（植物學(xué)專業(yè)論文）桃（prunus+persica）兩種mads+box基因的克隆及其功能分析.pdf

首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 縮寫 ct ab edt a b y bs a dna dn a s e d nt t c e ty l t r ie t h y l . a m m o n iu m b ro m id e 十 六 烷基 三己 基 澳 化 錢 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i c a c i d 乙 二胺四乙酸 b a s e p a i r s 堿基對(duì) b o v i n e s e r u m a l b u m e n 牛血清白 蛋白 d e o x y r ib o n u c le ic a c id 脫 氧 核 糖 核酸 d e o x y r ib o n u c le a s e 脫 氧 核糖 核 酸 酶 d e o x y n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t e s (u s u a l l y a m i x o f d a t p /d t t p / d c t p / d g t p) 脫 氧 核 昔 三 磷 酸 ( 通 常 為 d a t p /d t t p / d c t p / d g t ? 的 混 合 物 ) l u r i a - b e rt a n i m e d i a l u r i a - b e r t a n i 培養(yǎng)基 c 6 h 1 3 0 n 4 s 2 - ( n - 嗎 啡 琳 ) 乙 磺酸 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c tio n 聚 合 酶 鏈 式反 應(yīng) r i b o n u c l e i c a c i d 核糖核酸 r i b o n u c l e a s e a 核糖核酸 酶a d i s t i ll e d w a t e r 蒸餾水 雙蒸水 k a n a m y c in 卡 那 霉 素 y e a s t e x tr a c t- p h o s p h a te m e d ia y e a s t e x t r a c t -p h o s p h a te 培 養(yǎng) 基 c e f o t a x i m e s o d iu m 頭抱霉素 r i f a m p i c i n 利 福平 m u r a s h i g e a n d s k o o g m e d i a m u r a s h i g e a n d s k o o g 培養(yǎng)基 a - n a p h th a l e n e a c e t ic a c id a 一 蔡乙 酸 6 - b e n z y l a m in o p u r in e 6 - 節(jié) 氨 基 嗦吟 o p ti c a l d e n s ity 光 密 度 tr i s edta e t h i d i u m b r o m i d e 澳化乙錠 ea)q lbmespcrrnarnasldhzoddhzl枷yei，cef畝msnaa6-baonteeb 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 b 5維生素 ( 2 , 3 - d i b r o m o p r o p y l ) p h o s p h a t e 三輕甲基氨基甲烷 聚乙烯毗咯烷酮 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e 十二烷基 磺酸鈉 vbstris階sds 首 都 師 范大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 摘要 了解植物由 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向 生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)過(guò)程， 對(duì)于 控制有花植物的生 長(zhǎng)發(fā)育是很有意義的。 至今已 經(jīng)鑒定了 許多參與控制果實(shí)和花發(fā)育的m a d s b o x 基因。 m a d s b o x 基因多 數(shù)是由m, 1 , k 和 c 四個(gè)區(qū)域構(gòu)成的， 很少一些m a d s b o x 基 因 在m區(qū)上游還具有一段富含堿性氨基酸的n 末端區(qū)域。 其中fu r 區(qū)高 度保守， 言 編 碼真核生物轉(zhuǎn)錄因子的d n a結(jié)合域， 具有d n a結(jié)合和二聚體形成的 作用。 臣 典的“ a b c ” 模型中 所涉及的m a d s b o x 基因 有a , b , c 三類功能， 隨后“ a b c 莫 型不斷得到充實(shí)和完善, d類和e 類功能 基因的出 現(xiàn)壯大了m a d s b o x 基因家 矣 ， a b c d ”模型、 a b c d e ” 模型和 “ 四聚體” 模型相繼涌現(xiàn)， 使人們對(duì)花 t 育的 機(jī)理 有了更深入的了 解。 近來(lái)的研究表明 m a d s b o x 基因 家族并不只在花器官的發(fā) 育中起調(diào)控作用， la d s b o x基因在控制開(kāi)花時(shí)間、決定分裂組織的分化、 控制胚胎發(fā)育、根的形 免 以 及種子和果實(shí)的發(fā)育等方面 都起著重要的作用。 此外研究發(fā)現(xiàn)，同一 m a i d s o x 基因 在發(fā)育的不同時(shí)期可以 起不同的 功能。 m a d s b o x基因?qū)ι成L(zhǎng)的調(diào)控是近年來(lái) m a d s b o x基因作用研究的重 k 。 