寬窄主要反映了色譜分離的動(dòng)力學(xué)特性 兩峰的保留時(shí)間之差（tR越大， Rs越大） 反映了色譜分離的熱力學(xué)特性 分離度基本 關(guān)系式：,四控制分離度方法,改變k 調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度可以改變k 增大-使用較弱溶劑 降低-使用較強(qiáng)溶劑 正相色譜-固定相極性大于移動(dòng)相 （溶劑極性大溶劑強(qiáng)度大洗脫能力強(qiáng)?。?反相色譜-固定相極性小于移動(dòng)相 （溶劑極性大溶劑強(qiáng)度小洗脫能力弱大） P307311,例: 流動(dòng)相極性變化對(duì)組分k的影響,更換色譜柱（改變N）,措施： a.選擇長柱子(N=L/H) b.填料顆粒盡量小 c.低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴(kuò)展小) d.低的溶劑粘度(提高柱效) e.提高柱溫,改變選擇性系數(shù),（ =1， 不能實(shí)現(xiàn)分離),下列途徑改善： a.流動(dòng)相 梯度洗脫洗脫過程中，流動(dòng)相組成隨 時(shí)間的變化而變化 P279（適用于極性范圍寬的樣品） b.固定相(換柱，改變填料） c.溫度（改變熱力學(xué)參數(shù)）,五. 分離度控制的一般原則:,開始k值很小，若要增大Rs，則首先應(yīng)將k調(diào)整至1 k 10范圍，這樣，不用改變其他條件，就可使Rs增大。 開始k已在1 k 10范圍，但Rs不大，則必須增大N來改善Rs。 k，N的改變都不能增大Rs時(shí)，再設(shè)法改變,第二章 儀器裝置 四大部件： 高壓輸液泵 進(jìn)樣器 高效分離柱 檢測器,21 高壓輸液泵 作用：向色譜柱輸送一個(gè)連續(xù)、恒定的移動(dòng)相。 一、對(duì)泵系統(tǒng)的要求 1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護(hù)等） 2.更換洗脫液容易、死體積小 3.有最大工作壓力(20MPa，130MPa) 4.一定流量范圍（直徑小，流量?。凰俣瓤?，流 量大。）（0.110ml/min) 5.流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動(dòng)、流量漂 移） 6.流量精度高,機(jī)械往復(fù)式柱塞泵的工作原理：,特點(diǎn)：,能連續(xù)供給恒定體積的移動(dòng)相，不受整個(gè)色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。 死體積較小，約0.1ml，更換溶劑方便，適用于梯度洗脫。 缺點(diǎn)： 輸出有脈沖波動(dòng) 二個(gè)因素：脫氣不完全 泵的周期性吸液 影響檢測靈敏度。（對(duì)紫外檢測器影響不大）,梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢,高效：填料顆粒分離效率柱壓降 泵的工作壓力 分析時(shí)間短：更快流速柱壓降 (超快速分析） 減少洗脫液用量 (4.6mm1mm，流量減少20倍) 液相色譜的多元洗脫系統(tǒng) P277280,22 色譜柱,組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭 要求：柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設(shè)計(jì)要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積（柱前、柱后） 能密封高壓液體 兩端加過濾片,柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱效的影響因素,填料的顆粒度及其均勻性 柱長、填裝的方法與技巧 常用：內(nèi)徑25mm（4.6mm) 柱效一定時(shí)，柱長與顆粒度成正比 例如：顆粒度510um、柱長1530cm 顆粒度35um、 柱長7.515cm P282283,23 進(jìn)樣裝置,六通進(jìn)樣閥 P280281 結(jié)構(gòu)如圖：,2-4 檢測系統(tǒng) 功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時(shí)間 變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號(hào)輸入到記錄儀中，得到色譜圖。 按檢測方式不同，分為： 總體性質(zhì)檢測器（通用型） 示差折射檢測器 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器,檢測器的性能指標(biāo) 一個(gè)理想檢測器，必須具備下列條件： 靈敏度高 不受溫度及流動(dòng)相流速變化的影響 響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化 穩(wěn)定性好，操作方便,衡量指標(biāo)： 靈敏度 S=R/Q 噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出的最大 振幅（溫度、流量、泵） 漂移檢測器在一段時(shí)間內(nèi)，基線隨時(shí)間的增 加而產(chǎn)生的偏離（電壓、流動(dòng)相） 最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號(hào)時(shí)的 （檢測下限） 濃度 線性范圍檢測信號(hào)呈線性變化時(shí)，最大和最 小進(jìn)樣量之比,檢測器,紫外檢測器 （光電二極管陣列檢測器） 示差折光檢測器 熒光檢測器 電導(dǎo)檢測器,a.紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)：,靈敏度高； 線性范圍寬； 流通池可做得很小(1mm 10mm ，容積 8L)； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作 (波長范圍，常用波長） 200400nm 254nm、280nm 可用于梯度洗脫。,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。,光電二極管陣列檢測器,三維：光譜-色譜圖,檢測原理 比爾定律： A=c L 紫外檢測器優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高（1010g/ml) 對(duì)梯度洗脫是一種理想檢測器 局限性： 不能檢測對(duì)紫外光沒有吸收的樣品 不能使用對(duì)紫外光有吸收的溶劑 P289293,第三章 液固色譜和鍵合相色譜,31 液固吸附色譜 一、原理: 固定相是極性吸附劑，不同組份官能團(tuán)具有不同極性，因而對(duì)固定相的吸附能力不同。 極性越大，吸附能力越強(qiáng)；極性越低，吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。,存在競爭吸附：吸附解吸平衡 溶質(zhì)、流動(dòng)相分子之間 溶質(zhì)中不同官能團(tuán)之間 競爭的結(jié)果，導(dǎo)致了分離。 溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用： 固定相的吸附力 流動(dòng)相的溶解力 當(dāng)吸附力溶解力 k大 吸附力溶解力 k小,二分離對(duì)象：,官能團(tuán)有差別的不同類型化合物 （烷基類吸附弱，不能分離） 幾何異構(gòu)體 (固定相表面是剛性結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子官能團(tuán)與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變）,三填料的類型及其選擇,按形狀分： a. 球形 b. 無定形 按多孔程度分： a. 多孔型 b. 薄殼型 按極性分： a. 極性（硅膠、Al2O3 、MgO、分子篩） b.非極性（活性碳）,四、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化,硅膠的特點(diǎn)： 活性控制意義： 標(biāo)準(zhǔn)化方法： 市售未處理硅膠加熱46小時(shí)，活化去水，再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。 （100m2表面積含水0.020.03g為佳）,吸附強(qiáng)度分類,根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型，可將它們 在硅膠上 的吸附強(qiáng)度排序：P315 歸納： 官能團(tuán)不同極性不同吸附強(qiáng)度不同 幾何異構(gòu)體空間位置不同吸附強(qiáng)度不同 P314-316 P331-333,分子空間效應(yīng)。 與官能團(tuán)相鄰的大烷基可能降低保留能力；（位阻效應(yīng)） 順式化合物的保留能力可能比反式化合物強(qiáng)； 對(duì)位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強(qiáng)。,五樣品分子結(jié)構(gòu)對(duì)保留的影響,對(duì)吸附色譜來說, 主要取決于樣品分子所含的官能團(tuán)的類型及其數(shù)目。 常見官能團(tuán)的吸附強(qiáng)度： 不吸附：烷烴 弱吸附：烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳 烴、鹵代芳烴 中等吸附：多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多 數(shù)羰基化合物 強(qiáng)吸附：醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多 官能團(tuán)化合物,六、 液相色譜的流動(dòng)相,1. 流動(dòng)相實(shí)用要求 （1）溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足 色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。,（2）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。 （使用AI2O3-避免酸、使用硅膠避免堿）,（3）溶劑應(yīng)不干擾使用檢測器的正常工作，與檢測器相匹 配。 使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對(duì)分離組分的回收。