免疫學(xué)檢驗(yàn)5凝集反應(yīng).ppt

如何鑒定ABO血型？,ABO血型的確認(rèn)原則是什么？ 如何鑒定RBC上的血型抗原或血清中的血型抗體類(lèi)型 ？ 采用凝集反應(yīng)。,第五章 凝集反應(yīng) （agglutination）,一、定義 顆粒性抗原（或可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后）與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集塊。,第一節(jié) 凝集反應(yīng)概述,二、發(fā)生機(jī)制 分兩階段進(jìn)行。 特異性結(jié)合階段 抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合。 速度快，不可見(jiàn)。 可見(jiàn)反應(yīng)階段出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)特異性凝集。 抗原抗體復(fù)合物進(jìn)一步交聯(lián)聚集所致。 受到多種因素的影響。,二、發(fā)生機(jī)制 分兩階段進(jìn)行。 特異性結(jié)合階段 抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合。 速度快，不可見(jiàn)。 可見(jiàn)反應(yīng)階段出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)特異性凝集。 抗原抗體復(fù)合物進(jìn)一步交聯(lián)聚集所致。 受到多種因素的影響。,抗原顆粒,抗體,NaCl,可見(jiàn)反應(yīng),抗原抗體復(fù)合物,圖注：,特異性結(jié)合,抗原抗體相對(duì)應(yīng),抗原顆粒,抗體,NaCl,可見(jiàn)反應(yīng),抗原抗體復(fù)合物,圖注：,特異性結(jié)合,抗原抗體相對(duì)應(yīng),三、影響因素 抗原因素： 顆粒性抗原 抗原表位數(shù)目等 抗體因素： 來(lái)源（多克隆抗體）、親和力、效價(jià)（含量）等。 IgM的凝集作用IgG。 不完全抗體：與相應(yīng)抗原結(jié)合，但不形成可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。主要為小分子的IgG類(lèi)抗體。,IgM抗體凝集細(xì)胞示意圖,IgG抗體凝集細(xì)胞示意圖,IgM,細(xì)胞,IgG,細(xì)胞,不完全抗體與相應(yīng)顆?？乖Y(jié)合,RBC,7S的IgG,不凝集,+,三、影響因素,環(huán)境因素： 電解質(zhì)（生理鹽水） 酸堿度：避免酸凝集。 溫度：37。 抗原與抗體的適當(dāng)比例 易出現(xiàn)抗體過(guò)量前帶抑制。,四、凝集反應(yīng)的應(yīng)用 抗原（ Ag）或抗體（ Ab ）的定性檢測(cè) 未知Ag（或Ab）已知Ab（或Ag）是否出現(xiàn)凝集 若出現(xiàn)凝集，則表明有相應(yīng)Ag（或Ab）存在； 若不出現(xiàn)凝集，則表明無(wú)相應(yīng)Ag（或Ab）存在。 抗體的半定量檢測(cè) 將待檢標(biāo)本（未知Ab）作一系列倍比稀釋后加入定量抗原（已知Ag）進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)凝集反應(yīng)的最高稀釋度作為Ab的效價(jià)或滴度。,應(yīng)用凝集反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，在判定結(jié)果時(shí)需考慮： 影響因素存在時(shí)會(huì)干擾凝集的出現(xiàn)：若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，但因受多種因素影響而不出現(xiàn)特異性凝集可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。 非特異性凝集可干擾結(jié)果的判斷：若抗原與抗體并不對(duì)應(yīng)，但存在非特異性凝集可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。,應(yīng)用凝集反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，在判定結(jié)果時(shí)需考慮： 影響因素存在時(shí)會(huì)干擾凝集的出現(xiàn)：若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，但因受多種因素影響而不出現(xiàn)特異性凝集可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。 非特異性凝集可干擾結(jié)果的判斷：若抗原與抗體并不對(duì)應(yīng)，但存在非特異性凝集可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。,凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)的不同點(diǎn),五、凝集反應(yīng)的類(lèi)型,直接凝集反應(yīng)。 間接凝集反應(yīng)。 其他凝集技術(shù)。