為了研究李屬 ( p r u n u s s p . ) 果樹(shù)生殖調(diào)控的 相關(guān)基因， 對(duì)國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù) ， 的 李 屬 植 物的e s t (e x p r e s s e d s e q u e n ce ta g s ) 序 列 進(jìn) 行了 電 子 拼 接， 獲 得了8 個(gè) i d s b o x基因 的 c d n a 序列， 并利用 p c r技術(shù)從桃的果實(shí)中克隆出 其中的 4個(gè) ) n a ， 分別命名為p p s 2 . p p w s 4 . p p y a d s 6 和p p m a d s 7 , 其中p p a a d s 4 和 * a d s 6 在g e n b a n k 中 的 登 陸 號(hào) 分 別 為a y 7 0 5 9 7 2 和a y 7 0 5 9 7 3 . p p m a d s 4 基 因 長(zhǎng) io b p ， 包 含一 個(gè) 7 3 2 6 p 的 開(kāi) 放 閱 讀 框 ， 編 碼 2 4 3 個(gè)氨 基酸 。 乃 )m a d s 6 基 因 長(zhǎng) 9 0 6 p ，包含1 個(gè)7 6 8 6 p 的 開(kāi)放閱 讀框，編碼2 5 6 個(gè)氨基酸. p p y a d s 4 和p p s 6 在序列上分別與擬南芥中的a g a m o u s 基因 和矮 牽牛中的 7g 基因 高度同 源。 r t - p c r 分析表明， p p y a d s 4 基因在花瓣、 心皮、 果實(shí)及核仁 表達(dá)，應(yīng)屬于己 知的花器發(fā)育的調(diào)控的 c 類 m a r s b o x 基因。 p p n a d s 6 基因在 片、花瓣、心皮、果實(shí)及果仁中表達(dá)，應(yīng)屬于調(diào)控植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng) 首都師范大學(xué)碩士學(xué)位論文 過(guò)渡的a 類m a d s b o x 基因。 為了進(jìn)一步確定基因的 功能， 對(duì)p p m a d s 4 基因進(jìn)行了 擬南芥轉(zhuǎn)基因分析。 通 過(guò)限制性內(nèi)切酶切割和連接反應(yīng)， 構(gòu)建該基因的正 義表達(dá)載體，并置于 c a mv 3 5 s 啟動(dòng)子的驅(qū) 動(dòng)之下。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 浸潰法轉(zhuǎn)化擬南芥。 將通過(guò)抗生素篩 選的陽(yáng)性植株， 使用c t a b法提取成株基因組d n a ，進(jìn)行p c r檢測(cè)。 通過(guò)對(duì)于轉(zhuǎn)基因擬南芥的 表型觀察， 發(fā)現(xiàn)株型與 花型均發(fā)生了 改變， 這些特 征， 與a g a m o u s m因在擬南芥中的異 位表達(dá)結(jié)果相似。 這些結(jié)果表明p p m a d s 4 基 因 應(yīng)與c 類基因具有相似的功能。 關(guān)鍵詞:m a d s b o x基因，桃，花發(fā)育，擬南芥 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 ab s t r a c t u n d e r s t a n d i n g t h e p r o c e s s e s r e g u l a t i n g t h e p h a s e t r a n s i t i o n fr o m v e g e t a t i v e t o r e p r o d u c t i v e g r o w t h i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t f o r w o o d y f r u i t c r o p s . i t i s v e ry l i k e l y t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e g e n e s s i g n a l l i n g t h e e n d o f t h e v e g e t a t i v e p h a s e a n d t h e b e g i n n i n g o f t h e re p r o d u c t i v e p h a s e a r e m e m b e r s o f t h e m a d s b o x g e n e f a m i l y . m a r s b o x g e n e s f a m i l y p l a y s a k e y r o l e i n t h e m o l e c u l a r re g u l a t i o n o f fl o r a l d e v e l o p m e n t , a n d m o s t o f t h e m i n p l a n t s b e l o n g t o t h e t y p e ii c l a s s , 山 a t i s , t h e g e n e s e q u e n c e i s c o m p o s e d o f m , i , k a n d c d o m a in s . t h e m d o m a i n , w h i c h e n c o d e s t h e d n a - b i n d i n g s e q u e n c e a n d p l a y s t h e r o l e s o f b o t h b i n d i n g d n a a n d f