臨床初級(jí)基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué).ppt

臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué),重點(diǎn)：末梢血采集方法和血涂 片制備技術(shù)。 難點(diǎn)：各種抗凝劑的優(yōu)缺點(diǎn)和使用選擇。 內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 趙文海,緒 論,一、臨床檢驗(yàn)（clinical laboratory technology or science）,又稱實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，就是通過實(shí)驗(yàn)室的各種檢查方法，包括感官檢查、理學(xué)檢查、化學(xué)檢查、顯微鏡檢查以及自動(dòng)化儀器檢查等，對病人的血液、體液、分泌物和排泄物等標(biāo)本進(jìn)行檢查、分析，以獲得病原、病理變化及臟器功能狀態(tài)等資料。,二、臨床檢驗(yàn)在醫(yī)學(xué)中的作用,1、為準(zhǔn)確診斷、及時(shí)治療提供依據(jù),臨床檢驗(yàn)的結(jié)果是支持診斷、鑒別診斷、甚至確定診斷的 主要依據(jù)。,例：anemia,依據(jù)：血中紅細(xì)胞和血紅蛋白量減少,leukemia,依據(jù)：血象和骨髓象,腎臟有實(shí)質(zhì)性損傷的依據(jù),尿液中出現(xiàn)蛋白、細(xì)胞 管型,問：tumor？,2、為分析病情、觀察療效、判斷預(yù)后提供依據(jù),在疾病過程中，血液、體液、分泌物和排泄物也 會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化,3、為預(yù)防疾病提供資料,如血象和腫瘤細(xì)胞學(xué)的普查等,三、臨床檢驗(yàn)的一般方法,1、目視檢查,直接觀察標(biāo)本：顏色、透明度、性狀，有無 凝塊或寄生蟲,2、理學(xué)檢查,液體的相對密度、血液比粘度、紅細(xì)胞沉降 率、紅細(xì)胞比積等病理變化,3、化學(xué)檢查,定性和定量檢測標(biāo)本化學(xué)成分的病理變化,4、顯微鏡檢查,觀察有型成分的數(shù)量和形態(tài),5、自動(dòng)化儀器檢查,電子技術(shù)、程序控制的發(fā)展,四、學(xué)習(xí)臨床檢驗(yàn)的目的和要求,1、理論聯(lián)系實(shí)踐,2、操作要求,3、檢驗(yàn)結(jié)果必須和臨床表現(xiàn)結(jié)合,4、檢驗(yàn)人員的醫(yī)德,第一章 一般性操作技術(shù),血液學(xué)檢查 ： 反應(yīng)造血系統(tǒng)本身、機(jī)體全身或局部病變,有助于疾病的診斷及療效、預(yù)后的觀察,只能反應(yīng)疾病某一方面的情況，不能認(rèn)為是病程的全部反應(yīng)；不同個(gè)體，對同一影響有不同的反應(yīng)，或也可對不同影響產(chǎn)生 相同的反應(yīng),一、血液標(biāo)本的采集,1、毛細(xì)血管采血法,部位：中指或無名指尖內(nèi)側(cè)，半歲以下拇指或 足部，特殊人員視情況而定。,b. 所用器材：采血針、吸管,c. 采血步驟及注意事項(xiàng),2、靜脈采血法,部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背部手腕部等 幼兒可采用頸外靜脈采血。,采血器材：一次性注射器，檢驗(yàn)用真空定量采血裝 置,c. 采血步驟及注意事項(xiàng),兩種采血方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較,毛細(xì)血管,靜脈血,缺點(diǎn),限制了重復(fù)實(shí)驗(yàn)和追 加實(shí)驗(yàn)，標(biāo)本量少， 局部炎癥可得假結(jié)果 ，組織液可混入,不同抗凝劑的使用， 改變血液性質(zhì)，影響 有形成分的形態(tài),優(yōu)點(diǎn),價(jià)廉、快速、操作簡 便，標(biāo)本可直接測定,標(biāo)本代表性大，無組 織液影響，適于臨床 研究，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)和 追加其他實(shí)驗(yàn),二、常用血液標(biāo)本抗凝劑 及其使用選擇,1、檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉）,a. 抗凝原理：螯合鈣離子,使用方法 配成109 mmol/L的濃度和血液1：9 106 mmol/L的濃度和血液1：4,化學(xué)名：3-羥基-3-羧基戊二酸（三鈉鹽）,c. 適用范圍：止血學(xué)檢驗(yàn)、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性?。?2. 草酸鈉（乙二酸的鈉鹽）,a. 抗凝原理：草酸鈣沉淀,b. 使用方法 草酸鈉0.1mol/L 和血液1：9,c. 適用范圍： 止血學(xué)檢驗(yàn),3. 雙草酸鹽抗凝劑,a. 抗凝原理： 草酸鈣沉淀,使用方法： 草酸鉀0.8g , 草酸銨1.2g（100ml） 與血液 1：10 （80C以下烘干）,適用范圍： 紅細(xì)胞檢驗(yàn)（紅細(xì)胞比積、計(jì)數(shù)） 不適于血小板計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù),4. 肝素 （含硫酸基團(tuán)的粘多糖）,抗凝原理：低濃度時(shí)抑制因子a、和PF3之 間的作用，加強(qiáng)抗凝血酶滅活絲 氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成， 還能抑制凝血酶的自我催化及抑制 因子的作用；高濃度時(shí)阻斷凝血 酶和纖維蛋白的反應(yīng)。,b. 適用方法： 1g/L濃度的肝素鈉與血液 1：10,優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易 溶血、能耐高溫。,適用范圍： 紅細(xì)胞檢驗(yàn)（紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白 測定、紅細(xì)胞比積）和多種生化分析,5. 乙二胺四乙酸（EDTA）鹽,a. 抗凝原理： 螯合鈣離子,b. 使用方法： 15g/L濃度EDTA 和血液 1：10,適用范圍： 對血細(xì)胞形態(tài)影響小-血小板計(jì)數(shù)； 影響血小板聚集和白細(xì)胞吞噬功能 -不易做止血學(xué)檢驗(yàn)及血小板功能 檢驗(yàn)。,物理方法抗凝： 脫纖維蛋白： 將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)，纖維 蛋白纏繞凝固于玻璃球，從而防止血成凝塊。適 用于免疫學(xué)檢驗(yàn)和紅斑性狼瘡細(xì)胞檢查。,三、血涂片的制備技術(shù),血涂片的用途： 血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、網(wǎng)織紅、異常 寄生蟲檢驗(yàn)。