,第二節(jié) 直接凝集反應(yīng) （direct agglutination test） 定義： 顆粒性抗原 + 相應(yīng)抗體 肉眼可見(jiàn)凝集塊 （細(xì)菌，RBC等） 參與反應(yīng)的抗原稱(chēng)為：凝集原（agglutinogen） ； 抗體稱(chēng)為：凝集素（agglutinin） 。,NS,NS,第二節(jié) 直接凝集反應(yīng) （direct agglutination test）,常用方法： 玻片法 試管法 微量血凝反應(yīng)板法,一、玻片凝集試驗(yàn) （slideagglutination test）,定性試驗(yàn)，常用已知Ab測(cè)定未知Ag(待檢樣本)。 結(jié)果判讀： 已知Ab 未知Ag 凝集，陽(yáng)性(+)。 不凝集，陰性(-)。 方法評(píng)價(jià)：特異性強(qiáng)， 簡(jiǎn)便、快速；敏感度稍低。 應(yīng)用： ABO血型鑒定； 細(xì)菌的鑒別與分型。,抗 A,抗 B,1. 已知標(biāo)準(zhǔn)血清（已知抗體）,2.受檢者5%RBC懸液 （未知抗原）,3.結(jié)果判斷：,不凝集,4.根據(jù)有無(wú)凝集現(xiàn)象來(lái)判斷血型,凝集,ABO血型的鑒定,ABO血型鑒定結(jié)果示意圖,抗A標(biāo)準(zhǔn)血清,抗B標(biāo)準(zhǔn)血清,抗A標(biāo)準(zhǔn)血清,抗B標(biāo)準(zhǔn)血清,抗A標(biāo)準(zhǔn)血清,抗B標(biāo)準(zhǔn)血清,抗A標(biāo)準(zhǔn)血清,抗B標(biāo)準(zhǔn)血清,血型判斷：B型,血型判斷：O型,血型判斷：AB型,血型判斷：A型,某檢驗(yàn)人員在實(shí)際工作中，出現(xiàn)了ABO血型的定型錯(cuò)誤。請(qǐng)你分析造成此錯(cuò)誤的可能原因有哪些？ 技術(shù)問(wèn)題： 責(zé)任心不強(qiáng)，未按要求操作； ABO標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)量不高：效價(jià)太低、親和力不強(qiáng)，誤判為陰性反應(yīng)； 紅細(xì)胞濃度過(guò)淡或過(guò)濃：導(dǎo)致抗原抗體比例不適當(dāng)，誤判為陰性反應(yīng)； 各種原因引起的紅細(xì)胞溶解（溶血），誤判為陰性反應(yīng)； 操作器材不潔，紅細(xì)胞被細(xì)菌污染，紅細(xì)胞自凝（冷凝集）、假凝集及細(xì)菌性凝集等干擾了結(jié)果的判斷，可出現(xiàn)假陽(yáng)性。 如何避免？ 愛(ài)崗敬業(yè)，規(guī)范操作，試劑避免細(xì)菌污染。 所用器材必須干燥清潔、防止溶血。 設(shè)置對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、自身對(duì)照等。,某檢驗(yàn)人員在實(shí)際工作中，出現(xiàn)了ABO血型的定型錯(cuò)誤。請(qǐng)你分析造成此錯(cuò)誤的可能原因有哪些？ 被檢RBC問(wèn)題： 受檢者紅細(xì)胞上抗原位點(diǎn)過(guò)少，如亞型；或白血病、惡性腫瘤等導(dǎo)致抗原減弱，弱凝集，誤判為陰性反應(yīng)。 由于細(xì)菌感染使紅細(xì)胞出現(xiàn)獲得性類(lèi)B抗原，易誤判為陽(yáng)性。 如何避免？ 用已知血型的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢查待檢血清中未知的抗體。 通常采用試管法。,細(xì)菌的鑒別,用已知細(xì)菌診斷血清檢測(cè)待檢細(xì)菌 方法： 輕搖玻片，12分鐘后觀察 結(jié)果判定：右側(cè)為陰性對(duì)照，不凝集時(shí)結(jié)果有效 若左側(cè)出現(xiàn)凝集塊為陽(yáng)性，反之為陰性 根據(jù)左側(cè)是否出現(xiàn)凝集來(lái)判斷待檢菌的種類(lèi),NS待檢菌診斷血清,NS待檢菌,二、試管凝集試驗(yàn) (tube agglutination test),試管法：半定量試驗(yàn)。 常用已知Ag，測(cè)定未知 Ab(待檢血清)。 方法評(píng)價(jià)： 特異性易受影響； 敏感性不高。 應(yīng)用： 多用以測(cè)定抗體的含量（效價(jià)、滴度）。 肥達(dá)氏反應(yīng)、外斐氏反應(yīng)、交叉配血試驗(yàn)。,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,棄掉0.5,試管凝集試驗(yàn)原理,結(jié)果,1 2 3 4 5 6 7,菌液,結(jié)果觀察：觀察管底是否有凝集現(xiàn)象。 完全凝集（）：凝集塊完全沉于管底，液體澄清。 75%凝集（）：凝集塊沉于管底，液體稍混。 50%凝集（）：凝集塊沉于管底，液體混濁。 以上結(jié)果均為陽(yáng)性，均出現(xiàn)肉眼明顯可見(jiàn)的凝集。 25%凝集（弱陽(yáng)性）：液體混濁。 陰性：無(wú)變化。 結(jié)果判讀： 以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象（“”）的最高稀釋度作為Ab的效價(jià)（含量）。