o r m i n g d i m m e r s , i s t h e m o s t c o n s e r v e d r e g i o n . a c c o r d i n g t o t h e c l a s s i c a l a b c” m o d e l , t h r e e c l a s s e s o f g e n e s a c t t o s p e c i f y fl o r a l o r g a n s , n a m e l y s e p a l s ( a o n l y ) ， p e t a l s ( a + b ) ， s t a m e n s ( b + c ) ， o r c a r p e l s ( c o n l y ) ， l a t e r , s o m e n e w f o u n d m a d s b o x g e n e s r e s u l t i n t h e a b c d m o d e l , a b c d e m o d e l a n d q u a r t e t m o d e l . a ll o f t h e s e m o d e l s m a k e t h e u n d e r s t a n d i n g o f fl o r a l d e v e l o p m e n t d e e p l y . r e c e n t s t u d i e s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e f u n c t i o n s o f m a d s b o x g e n e f a mi l y m e m b e r s a r e n o t r e s t r i c t e d t o fl o w e r o r g a n d e v e l o p m e n t . m a d s b o x g e n e s w e r e s h o w n t o b e i n v o l v e d i n i n i t i a t i o n o f fl o w e r i n g , d e t e r mi n a t i o n o f m e r i s t e m i d e n t i t y ， e m b ry o n i c d e v e l o p me n t ， r o o t f o r m a t i o n， d e v e l o p me n t o f v a s c u l a r t i s s u e , a n d s e e d a n d f ru i t f o r m a t i o n . f u r t h e r m o re , a s i n g l e m a d s b o x g e n e m a y h a v e d i ff e r e n t f u n c t i o n s a t d i ff e r e n t s t a g e s o f d e v e l o p m e n t . wi t h t h e a i m o f f i n d i n g g e n e s i n v o l v e d i n t h e fl o r a l t r a n s i ti o n o f p r u n u s s p e c i e s ( p r u n u s s p . ) . t h e e s t ( e x p r e s s e d s e q u e n ce t a g s ) s e q u e n ce s w e re e x t r a c t e d f r o m t h e p u b li c d a t a b a s e s . e i g h t m a d s b o x g e n e s c d n a s w e r e o b t a i n e d . f o u r o f t h e m w e r e c l o n e d fr o m p e a c h ( p r u n u s p e r s i c a ) , n a m e d p p m a d s 2 , p p m a d s 4 , p p m a d s 6 , p p m a d s 7 . p p m a d s 4 a n d p p m a d s 6 h a v e g o t t h e a c c e s s i o n n u m b e r s i n g e n b a n k . ( t h e a c c e s s i o n n u m b e r s a r e a y 7 0 5 9 7 2 a n d a y 7 0 5 9 7 3 ) . t h e p p m a d s 4 f u l l l e n g t h c d n a i s 8 5 0如 i o n g . i t c o n t a i n s a n o p e n re a d i n g fr a m e o f 7 3 2 b p , c o d i n g f o r a p o l y p e p t i d e o f 2 4 3 a m i n o a c i d s . t h e 乃 p m a d s 6 f u l l l e n g t h c d n a i s 1 1 9 0 b y l o n g .i t c o n t a i n s a n o p e n re a d i n g fr a m e o f 7 6 8 印， c o d i n g f o r a p o l y p e p t i d e o f 2 5 6 a m i n o a c i d s . 