,2. 流動(dòng)相分類,按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：一般淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、 正戊烷 正庚烷 反相: 甲醇、乙腈、水溶液。,LSC 流動(dòng)相的選擇,在吸附色譜中, 對(duì)溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用, 流動(dòng)相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當(dāng)范圍內(nèi)。 溶劑強(qiáng)度洗脫能力 k 液固吸附色譜的流動(dòng)相值要適當(dāng)， 常用正己烷、正庚烷, 添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。 (混合后的溶劑強(qiáng)度在兩種純?nèi)軇┲g）,液固色譜的應(yīng)用特點(diǎn)： 對(duì)具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選 擇性，但對(duì)同系物的分離能力較差 對(duì)強(qiáng)極性或離子型樣品，因有時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆 吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果。 吸附劑的含水量對(duì)吸附劑活性、樣品容量和保 留值有較大影響 液固吸附色譜主要應(yīng)用于: 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。,思考：在液固色譜中，以硅膠為固定相，對(duì)以下四 組分進(jìn)行分離，流出色譜柱的順序可能是： a.鄰苯二胺 b對(duì)苯二胺 c間苯二胺 a. 苯酚 b. 對(duì)羥基苯胺 c. 苯胺 d. 苯,1 2,3-2 反相鍵合相色譜,鍵合相色譜是目前HPLC中最常見的分離模式, 約80%的HPLC是采用反相鍵合相色譜。 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,反相鍵合相色譜 定義固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分 子以共價(jià)鍵結(jié)合在色譜擔(dān)體的表面， 這種色譜類型稱之。 制備硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相注意點(diǎn)： 鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。 除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。,形成化學(xué)鍵合固定相 具備條件： 所用基質(zhì)材料 應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性 有能與基質(zhì)表面發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán),化學(xué)鍵合固定相 (P303),a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣 c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：,（1）傳質(zhì)快: 表面無深凹陷。 （2）壽命長: 化學(xué)鍵合，耐流動(dòng)相沖擊； 穩(wěn)定。 （3）選擇性好: 可鍵合不同官能團(tuán)，提高選 擇性 （4）有利于梯度洗脫。 由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴(kuò)展了反相色譜分離技術(shù)的應(yīng)用。反相色譜正相色譜,存在著雙重分離機(jī)制：,由鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主。 常用反相鍵合固定相： C18、C8 P300P302,反相色譜保留機(jī)理,兩種觀點(diǎn): 疏溶劑理論 （溶質(zhì)與極性溶劑疏遠(yuǎn)） 雙保留機(jī)理 （殘留羥基）,影響溶質(zhì)保留的因素 流動(dòng)相 組分的保留隨流動(dòng)相極性的減少而減少, ln k H2O % , 有機(jī)溶劑% 增大, 極性下降, k值隨之下降。,思考：在ODS柱上，用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脫苯系物，哪一種流動(dòng)相使苯系物的保留值大，為什么？, 鍵合固定相： a.烷基覆蓋量增加，k值隨之增大。 b.烷基鏈長增加, k值隨之增大。 思考： 同樣是70%甲醇流動(dòng)相，苯在C18比C8柱上的保留值大，為什么？, 溶質(zhì) 非離子化合物：極性大, k值小 非極性化合物：分子表面積大, k值大 同系物：鏈長增大, k值增大 苯系物：環(huán)數(shù)增大, k值增大; 若化合物的非極性部分相同, 極性官能團(tuán)增 加, 則k值下降 幾何異構(gòu)體：能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合 物 k值大。