,第三節(jié) 間接凝集反應(yīng) (indirect agglutination test),一、載體種類(lèi) 二、間接凝集反應(yīng)類(lèi)型 三、間接血凝試驗(yàn) 四、膠乳凝集試驗(yàn) 五、間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用,間接凝集試驗(yàn)：用人工方法將可溶性抗原(或 抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏 載體顆粒，再與相應(yīng)抗體（或抗原）作用， 在適宜電解質(zhì)的參與下，出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。,優(yōu)點(diǎn)：敏感度比直接凝集反應(yīng)高 28倍，亦明顯高于沉淀反應(yīng)。,間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination test） 可溶性抗原+載體顆粒致敏顆粒+相應(yīng)抗體凝集塊 （RBC、膠乳顆粒等）,載體,可溶性抗原,致敏,NS,致敏顆粒,凝集,載體(carrier):試驗(yàn)體系中與免疫無(wú)關(guān)的顆粒。,對(duì)載體的要求： 不溶于水，在NS中性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)化學(xué)、血清學(xué)活性。 大小均一，短時(shí)間內(nèi)不致下沉。 能夠直接吸附或偶聯(lián)抗原或抗體，且不影響其活性。,致敏：抗原(或抗體)偶聯(lián)于顆粒表面的過(guò)程。,致敏顆粒（sensitized particle):吸附有已知抗 原或抗體的顆粒。,載體,可溶性抗原,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,間接凝集試驗(yàn)示意圖,間接凝集試驗(yàn)示意圖,一、常用載體種類(lèi),紅細(xì)胞： 新鮮紅細(xì)胞吸附蛋白質(zhì)的能力差。一般先醛化后應(yīng)用。 聚苯乙烯膠乳顆粒： 可物理吸附蛋白質(zhì)；常制備帶有化學(xué)活性基團(tuán)的顆粒。 活性炭： SPA：,二、間接凝集反應(yīng)類(lèi)型,根據(jù)致敏用的試劑和反應(yīng)方式分為：,2.反向間接凝集試驗(yàn)（reverse indirect agglutination test）,3.間接凝集抑制試驗(yàn)（indirect agglutination inhibition test）,1.(正向)間接凝集試驗(yàn)（indirect agglutination test）,4.協(xié)同凝集試驗(yàn) （coagglutination test）,載體,可溶性抗原,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,1.（正向）間接凝集試驗(yàn),用特異性抗原致敏載體，檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體的方法。,待測(cè)抗體,結(jié)果判讀：凝集，陽(yáng)性(+)。 不凝集，陰性(-)。,2. 反向間接凝集試驗(yàn),用特異性抗體致敏載體，檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原的方法。,載體,已知抗體,致敏,致敏顆粒,NS,凝集顆粒,待測(cè)抗原,結(jié)果判讀： 凝集，陽(yáng)性(+)。 不凝集，陰性(-)。,3.間接凝集抑制試驗(yàn),待測(cè)抗原,已知抗體,特異結(jié)合,抗原抗體復(fù)合物,NS,致敏顆粒,用抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏載體相同的抗原。,無(wú)凝集顆粒為陽(yáng)性,間接凝集抑制試驗(yàn),待測(cè)抗原,已知抗體,無(wú)結(jié)合,抗原抗體分散,NS,致敏顆粒,有凝集顆粒為陰性,原理,4.協(xié)同凝集試驗(yàn),SPA能與血清中的IgG類(lèi)抗體的Fc段非特異性結(jié)合，而兩個(gè)Fab段暴露在葡萄球菌菌體表面，仍然保持正常的抗體活性，與特異性抗原相遇時(shí)，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。,應(yīng)用,微生物的快速診斷、定種及定型；以協(xié)助傳染病的早期診斷。,原理圖,IgG,SPA,SPA- IgG,待測(cè)抗原,SPA- IgG-待測(cè)抗原凝集顆粒,混合,加入,原理,三、間接血凝試驗(yàn)(被動(dòng)血凝試驗(yàn)),將可溶性抗原(或抗體）吸附人的“O”型血紅細(xì)胞或綿羊或家兔的紅細(xì)胞，制成致敏血紅細(xì)胞,與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)參與下，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。,RBC為載體： 動(dòng)物，或人的“0”型血RBC 醛化紅細(xì)胞： 用戊二醛處理，成團(tuán)，不易搖散；吸附大，耐溫，耐凍融。 致敏紅細(xì)胞保存時(shí)間短，易變脆、溶血、被污染，因此在致敏前醛化。 致敏醛化紅細(xì)胞：用Ag/Ab直接或化學(xué)聯(lián)結(jié)，與RBC作用，吸附于RBC的過(guò)程。