首 都師范 *學(xué)碩 士學(xué)位 論文 即m a d s 4 c l o s e l y r e s e m b l e d t h e a r a b i d o p s f s a g a m o u s g e n e . i t i s a n a g a mo u s - l i k e c c la s s m a d s b o x g e n e a n d e x p r e s s e d i n p e t a l s , c a r p e l , f r u i t a n d n u c l e o l u s a s s h o w n勿 r t p c r a n a l y s i s . p p m a d s 6 i s l i k e l y t o比 t h e p e a c h o rt h o lo g u e o f t h e p e t u n i a p f g g e n e s a n d i t i s a n a c l a s s m a d s b o x g e n e . i t h a s b e e n s h o w n w i t h r t p c r t h a t i t e x p r e s s e d i n s e p a l , p e t a l , c a r p e l a n d f r u i t . i t m a y b e i n v o l v e d in t h e t r a n s i t i o n f ro m t h e j u v e n il e t o t h e a d u l t s t a g e . a n e x p r e s s i o n v e c t o r w a s t h e n c o n s t r u c t e d i n w h i c h p p m a d s 4 g e n e w a s u n d e r t h e c o n t r o l o f c a mv 3 5 s p r o m o t e r , a n d a r a b i d o p s i s t h a l i a n a w a s t r a n s f o r m e d b y fl o r a l d i p m e t h o d m e d i a t e d b y a g r o b a c t e r i u m t u m 響 c i e n s . t r a n s g e n e t i c a r a b id o p s is h a v e b e e n o b t a i n e d b y a n ti b i o t i c s c r e e n i n g a n d p c r s c r e e n in g . t h e fl o w e r m o t 汕o l o g y a n d 川 a n t c o n fi g u r a t i o n o f t h e t r a n s g e n i c a r a b i d o p s is w e r e v a r i e d . t h i s s h o w e d t h a t t h e p p m a d s 4 g e n e p e r h a p s t a k e p a r t i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f fl o r a l o r g a n . f rom t h e a b o v e r e s u l t s , w e p ro p o s e d t h a t 你m a d s 4 h a d t h e f u n c t i o n o f c c l a s s o f 初 刀s 石 a x 9 陽(yáng)“. k e y w o r d s : m a d s b o x g e n e s , p e a c h , fl o w e r d e v e l o p m e n t , a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 二、植物 m a r s b o x 基因 研究進(jìn)展 科學(xué)家最早在 1 9 9 0 年利用轉(zhuǎn)座子突變的方法從金魚草中 分離并克隆出同源 異 型 基因 d e f ( d ef i c i e n s x s o m m e r e t a l ., 1 9 9 0 ) . 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 該 基因 編 碼的 蛋白 質(zhì) 與兩個(gè)己 知的 轉(zhuǎn)錄因 子，哺乳 動(dòng)物的，s r f ( s e r u m r e s p o n s e f a c t o r ) ( n o r m a n e t a l . , 1 9 9 8 ) 和 酵 母 中的 m c m 1 ( m in ic h ro m o s o m e m a in t e n a n c e g e n e ; h e r s k o w itz , 1 9 8 9 ) 的一個(gè)保守區(qū) 域有很高的同 源性， 這一區(qū) 域參與二聚化和與d n a的結(jié)合， 在推 測(cè)的d n a結(jié)合區(qū)， 單個(gè)的 氨基酸突變均會(huì)導(dǎo)致蛋白 質(zhì)與d n a的結(jié)合能力下降， 并導(dǎo)致表型發(fā)生改 變，說(shuō)明d e f可能編碼一個(gè)具有調(diào)控功能的 d n a結(jié)合蛋白 ( s c h w a r z - s o m m e r e t a l . , 1 9 9 0 ) . 同年，通過(guò)該方法又從擬南芥中克隆了同源異型基因 a g ( a g a m o u s ; y a n o fs k y e t a l., 1 9 9 0 ) ， 它 編 碼 的 蛋白 質(zhì) 與 上 述 轉(zhuǎn)錄 因 子具 有高 度 的 序 列 相 似性 ， 即 均在n端含有一 個(gè)約5 7 個(gè)氨基酸的 保守區(qū)域。