




已閱讀5頁,還剩13頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用,高通量篩選( HTS)又稱大規(guī)模集群式篩選,是由高容量 化合物庫、自動化操作、高靈敏度檢測、高特異篩選模型、 高效率數(shù)據(jù)處理 5 個子系統(tǒng)有機組合而成,是一種新型、 高自動化、高靈敏度、高通量的篩選技術(shù)。,其理論基礎(chǔ)是反向藥理學(xué)( reversepharmacology),即基 于受體、酶及離子通道等分子、細胞水平藥物作用靶點, 從 現(xiàn)有化合物庫中篩選出具有生物活性的先導(dǎo)化合物,在此基 礎(chǔ)上再進行組織、器官及疾病相關(guān)動物模型研究,TEXT,高通量篩選技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,TEXT,高通量篩選技術(shù)在酶工程領(lǐng)域的應(yīng)用,TEXT,高通量篩選技術(shù)在基因領(lǐng)域的應(yīng)用,高通量篩選( high-throughout screening)是近年來迅速發(fā)展起來的藥物篩選技術(shù) ,它通過運用基 因科學(xué) 、蛋白質(zhì)科學(xué) 、分子藥理學(xué) 、細胞藥理學(xué) 、微電子技術(shù)等多學(xué)科理論和技術(shù) , 以及與疾病相關(guān)的酶和受體為作用靶點 ,對天然或合成化合物進行活性測試 , 并在此基礎(chǔ)上進行篩選 。 高通量篩選具有快速 、高效 、經(jīng)濟 、高特異性等優(yōu)點 ,其中所用的樣品量甚少的特點 尤其適用于天然化合物的活性篩選,藥物高通量篩選技術(shù)分類(篩選平臺):分子平臺、細胞平臺、酵母平臺、動物平臺,動物平臺。前兩種平臺都是體外模型,有些藥物在 體外模型中雖然能夠顯示良好活性,但是進入動物 體內(nèi)檢測的時候活性卻大大降低,甚至沒有活性。 主要原因是由于在動物體或人體中, 藥物作用的發(fā) 揮不僅需要藥理活性,還與它的分布、吸收、代謝、 排泄有關(guān)。有些體外活性良好的藥物,由于脂水分 配系數(shù)問題, 導(dǎo)致機體不能吸收,或是不能正確分 布到作用靶位點,所以體內(nèi)活性大幅度降低。動物 平臺是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù),在一些疾病的研 究上已經(jīng)顯現(xiàn)了重要作用,但仍舊需要不斷完善。,由于天然藥物中成分復(fù)雜性及多種成分間可能存在的協(xié)同作用 , 因此有效成分的分析 、鑒定和篩選是天然藥物開發(fā)中的一個難題。同時,許多天然藥物臨床資料相對不足, 仍需要進行必要的再認識和驗證 。面對海量的天然藥物 , 高通量篩選技術(shù)特有微量 、快速 、靈敏和準(zhǔn)確等特點。,特點:理性設(shè)計和定向進化,現(xiàn)階段人們還沒有完全掌握對酶的空間構(gòu)象預(yù)測 、結(jié)構(gòu)分析 等技術(shù) , 所以試圖通過理性設(shè)計達到改善酶特性的目的仍然很 難實現(xiàn) , 因此 , 通過非理性設(shè)計特別是定向進化技術(shù)來改造酶 特性的策略依然是人們關(guān)注的焦點。 酶的定向進化包括兩個重要的步驟 , 首先是變異體庫的建立 , 其次是對最適突變體的篩選與鑒定,篩選方法分類:,分光光度測量法和熒光檢測法:,Rey mo nd 與其同事利用 傘形酮建立了一種巧妙的 高通量篩選方法優(yōu)點在于 底物能在比較高的溫度或 者比較寬的 pH 范圍內(nèi)保 持穩(wěn)定 , 并且可以通過構(gòu) 建不同的底物來檢測不同 的酶 。,酸檢測法:是一種經(jīng)常應(yīng)用于脂肪酶或者酯酶的高通量篩選方法 , 主要包括 pH 指示劑法 、乙酸法以及最近出現(xiàn)的熒光鈉鹽法 。,熒光鈉鹽( uoresceinsodium salt ) 是一種具有綠色熒光的有機鹽 , 當(dāng)用該鹽作為酶促反應(yīng)的指示劑時 , 隨著反應(yīng)體系中酸的增加 , 該鹽的熒光會逐漸被 H +離子所淬滅 , 因此 , 通過檢測其在 495 nm 處吸光值的變化我們便可以檢測出酶促反應(yīng)的速率,酵母表面展示技術(shù) ( Surface Display)是一類篩選蛋白質(zhì)突 變體庫的高通量篩選方法, 在抗體蛋白的研究中應(yīng)用尤其廣 泛, 具有高效、靈敏等特點。,基本原理:將外源目的蛋白基因整合到特定的載體后, 通過 電轉(zhuǎn)或其他的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入酵母細胞, 用酵母細胞內(nèi)蛋 白轉(zhuǎn)運機制將目的蛋白移至細胞表面并且固定在細胞膜上。