,（indirect hemagglutination test),紅細(xì)胞,抗原,致敏,致敏紅細(xì)胞,NS,紅細(xì)胞凝集,間接血凝試驗(yàn),間接血凝試驗(yàn)原理,待測(cè)抗體,結(jié)果示意圖,-,+,+,+,+,+,結(jié)果判斷: 效價(jià)？,方法評(píng)價(jià)： 敏感性較強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速、成本低廉,原理,四、膠乳凝集試驗(yàn),將可溶性抗原(或抗體）與膠乳結(jié)合后，直接與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生凝集反應(yīng)。,方法評(píng)價(jià)： 1.膠乳顆粒的性能比 RBC穩(wěn)定、均一性好 2.與抗原結(jié)合的能力 及凝集性能不如RBC,（indirect hemagglutination test),應(yīng)用: 類(lèi)風(fēng)濕因子檢測(cè)等,1. 抗體的檢測(cè) 檢測(cè)細(xì)菌、病毒寄生蟲(chóng)感染后產(chǎn)生的抗體 自身免疫病患者的抗體的檢測(cè) 變態(tài)反應(yīng)患者的抗體的檢測(cè) 2. 抗原的檢測(cè),五、間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用,檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）、HCG等抗原,第四節(jié) 其它凝集技術(shù),一、抗球蛋白試驗(yàn) (antiglobulin test) 二、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) (autologous red cell agglutination test) 三、冷凝集試驗(yàn) (cold agglutination test),原理,一、抗球蛋白試驗(yàn)(Coombs試驗(yàn)),機(jī)體受某些抗原刺激后產(chǎn)生“不完全抗體”，其與相應(yīng)抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，但能封閉抗原決定簇，使其不能再與完全抗體結(jié)合。,類(lèi)型,(antiglobulin test),1.直接法 2.間接法,方法：將人球蛋白，注入異種動(dòng)物，獲得抗球蛋白。此種抗體加入表面結(jié)合有不完全抗體的紅細(xì)胞的復(fù)合物中，就能出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。,是檢測(cè)抗紅細(xì)胞不完全抗體的一種非常經(jīng)典的方法。 RBC不完全抗體(IgG) RBC不凝集。 RBC不完全抗體(一抗) 抗球蛋白抗體(二抗) RBC凝集。 常用方法： 直接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)RBC上的不完全抗體。 間接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)游離在血清中的不完全抗體。,直接法,作用：檢測(cè)紅細(xì)胞表面結(jié)合的不完全抗體。 臨床意義：新生兒溶血癥和自身免疫性溶血性貧血的診斷。,RBC為Rh+,7S的IgG,體內(nèi)發(fā)生,+,抗IgG,體外測(cè)試,抽血,間接法,作用：檢測(cè)游離在血清中的不完全抗體。 臨床意義：輸血前的交叉配血、不相溶輸血后的抗體檢測(cè)。檢測(cè)母體 Rh（D）抗體有助于及早發(fā)現(xiàn)及避免新生兒溶血癥。,RBC為Rh+,不完全抗 體試劑,+,抗IgG,體外測(cè)試,二、自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),原理類(lèi)似于間接血凝試驗(yàn)。 區(qū)別點(diǎn)：RBC為受檢者新鮮RBC。 所用抗體為雙功能抗體(即能結(jié)合紅細(xì)胞，也能結(jié)合待檢抗原)。 反應(yīng)特點(diǎn)： 1.受檢標(biāo)本為全血，不需分離血清。 2.采手指血或耳垂血，立刻檢測(cè)出結(jié)果。 3.已成功應(yīng)用于抗HIV抗體的檢測(cè)。,概念,三、冷凝集試驗(yàn),冷凝集素是紅細(xì)胞某些抗原的自身抗體，只能在低溫時(shí)與其相應(yīng)的抗原結(jié)合。,(cold agglutination test),冷凝集反應(yīng)在 4時(shí)最強(qiáng)烈，紅細(xì)胞凝集最明顯；溫度升高后，抗原抗體復(fù)合物解離，凝塊消失。,意義,原理,冷凝集素增高常見(jiàn)于：?jiǎn)魏思?xì)胞增多癥和支原體肺炎。惡性淋巴瘤呈現(xiàn)慢性增高。,冷凝集試驗(yàn)原理,抗原決定簇隱含，不能與抗體結(jié)合,混 合,暴露的抗原決定簇與抗體結(jié)合,混 合,37,4,37,練習(xí)題: 1.下列那種抗原不是顆粒性抗原（ ） A.金黃色葡萄球菌； B.傷寒桿菌； C.紅細(xì)胞； D.抗原包被的乳膠微粒； E.細(xì)菌外毒素,2.肥達(dá)氏反應(yīng)的原理是（ ） A.直接凝集； B.間接凝集； C.間接凝集抑制試驗(yàn)； D.沉淀反應(yīng)； E.補(bǔ)體結(jié)合,3.交叉配血試驗(yàn)屬于（ ） A.直接