因 此， 人們根據(jù)這四個(gè)基因的 名 字的 第 一 個(gè)字 母 ， 將 該 保 守 區(qū) 域 命 名 為m a d s b o x 區(qū) (m a d s b o x d o m a in ) ， 并 將 具 有 該區(qū) 域的 基因 統(tǒng) 稱為m a d s b o x 基因 ( m a e t a l., 1 9 9 1 ) . m a d s b o x 基 因 編 碼多種具有重要生 物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在植物中， m a d s b o x 基因調(diào)節(jié)根、 葉、 花和果實(shí)的發(fā)育， 特別 在植物的花分生組織和花器官發(fā)育中具 有不同 形式的 時(shí)空表達(dá)模式。 、1 6 4 0 3 b o x 基因的起源、 進(jìn)化 研 究 發(fā) 現(xiàn) ，在 一 些 細(xì) 菌蛋白 中 發(fā) 現(xiàn)一 類u s p a的 蛋 白 質(zhì) ，它 含 有 一 段 短的 序 列 與m a d s 區(qū) 域 有 部 分同 源( y a n o fs k y e t a l ., 1 9 9 0 ) ;在u s p a 蛋白 的 下 游 ，也 存 在一 段 卷曲 的 螺 旋 結(jié) 構(gòu) ，這 與k - 區(qū) 域的 空 間 結(jié) 構(gòu) 極為 相 似(m a e t a l ., 1 9 9 1 ) . 由 此 推 斷 ，大 約 在2 0 -3 5 億 年前 ，u s p a蛋白 可 能 為 原 核 生 物與 真核 生 物m a d s b o x 基因 的 共同 前 體 ( k r u g e r e t a l., 1 9 9 7 ) 約1 0 億 年 前 ，真 核 生 物m a d s b o x 基 因 開(kāi) 始 分 化為3 個(gè)主 要 類群， 即 a r g 8 0或 s r f m a d s b o x基因家族、 m e f 2 m a d s b o x基因 家族以 及 m ik c m a d s b o x 基因 家 族 ( m u n s t e r e t a l., 1 9 9 7 ) . 目 前 ，前2 類 僅 在 真 菌 和 動(dòng) 物中 發(fā) 現(xiàn)， 而m i k c wd s b o x 基因 僅限于 植物中. 通過(guò)序列比 較分析 推斷， 約在4 億年前 植 物m a d s b o x 基因 開(kāi) 始 分 化 為 a t 類 和 種 子 植 物2 個(gè) 族 ( g i ff o r d a n d f o s t e r , 1 9 9 8 ) ; 而約在1 . 3 億年前， 雙子葉植物和單子葉植物發(fā)生分化. 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 2 , # a d s b o x簽因的結(jié)構(gòu)特性 在動(dòng)物和微生 物中，m a d s 區(qū)域 保守性較強(qiáng)， 而之外的 序列幾乎未發(fā)現(xiàn)保守區(qū) 域 .高 等植 物m a d s b o x 基 因由 4 個(gè) 保守 程 度不 一 的 區(qū) 域 組 成 : m a d s b o x 區(qū) 域 ( m ) 的保守性最強(qiáng); 下游為編碼6 5 - 7 0 氨基酸的k區(qū)域， 保守程 度也相當(dāng)高; m a d s b o x 和 k區(qū) 域之間的 i 一 區(qū)域，及 k區(qū) 域之后的 c 一 區(qū) 域保守 程度相對(duì)較低( m a e t a l . , 1 9 9 1 ) . 因 此，大多 數(shù) 植 物 此 類 基因 被 稱為m i k c -t y p e d m a d s b o x 基 因 ( m u n s te r e t a l . , 1 9 9 7 ) . m區(qū)即m a d s b o x 是位于基因n端的一段高度保守 區(qū)， 多數(shù)目 前己 經(jīng)分離的 花同 源異型基因的m a d s b o x 區(qū) 域約由5 7 個(gè)氨基酸組成 ( m a n d e l , 1 9 9 2 ) 。 分子 生物學(xué)研究表明 ， m區(qū) 編碼真核生物轉(zhuǎn)錄因 子的d n a結(jié)合域， 為調(diào)節(jié)蛋白 質(zhì)中 的d n a結(jié)合單元，具有d n a結(jié) 合和二聚體形成的作用。m a d s 區(qū) 域由反向平 行折疊的。 一 螺旋基元( m o t if) 所形成特定的二聚體結(jié)構(gòu)， 而與 d n a小溝 ( m i n o rg ro o v e )相互 作 用(g u n te r e t a l ., 2 0 0 0 ) .m a d s 蛋白 與 d n a 保守 序 列結(jié) 合 的 位 點(diǎn) 被 稱 為。 a r g 盒 c c ( a m6 g g ( p e ll e g r in e t a l., 1 9 9 5 ) .1一 區(qū) 域 約由3 0 個(gè) 氨基 酸 組 成 ，其長(zhǎng) 度常 常 有 所變 化 ( m a e t a l ., 1 9 9 1 ; m u n s te r e t a l., 1 9 9 乃 .研 究 表明 ， 一 些 m a d s蛋白的 i - 區(qū)域?qū)Χ垠w結(jié)構(gòu)的形成起關(guān)鍵作用( r i e c h m a n n a n d m e y e r o w i t z , 1 9 9 乃 一 i ( i n t e r v e n i n g )區(qū)較 短，含 有約 3 1 - 3 5 個(gè)氨基酸， 位于 m區(qū) 和 k區(qū)之間， 在各個(gè)花同源異型基因 之間 序列保守性較低， i 區(qū)可以 幫助二聚體的 轉(zhuǎn)錄因 子與 d n a結(jié)合形成復(fù)合體，在決定哪個(gè)m a d s 盒二 聚體可以結(jié) 合 d n a方面具有重 要作用。 