,2. 血涂片制備步驟：（手工推片法）,將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。,3. 血涂片質(zhì)量評價(jià)： 均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè),注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚,四、 細(xì)胞染色技術(shù),染料-生物學(xué)染色劑：將生物組織細(xì)胞和病原體染色，在顯微鏡 下觀察結(jié)構(gòu)。,（一）、染料 （天然染料和人工染料） 發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染 組織親合。,堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細(xì)胞核 的染料。如亞甲藍(lán)、天青。,酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒 烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合 細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、 嗜酸性顆粒成分等。,3. 復(fù)合染料：同時(shí)具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料,（二）、細(xì)胞染色原理： 一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué) 現(xiàn)象為依據(jù),1. 物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等,化學(xué)作用： a. 染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料 在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的 酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與 帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。,b. 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同 數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其 他活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)， -NH2獲得一個(gè)H+變成帶 正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。 分別與不同染料結(jié)合。,c. 周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pHpI（ pI 為等電 點(diǎn)），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之， pH pI，則結(jié)合堿性染料。,（三）、細(xì)胞染色法的類型 1. 普通染色法： 經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合 2. 熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡 3. 細(xì)胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍(lán)等 4. 細(xì)胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分。 細(xì)胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)）,五、 瑞氏染色法,（一）、染色原理 分兩相進(jìn)行，第一相是酸性伊紅與細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如血紅蛋白、嗜酸性顆粒結(jié)合；堿性染料天青 B與細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如核染色質(zhì)、特異中性顆粒、 血小板結(jié)合。第二相是天青B和伊紅結(jié)合在適宜條件下 形成紫色的天青B-伊紅復(fù)合物，結(jié)果使白細(xì)胞核染色質(zhì)成紫色（瘧原蟲的染色質(zhì)成紅色），中性粒細(xì)胞的顆粒及血小板顆粒區(qū)成紫色。,（二）、試劑 1. Wright染液 瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml 甲醇：有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定 形態(tài)，并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增 加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用， 增強(qiáng)染色效果。,磷酸鹽緩沖液（PBS）：磷酸二氫鉀（無水）0.3 g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g, 蒸餾水加到1000ml。 配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。,染色方法： a. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。 b. 加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。 c. 滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10 分鐘。 d. 用清水沖洗，待干后鏡檢。,注意事項(xiàng)： a. 血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落 b. 染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)， 一般染液淡、染色時(shí)間長些效果好。 c. 染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。 d. 沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防染料 沉著。沖洗時(shí)間也不能長。 e. 染色過淡，可復(fù)染。 f. 染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色,六、 姬姆薩染色