,反相色譜中流動(dòng)相選擇,水有機(jī)改善劑 常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán) 極性：有機(jī)改善劑水 洗脫能力：有機(jī)改善劑水 極性順序：甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃 洗脫能力：水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃,反相鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)：,流動(dòng)相可選用水溶性 樣品的溶解度范圍提高 流動(dòng)相可變性大 柱重現(xiàn)性好 固定相表面化學(xué)能低 平衡容易 梯度洗脫 固定相選擇多 固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好,缺點(diǎn)：,流動(dòng)相PH范圍要控制（PH28） pH太低：Si-C鍵易斷裂 pH太高：硅膠基質(zhì)易溶解 游離的硅羥殘基影響分離（封尾） P328-331,思考 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,出峰順序？ 如何選擇色譜條件？ 如何優(yōu)化分離？,第四章、離子交換色譜，離子對(duì)色譜,離子交換色譜： 適用于離子型物質(zhì)的分離和分析,4-1 離子交換色譜 一.原理：用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。,原理： 流動(dòng)相(溶質(zhì)離子)+離子交換劑(反離子), 平衡時(shí)，平衡常數(shù)為,控制k可以改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度 注：只有當(dāng)溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時(shí)，才能在離子 交換柱上有保留 (流動(dòng)相p和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù)),二、離子交換劑 陽離子交換劑帶負(fù)電荷官能團(tuán) -SO3-(磺酸型）、 -COO-(羧酸型） 陰離子交換劑帶正電荷官能團(tuán) NH3（氨基型）、NR3（季胺型）,常見：硅膠為基體的鍵合相離子交換劑 例,pH對(duì)交換容量的影響：,強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性離子交換劑，交換性能不受pH影響，交換容量恒定。 弱酸性陽離子交換劑，在較高pH條件下 弱堿性陰離子交換劑，在較低pH條件下 發(fā)生離子交換 pH與交換容量關(guān)系圖,三、離子交換色譜的影響因素,流動(dòng)相PH的影響 例：弱酸 ：HAH+A- PHA- 交換能力tR PHA- 交換能力tR 弱堿：-NH2+H+-NH3+ PHNH3+ 交換能力tR PHNH3+ 交換能力tR 對(duì)分離不同PKa的酸堿是個(gè)有利因素 例,流動(dòng)相中反離子的 形式和濃度 交換平衡常數(shù)KB/A： 反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小 親合力影響因素： a.電荷數(shù)親合力 b.離子的水合體積親合力 c. 離子極化率親合力,對(duì)磺酸型陽離子交換樹脂， 一價(jià)陽離子的洗脫強(qiáng)度順序： Cs+Rb+ K+NH4+ Na+H+ Li+ 二價(jià)陽離子的洗脫強(qiáng)度順序： Ba2+Pb2+ Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+ 對(duì)季胺型陰離子交換樹脂，陰離子的洗脫強(qiáng)度順序： ClO4- I- HSO4- SCN- NO3- Br- NO2- CN- Cl- BrO3- OH- HCO3- H2PO4- IO3- CH3COO- F- 注：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度常用Na2SO4、NaNO3, 不采用NaCI 增加離子強(qiáng)度類似于增加洗脫強(qiáng)度,三者相互作用力關(guān)系： .溶質(zhì)對(duì)R+的親合力交換能力 tR .流動(dòng)相離子對(duì)R+親合力 洗脫能力 tR 有機(jī)溶劑影響 有機(jī)溶劑溶劑強(qiáng)度 洗脫能力 k P335337,四.離子抑制法,定義在反相色譜中，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值，抑制組分解離，增加其在固定相上 的保留，以達(dá)到分離的目的。,分離對(duì)象：弱酸、弱堿性物質(zhì) k影響因素：與流動(dòng)相pH值有關(guān) 弱酸 HA: pHHA 疏水締合tRk pHHA 疏水締合tRk 弱堿A: pHHA+ tR k pHHA+ tR k pH- k關(guān)系曲線圖 但對(duì)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿不適合。為什么？