k區(qū) 位于i 區(qū)之后， 是一個(gè)中 度保守區(qū) 域， 是由一段 疏水性氨基酸組成的 調(diào) 節(jié)序列， 約有7 0 個(gè)氨基酸組成， k區(qū)編碼的蛋白 質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和角蛋白 ( k e r a t i n )的 卷曲 狀結(jié)構(gòu)類似， 所以 命名為 k區(qū)， k區(qū)的結(jié) 構(gòu)顯示它能夠形成親水性的a 螺 旋。因此 k區(qū) 域能 夠作為 二聚體基元， 形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白 質(zhì)與蛋白 質(zhì)之間的相互作用， 促進(jìn)二聚化 ( m a n d e l , 1 9 9 2 ; p o ll o c k a n d t r e i s m a n , 1 9 9 1 ) . k 區(qū)是植物轉(zhuǎn)錄因子的 特征性結(jié) 構(gòu)。 c 終 端區(qū) 域 ( t h e c a rb o x y l -t e r m in a l ) 位于k區(qū) 下 游 ， 主 要由 疏 水 氨 基 酸組 成，約3 0 個(gè)氨基酸，序列保守性低， 是m a r s b o x 基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。 最近 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 的 研究表明在 c端也存在相對(duì)保守的 結(jié)構(gòu)域 ( m o t i f )的編 碼區(qū)，對(duì)其功能是必 需的 ( i a m b e t a l ， 2 0 0 3 ) 0 很少一些m a r s b o x 基因 具有一長(zhǎng)度變化富含堿性氨基酸的n終端區(qū)域， 位 于m區(qū)的上 游， 包括擬南 芥的a g和金魚草的p l e 位點(diǎn) ( s c h w a r - s o m m e r e t a l . , 1 9 9 2 ; t r o b n e r e t a l . , 1 9 9 2 ; 見(jiàn)圖6 ) 0 圖6植物x ! d s b o x 基因不同區(qū) 域 3 、 植物a g 4 d s b o x 基因的功能 m a d s b o x 基因 廣泛存在于各類植物當(dāng)中， 它編碼具有m i k c 結(jié)構(gòu)的 轉(zhuǎn)錄因 子。轉(zhuǎn)錄因子m a d s b o x蛋白以二聚體狀態(tài)執(zhí)行功能。 研究表明: 植物的m a d s b o x 基因 家族的成員在花發(fā)育過(guò)程中 調(diào)控一些關(guān)鍵 的 步驟。 如在 擬南芥中， 控制花分生組織特性的3 個(gè)基因中的 二個(gè)( a p 1 和 c a l ) 為m a d s b o x 基因 ( b o w m a n e t a l . , 1 9 9 3 ; j o f u k u e t a l . , 1 9 9 4 ) 。 在花發(fā)育的 后期， 三 類a , b , c 基因 控 制擬 南 芥 花 器官 特 性 ( c o e n a n d m e y e r o w ttz , 1 9 9 1 ) ，四 個(gè) m a d s b o x 基因a p i , a p 3 , p i 和a g為這三類基因中控制花器官特性所必須的 基因 ( t r o b n e r e t a l . , 1 9 9 2 ; i r i s h a n d s u s s e x , 1 9 9 0 ) 。 在金魚草中， m a d s b o x 基因 s q u a ( a p i 的同 源基因) , d e f , g l o和p l 為花分生組織特性基因。 一些m a d s b o x 基因的表達(dá)時(shí)間處于在早期作用的分生組織特性和晚期作用的花器官特性基 因 之間， 表明 它們?cè)诨ǚ稚M 織特性 和花器官 特性基因 之間 起調(diào)節(jié)作用。 這些基 因 包括擬南 芥中的a g l 2 , a g l 4 和a g l 9 ， 白 芥菜中的s a m a d s ， 番茄中的t m s 和矮牽牛中的f b p 2 o 4 、植物a w s b o x 基因 的分類 植物中m a d s b o x 基因 屬多基因家族 ， 按照其堿基序列、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、 表 達(dá)特性和功能可分為幾個(gè)亞 族 在不同的植物中， 同一亞族的大多數(shù)基因功能相 似.p u r u g g a n a n e t a l ( p u e t a l . , 1 9 9 5 ) 根據(jù)植物進(jìn)化過(guò)程中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系， 將不同 來(lái) 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 源 的m a d s b o x 基因 分為 a g . a p 1a g l 9 , a p 3 , p l 和。 rp h a n 5 個(gè) 群 .根 據(jù)m a d s b o x 基因作用時(shí)期， 可分為早期作用基因、晚期作用基因和中間作用類型基因. 早期作 用基因決定花序分生組織向 花分生組織轉(zhuǎn)變. 晚期作用基因決定花器官的 特性 ， 擬 南芥 中 的 晚 期 作 用 基 因 有a p i . a p 3 和 a g 等 .中 間 作 用 類 型 基因 如f im ( s im o n e t a l ., 1 9 9 4 ) ,它 們 在 決 定 分 生 組 織 特 性 和 器 官 特 征 之間 起 調(diào)節(jié) 作 用 .