,酵母表面展示技術(shù):作為真核表達系統(tǒng), 它具有的翻譯后加工 機制對真核蛋白來的表達來說其優(yōu)越性是顯而易見的 ; 其次, 該方法將酶固定在細胞的表面, 從某種意義上來說它起到了固 定化的效果, 而這種效果有可能顯著的提高酶的活力或者對映 選擇性; 最后, 它是一種真正意義上的高通量篩選方法, 通過熒 光激活細胞分選系統(tǒng),每次可以對106 1010個突變體進行篩選,RNA干涉(RNAi)在實驗室中是一種強大的實驗工具, 利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)序列特異的 目標(biāo)基因的沉寂,迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉 寂通道中起中心作用,是對特定信使RNA(mRNA)進 行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物, 是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。,因此, 高通量 siRNA 篩選技術(shù)也成為生物學(xué)最強有 力的研究工具之一,高通量篩選技術(shù)在基因領(lǐng)域的應(yīng)用:,將文庫siRNA逐一轉(zhuǎn)染到孔板的每個孔, 72 h后, 基因被沉默降低到一定程度。加入包被I-SceI的腺病毒, 侵染細胞過表達I-SceI。 48 h后, 細胞內(nèi)sensor上靶點序列被I-SceI切割, 誘導(dǎo)同源重組。 將細胞固定染色, 通過高通量篩選儀器獲取信號, 進行分析統(tǒng)計。,逐一篩選法:,包括4個步驟: 針對基因編碼區(qū)靶點的DNA序列在芯片上合 成后,通過公用的接頭, PCR克隆進入慢病毒載體,并包 裹病毒;將慢病毒文庫侵染細胞,啟動shRNA序列表達的 序列被整合到細胞基因組上,而沉默細胞內(nèi)該基因的表達; 在特定時間、藥物誘導(dǎo)下,存活下來的細胞得以擴增;提 取細胞的基因組,深度測序,找到相應(yīng)shRNA拷貝數(shù)。,文庫篩選法:,高通量siRNA篩選的新發(fā)展方向:,基于自組裝細胞芯片的細胞遷移篩選流程圖,自組裝細胞芯片是在一張玻璃片上覆蓋 PNI膜,通過 刻蝕產(chǎn)生規(guī)則的小孔矩陣。PNI 膜具有溫度敏感性, 低溫下遇水快速溶解, 細胞無法在其上生長。 每個 小孔的孔徑可以根據(jù)需要進行適當(dāng)調(diào)節(jié), 保證其中 容納的細胞數(shù)在 1 000 個左右,具有統(tǒng)計意義。通過 反向轉(zhuǎn)染,可以在刻蝕產(chǎn)生的小孔內(nèi)點上 RNAi 文庫; 在整個芯片上鋪細胞,形成細胞島,每個小島就是一 個獨立的樣本。一張 4 cm2 的芯片上,可以容納 1212 個點,篩選容量超過一個 96 孔板。自組裝芯 片具有良好的平行性,孔與孔之間交叉污染極少,可 以有效地保證實驗準(zhǔn),高通量篩選技術(shù)具有以下幾方面的發(fā)展趨勢: 采用基于細胞的分析篩選方法,可直接在活細胞內(nèi)檢測化合物,提高篩選的準(zhǔn)確性; 采用精確的檢測
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 高質(zhì)量融合的內(nèi)涵與意義探討
- 2025至2030中國雞疫苗行業(yè)產(chǎn)業(yè)運行態(tài)勢及投資規(guī)劃深度研究報告
- 殘疾人就業(yè)促進與職業(yè)發(fā)展支持協(xié)議書
- 低碳經(jīng)濟背景下綠色金融支持新能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究
- 直播帶貨在火山口的新機遇挑戰(zhàn)與機遇并存
- 2025至2030土豆行業(yè)發(fā)展趨勢分析與未來投資戰(zhàn)略咨詢研究報告
- 行業(yè)視角下的虛擬禮物碳積分體系建設(shè)方案
- 2025至2030中國羽毛服裝行業(yè)運營態(tài)勢與投資前景調(diào)查研究報告
- 浙江大學(xué)科研培訓(xùn)心得體會
- 2025至2030中國自行車壓路機行業(yè)產(chǎn)業(yè)運行態(tài)勢及投資規(guī)劃深度研究報告
- 2024年河北省張家口市“三支一扶”招聘130人(高頻重點復(fù)習(xí)提升訓(xùn)練)共500題附帶答案詳解
- 2023年遂寧市船山區(qū)選調(diào)教師考試真題
- CJJT259-2016 城鎮(zhèn)燃氣自動化系統(tǒng)技術(shù)規(guī)范
- 合伙人散伙分家協(xié)議書范文
- 園林綠化移樹合同
- 醫(yī)療機構(gòu)保潔人員培訓(xùn)
- 企業(yè)員工健康促進計劃的設(shè)計與實施
- 助理工程師答辯演示
- 成人失禁相關(guān)性皮炎的預(yù)防與護理-護理團標(biāo)
- 裝載機的基礎(chǔ)知識-裝載機的結(jié)構(gòu)及儀表
- 現(xiàn)代低壓電器技術(shù) 課件 2. 常見低壓電器
評論
0/150
提交評論