,4-2 離子對(duì)色譜 P333335,定義-將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子(反離子)，加 到流動(dòng)相中與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)，能 夠在兩相之間進(jìn)行分配。 反相離子對(duì)色譜： 非極性的疏水固定相(C18柱)，含有反離子Y+的甲醇-水或 乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)X-Y+。 X+水相 + Y-水相 = X+Y-有機(jī)相,基本原理：,X+水相 + Y-水相 = X+ Y-有機(jī)相 形成的離子對(duì)化合物X+Y-，在兩相間進(jìn)行分配 平衡常數(shù)：,溶質(zhì)的容量因子k為：,容量因子隨KXY和Y-水相的增大而延長，而KXY取決于反離子和固定相的性質(zhì)，則控制流動(dòng)相中加入的反離子特性和濃度可以調(diào)節(jié)組分保留時(shí)間，達(dá)到提高色譜分離選擇性的目的。,常見：固定相：化學(xué)鍵合相 流動(dòng)相：緩沖溶液（含反離子) 有機(jī)改善劑 離子對(duì)試劑:,陰離子分離：常用烷基銨類（十六烷 基三甲胺、四丁基胺） 陽離子分離：常用烷基磺酸鹽(己烷磺 酸鈉、高氯酸鹽)。,四、影響反相離子對(duì)色譜分離選擇性因素,1.溶劑極性的影響 極性有機(jī)溶劑比例洗脫強(qiáng)度k 2.離子強(qiáng)度的影響 水溶液中離子強(qiáng)度 洗脫能力 k 3.PH值的影響 弱酸：PH值接近7組分完全電離最易形成 離子對(duì)k最大 PHX-HX 固定相中離子對(duì)減少k 一般：PH=27.4 PH8 硅膠溶解,4.離子對(duì)試劑性質(zhì)和濃度的影響 離子對(duì)試劑烷基鏈?zhǔn)杷跃喓衔?k 無機(jī)鹽離子對(duì)試劑疏水性減少締合物k 離子對(duì)試劑濃度：10-410-2mol/L 5.溫度的影響 流動(dòng)相粘度大, 溫度柱效,思考: 1.反相離子對(duì)色譜中，那些因素影響組分的保留？如何影響？ 2.離子交換色譜中，溶質(zhì)、固定相、流動(dòng)相三者間具有怎樣的關(guān)系？它們是如何影響組分的保留的？,第五章: 體積排阻色譜法 (凝膠色譜法),根據(jù)化合物分子大小和形狀差別進(jìn)行分離的方法 分離對(duì)象: 高分子化合物、生物大分子樣 品、蛋白質(zhì)樣品。 固定相：凝膠(具有一定大小孔徑分布),原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快； 凝膠色譜的校正曲線 MV關(guān)系曲線 (分子量越小，滲透越深，洗脫體積越大）,凝膠色譜特點(diǎn)：,a.樣品峰全部在溶劑的保留時(shí)間前洗脫 b.柱內(nèi)的峰擴(kuò)展較小 c.峰較窄，有利于檢測 d.采用示差檢測器 不足：a.峰容量小 b.不能分離大小相似、分子量接近 的組分,固定相,（1）半剛性凝膠 高交聯(lián)度的聚苯乙烯，孔徑范圍較寬。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。 孔徑10nm 分子量103 孔徑10200nm 分子量50107 （2）剛性凝膠 多孔硅膠，它既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作，但易拖尾。,凝膠的選擇:,滲透極限可以分離的最高分子量 （與孔徑有關(guān): 孔徑大，滲透極限大） 分離范圍校正曲線的線性部分 不同凝膠有不同的滲透極限和分離范圍,移動(dòng)相選擇 P321326, 339 341,a.能溶解樣品 b.不應(yīng)造成填料太大的溶脹或收縮 c.控制PH和離子強(qiáng)度，可消除非排除機(jī)理的影響 （離子強(qiáng)度0.050.1 常用磷酸鹽或硫酸鹽 PH接近中性為宜） d.盡量降低溶劑粘度（加電介質(zhì)） e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑，提高靈敏度 樣品濃度：0.010.5% 常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋 喃、水溶液,色譜分離方法的選擇,要正確地選擇色譜分離方法，必須做到 了解樣品的有關(guān)性質(zhì). 熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。 選擇色譜分離方法的主要依據(jù)： 樣品的分子量的大小， 在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程 度 化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。,一、分子量 對(duì)于分子量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。 分子量在2002000的化合物，可用液固吸附、鍵合相色譜和離子交換色譜法。 分子量高于2000，則可用排阻色譜法。,二、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和離子對(duì)色譜法； 微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法； 油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物，可用液-固色譜法。