此 外 ，在 擬南 芥 中 還發(fā)現(xiàn)一類 u f o基因， 在早期、中 期和晚期 3個(gè)階段均起作用 w i l k i n s o n a n d h a u g h n , 1 9 9 5 ) . 5 、植物a i d s b o x 基因的 分布 m a d s b o x基因幾乎遍布整個(gè)植物界. 研究表明， 擬南芥和金魚草存在大量的 m a r s b o x 基 因 (m a a n d d e p a m p h i li s ,2 0 0 0 ; m a n d e l a n d g u s ta f s o n -b r o w n ,1 9 9 2 ; b o w m a n a n d s m i th ,1 9 9 1 ; c o n n e r a n d l iu ,2 0 0 0 ; o k a m u r o e t a l ., 1 9 9 3 ) ,番 茄 、 油 菜、 煙草 和矮牽牛等雙子葉植物以及玉 米、小麥、高粱等單子葉植物中也廣泛存在; 在植物體不同部位、不同 生長(zhǎng)發(fā) 育階段均發(fā)現(xiàn)m a d s b o x基因表達(dá); 植物花發(fā)育 過(guò) 程 中 ，有5 類m a d s b o x 基因 參 與 調(diào) 節(jié) ( g u n te r e t a l., 2 0 0 0 ) .從d n a 水 平上 來(lái) 看， m a d s b o x 基因是一個(gè)龐大家 族， 分散分 布在整個(gè) 基因組中( m e y e r o w i t z , 1 9 9 刀 . 6 、 植物a i d s b o x 基因參與植物花發(fā)育的調(diào)控 一 些 研 究 認(rèn)為 ， m a d s b o x 基 因 從5 個(gè) 階 段 體平 ) 參 與 植 物 花 發(fā) 育 過(guò) 程的 調(diào) 節(jié) ( g u n t e r e t a l ., 2 0 0 0 ; o k a d a a n d s h im u r a ,1 9 9 4 ) .(1 ) 分 生 組 織 特 性 基因 ， 主 要 調(diào) 控 植 物 頂端分生組織由營(yíng) 養(yǎng)型向 花序型或由 花序型向 花分生組織轉(zhuǎn)變， 如 c a l , a p 1 , p f g 等;(2 ) 定 域 基 因 (c a d a s tr a l g e n e s )，調(diào) 節(jié) 花分 生 組 織 基因 的 表 達(dá) ，并界 定 花 器 官 特 性基因的 作用范 圍 ， 從而 確定花 器官 各輪的 形 成， 如a g等鄧) 中間 類型 基因 ( i n t e r m e d i a t e g e n e s ) , 在花分生組織特性基因和花 器官特性基因之間起調(diào)節(jié)作用， 從 而 使 調(diào) 節(jié) 花 器官 特 性的 基因 表 達(dá) ，如a g l 2 , a g l 4 , a g l ， 等;()花 器 官 特性 基 因 ， 通過(guò) 激 活 其 下 游目 的 基 因 而 決 定 花 器 官 各 輪 的 特 性 ，如a p i .a p 3 . p i . a g , a g l i i 等;(5 )下 游 基因 ，其 作 用 結(jié) 果是 導(dǎo) 致 花 器官 各 輪的 形 成. 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 7 、 植物a i d s b o x 墓因的生 物學(xué) 功能及 其多效性 m a d s b o x基因功能多 樣， 除了決定分生組織和花器官的 特性外 ， 也參與營(yíng)養(yǎng) 生 長(zhǎng) (c a r m o n a e t a l ., 1 9 9 8 ; k a n g a n d h a n n a p e l, 1 9 9 5 ) 、 子 房 發(fā)育 (a n g e n e n t e t a l., 1 9 9 5 ; s c h n e itz ,1 9 9 9 ; g u e t a l ., 1 9 9 8 ) 、 種 皮發(fā) 育 ( b u c h n e r a n d b o u t in ,1 9 9 8 ) 、 根的 形 成 ( c a r m o n a e t a l., 1 9 9 8 ) 、 胚 形 態(tài) 建 成 (h e c k e t a l ., 1 9 9 5 ) 、 共生 誘導(dǎo) (王 光清 等， 1 9 9 7 ) 等 的 調(diào) 節(jié) .最 近 一 些 研究 證 明 ， m a r s b o x 基 因 的 表 達(dá) 也 與 抗 逆 境 有 關(guān)(k u o e t a l., 1 9 9 7 ; l o z a n o e t a l ., 1 9 9 8 ) .在 植 物 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 過(guò) 程中 ， m a d s b o x 基因 可能 在 不 同 階 段、不同部位、不同 組織 器官影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育加 以a g基因?yàn)樘结槪?已 從擬 南芥中 分離到二十幾 個(gè)a g l i ag l 6 基因， 它們分別在花發(fā)育的不同 階段、 根組織 以 及 胚 胎 等 不同 部 位 表 達(dá) ( p u e t a l ., 1 9 9 5 ; r o u n s le y e t a l., 1 9 9 5 ) ,從 而 對(duì)植 物生 長(zhǎng) 發(fā)育產(chǎn)生不同的 影響， 完成不同的生物功能( m a n d e l a n d g u s t a f s o n - b r o w n , 1 9 9 2 ; b o w m a n a n d s m i t h , 1 9 9 1 ) . 