,三、化學(xué)結(jié)構(gòu) 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，可首先考慮用離子交換色譜。 異構(gòu)體的分離可用液固色譜法； 同系物可用反相鍵合相色譜法； 對(duì)于高分子聚合物，可用體積排阻色譜法,小結(jié):,a.已知結(jié)構(gòu)試樣查閱文獻(xiàn)資料以其他色譜分離技術(shù)作參考 b.分子量較大（M2000）蛋白質(zhì)、高聚物凝膠色譜法 c.分子量較小（ M2000）試樣多種溶劑中溶解度情況決定分離類型、填料、流動(dòng)相 由于試樣組分的復(fù)雜性，還需對(duì)試樣的來源、性質(zhì)等作詳細(xì)了解，以作選擇參考。,分離類型選擇,應(yīng)用 目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì)，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。,例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。,農(nóng)藥的分析,第六章、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和輔助實(shí)驗(yàn)技術(shù),61 定性和定量分析 一、定性分析 利用保留值定性 a.與標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照 b.將標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品中 c.二極管陣列檢測器 液相-質(zhì)譜聯(lián)用 收集洗脫液后定性分析,二、定量分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法） 是一種簡便、快速的絕對(duì)定量方法。 步驟： 用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將被測組分在相同的色譜條件下進(jìn)樣，由峰面積或峰高根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其濃度 特點(diǎn)： 適用于大量分析 色譜條件完全相同,歸一化法（所有組分都出峰,并在檢測器上都 有信號(hào)） 內(nèi)標(biāo)法（選取合適內(nèi)標(biāo)物。準(zhǔn)確度，精密度 較好） 標(biāo)準(zhǔn)加入法（加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用加入 前后峰面積變化計(jì)算）,三、影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度因素,樣品制備 a. 樣品溶劑與洗脫液互溶性好 b. 將干擾組分盡可能分離 c.含量低時(shí)必須富集 回收率試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)物加入到已知含量被測樣 品中用制備樣品同樣方法處理定量 測定，得回收率。 回收率（測定值樣品值）/加入量 目的：檢驗(yàn)被測組分在制備中是否100%定 量轉(zhuǎn)化,儲(chǔ)存條件：低溫、干燥、避光 樣品制備方法：a.溶解（超聲波、離心） b.濃縮 c. 萃取 d.預(yù)分離 e.衍生化 進(jìn)樣技術(shù) 影響因素：a.進(jìn)樣裝置的準(zhǔn)確度和精度 b.分析人員對(duì)進(jìn)樣技術(shù)的熟練程度 進(jìn)樣六通進(jìn)樣閥 定量：進(jìn)樣管34倍,檢測器特性 穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準(zhǔn)確性 a.被測組分濃度和響應(yīng)值呈線性關(guān)系 b.進(jìn)樣量不能超出線性范圍 注：定量分析不宜采用梯度洗脫（基 線易漂移）,62 HPLC實(shí)驗(yàn)技術(shù),一、色譜柱的保養(yǎng) 新柱要作凈化處理 平時(shí)使用： a.正式進(jìn)樣前，先用流動(dòng)相沖平衡 b.一種流動(dòng)相換另一種時(shí)，需互溶 柱的儲(chǔ)存： 儲(chǔ)存于相對(duì)惰性溶劑中（反相柱用甲醇） 對(duì)復(fù)雜樣品或易污染樣品，應(yīng)裝預(yù)柱 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，當(dāng)洗脫液用緩沖液，應(yīng)先水沖柱甲醇保護(hù),二、流動(dòng)相的處理,流動(dòng)相的脫氣 原因：a.高柱壓下流動(dòng)相中空氣，會(huì)在柱 的洗 脫液流中形成氣泡，干擾檢測器信號(hào)。 b.除去氧（氧易與固定相、流動(dòng)相反應(yīng)， 不利于柱穩(wěn)定） 脫氣方法：a.真空脫氣法 b.惰性氣體吹脫法 c.超聲波脫氣法,流動(dòng)相的純化 a.將溶劑通過干燥的多孔硅膠漏斗（0.45) b.在進(jìn)樣器之前設(shè)置預(yù)柱，將雜質(zhì)吸附掉 流動(dòng)相配制 a.先配制再脫