此 外 ， b o n h o m m e e t a l ( b o n h o m m e e t a l . , 1 9 9 7 ) 從 s in a p is a lb a 中 分 離 到 的 s a m a d s d 基 因 對(duì) 花 序 發(fā) 育 和 花 器官 形 態(tài)建 成 起 雙 重 影 響 ; r ic h a r d e ta l ( r ic h a r d e t a l ., 1 9 9 9 ) 分 離 到 矮 牽牛 的p f g 基因 ，它 幾乎 能 在 植 株的 所 有 部 位 ( 根 、 雄 蕊 和 幼 苗 除 外 ) 或 發(fā) 育 時(shí) 期 表 達(dá) . 同 樣 ， 在 其 它 植物 中 也 分 離到 許 多不同 作用類型的m a d s b o x 基因 p u r u g - g a n a n e t a l 從進(jìn)化的角 度認(rèn)為， 在植物發(fā) 育中m a d s b o x 基因 從不同 的側(cè) 面或 層次產(chǎn)生各種不同 作用， 這是m a d s b o x 基 因的多效性. a 、 植物m a d e b o x 基因研究存在的問(wèn) 硬與展望 目 前 ，植 物 生 殖 發(fā) 育 研 究 取 得了 巨 大 進(jìn)展 ，特別 是 有 關(guān) 高 等 植 物花 發(fā) 育 基因 調(diào) 控的研究. 先后在雙子葉 模式植物擬南芥 和金魚草中 克隆了一大批有關(guān)的植物生 長(zhǎng)發(fā)育基因， 提出了 調(diào) 控花 發(fā)育的 基因互作模式、 花發(fā) 育過(guò)程中 6類功能 基因形 成的作用網(wǎng)絡(luò)， 以 及具 有重 要意義和廣泛代表性的“ a b c ” 模型. 盡管如此月 前植 物m a d s b o x 基因 研究還存在 一些不足， 歸 納為以下5 個(gè)方面. ( 1 ) 水 稻 等單 子 葉 植 物 研 究明 顯 滯 后 于 雙子 葉 植 物 .主 要 原因 之 一 是 水 稻等 單 子葉植物中發(fā)現(xiàn)的 花發(fā)育突 變體相對(duì)較少. 目 前大多 數(shù)研究是利用雙子葉植物的 同源序列來(lái)篩選水稻c d n a文庫(kù)， 獲取水稻花發(fā)育相關(guān)基因， 然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物 花的 表型或者反義 r n a 技 術(shù)來(lái)推測(cè)其功能.但因缺乏與性狀直接聯(lián)系的證據(jù)， 這 首 都 師 范 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 些基因的具體功能無(wú)法確定. 口 卿究 范 圍 仍 需 不 斷 拓寬 . 目 前 ，對(duì)m a d s b o x 基因 的 克 隆 、 功 能 及 表 達(dá) 等 研 究主要局限于植物生殖發(fā)育過(guò)程， 而對(duì)營(yíng)養(yǎng)器官的發(fā)生與發(fā)育、植株形態(tài)發(fā)生、 抗逆性等過(guò)程的研 究較少. ( 3 ) 注 重m a d s b o x 基因 功 能的 特 異性 和 多 效 性 的 研 究 . 由 于m a d s b o x 基因 序列十分保守， 因 此其功能特異性強(qiáng). 但研究表明， 在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中， 部分 m a r s b o x基因 結(jié)構(gòu)發(fā)生 變異淇功能 可能會(huì)發(fā)生相 應(yīng)改變， 特別是不同科、 屬植物間相 應(yīng)的m . 4 d s b o x 基因的功能會(huì)發(fā)生重大變化， 表 現(xiàn)為部分m a d s b o x 基因功能 具有 多效性和廣泛性. ()同 源 克 隆 基 因的 局限 性 .利用m a d s b o x 基因 的 保守 序 列 克隆 植 物同 源 基 因 ， 可以方便快速地克隆相關(guān)基因 . 但這可能限制一些重要的 新基因的發(fā) 現(xiàn). ( 5 ) 研究對(duì)象需要不斷擴(kuò)大. 目 前對(duì)不同植物類群、不同生態(tài)類型的 m a d s - b o x 基因 研究十分有限. 對(duì)非種子植物研究尚未進(jìn)行; 對(duì)地衣、 苔醉等低等 植物， 以及藻 類等水生植物m a d s b o x 基因知之甚微. 三、 本實(shí)驗(yàn)研究目的 了 解植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向 生殖生長(zhǎng)的 轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)過(guò)程， 對(duì)于控制有花植物的 生 長(zhǎng)發(fā)育是很有意義的。 至今己 經(jīng)鑒定了許多參與控制果實(shí)和花發(fā)育的m a d s b o x 基因。 通 過(guò) 在 擬 南 芥、 金 魚 草、 矮 牽牛 等 植物 中 的 大 量 研 究 表明 : m a d s b o x 基 因單獨(dú)或聯(lián)合起來(lái)作為花器宮發(fā)育的調(diào)控因子(s h o r e a n d s h a ir o c k s ,1 9 9 5 ; w e ig e l,1 9 9 5 ; t h e i s s e n a n d s a e d le r, 1 9 9 9 ; t h e is s e n e t a l., 2 0 0 0 ) 。 花 5 官 發(fā) 育的a b c 模型中的大部分基因均為m a d s b o x 基因。 近來(lái)的研究 表明m a r s