（生物化學與分子生物學專業(yè)論文）家蠶phf5a基因的研究.pdf

浙江理工大學碩士學位論文 摘要 p h f 5 a ( p l a n th o m o l o g yd o m a i nf i n g e rp r o t e i n5 a ) 轉(zhuǎn)錄起始因子，它的分布十 分廣泛，從酵母到人類幾乎所有真核生物中都發(fā)現(xiàn)了該蛋白，但至今在原核生物 中尚未發(fā)現(xiàn)此蛋白。它編碼1 1 0 個氨基酸，屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié) 因子，缺少了p h f 5 a ，會產(chǎn)生剪接不完全的p r e m r n a 。另夕 , p h f 5 a 還與細胞周 期密切相關，缺少了p h f 5 a ，有絲分裂終止在g 2 m 期。我們在對家蠶蛹c d n a 文 庫測序過程中獲得了一個類似p h f 5 a 的基因序列，此基因由三個外顯子和兩個內(nèi) 含子組成，編碼1 1 0 個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)此基因編碼的氨基酸序列與果蠅、 人、小鼠、家鼠等物種的p h f 5 a 蛋白同源性都超過了9 0 ，因此我們將此蛋白命 名為b m p h f 5 a 。推測的蛋白分子量、等電點分別為1 2 4 7l ( d a 和8 4 ，這也與已知 的p h f 5 a 蛋白相似。 將b m p h f 5 a 基因o r f 克隆至i j p g e m t 載體上，構建了重組質(zhì)粒，經(jīng)e c o ri 和勵di 雙酶切后，插入表達載體p e t 一2 8 a ( + ) 的相應酶切位點中，成功構建了表 達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，經(jīng)p c r 、酶切鑒定以及測序分析重 組正確。i p t g 誘導表達后裂解菌作s d s p a g e 分析，在1 6 k d 處有一條特別濃的 條帶，與預期值相符，表達量可達菌體總蛋白的4 0 左右。融合蛋白以不溶性的 包涵體形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌；對包涵體進行溶解 和梯度透析復性；采用親和層析純化融合蛋i 芻h i s b m p h f 5 a 。以該融合蛋白為 抗原免疫雄性新西蘭兔制作了該重組蛋白的多克隆抗體，e l i s a 檢測該抗體血清 的效價可達到1 ：3 2 0 0 0 。w e s t e m f n 跡實驗進一步驗證了目的蛋白的表達。在亞 細胞定位中，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于在細胞核中。r n a i 顯示b m 5 細胞在g 2 m 期 的數(shù)目增加。 關鍵詞：p h f 5 a ；家蠶；鋅指蛋白；亞細胞定位；細胞周期 浙江理工大學碩士學位論文 a b s t r a c t t r a n s c r i p t i o na c t i v a t o rf a c t o rp h f 5 ai sf o u n di nm a n yd i f f e r e n ts p e c i e sr a n g i n g f r o my e a s tt oh u m a n ，b u tn oh o m o l o g o u ss e q u e n c ew a si d e n t i f i e di nab l a s ts e a r c h o ft h ep r o k a r y o t i cd a t a b a s e i tb e l o n g st oas m a l lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro rc o f a c t o r w h i c he n c o d e s110a c i d s i fp h f 5 ad e l e t e d ，p r e m r n as p l i c e du n c o m p l e t e dw a s f o u n da n dc e l lc y c l ew a s d e p l e t e dt og e m a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l es e q u e n c i n go f s i l k w o r mp u p a e ，au n i q u eb o m b y xm o r ie d n aw a si d e n t i f i e dw h i c hc o n t e i n st h r e e e x o na n dt w oi n t r o n t h ep h f 5 a p r o t e i nc o n s i s t so f1 10a a s h o m o g e n e o u sa n a l y s i s s h o w e dt h a tb m p h f 5 as h a r e d9 0 o fi d e n t i t yw i t ht h a ti nb o t hd r o s o p h i l aa n d v e r t e b r a t es u c ha sh o m o s a p i e n s ，r a t t u sn o r v e g i c u s ，m u sm u s c u l u s a c c o r d i n gt ot h e s e q u e n c i n gd a t a ，t h em o l e c u l a rw e i g h t s ，a n di s o e l e c t r i cp o i n t sw e r ee s t i m a t e da s12 4 7 k d aa n d8 4f o rb m p h f 5 as i m i l a rt oo t h e rp h f 5 a p r o t e i n si d e n t i f i e d i nt h i sp a r t ，ap h f 5 ag e n ew a sf o u n di nt h ee d n a l i b r a r yo ft h i sl a b o r a t o r y t h e o r fo ft h eg e n ew a ss u b c l o n e di n t op g e m - t v e c t o r , a f t e rb e i n gd i g e s t e dw i t he c o r ia n dx h oi ，t h ed n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h e r e s u l to fp c ra n dd i g e s t i o nw i t he c o ri x h ois h o w e dt h a tt h ed e s i g n e df r a g m e n t w a si n s e r t e dc o r r e c t l y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss e q u e n c e da n dt h es e q u e n c e m a pi n d i c a t e dt h a tar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) i n d u c e db y i p t gt h ea n a l y s i so fs d s - p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh i s - - b m p h f 5 aw a s e x p r e s s e dh i g h l yi nb l 21 ，w h i c ha c c o u n t e du pt o4 0 o fg e r mp r o t e i n s t h em o s t r e c o m b i n a n t p r o t e i nw a s i n s o l u b l ei n c i s i o n b o d ya n do n l y l i t t l ef r a c t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i no fh i s b m p h f 5 aw a ss o l u b l e i no r d e rt oo b t a i na b u n d a n t s o l u b l er e c o m b i n a n tp r o t e i n ，t h ei n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d yw a ss o l u b i l i z e d ，r e f o l d e d a n dp u r i f i e d b yn i 2 + t r a pa f f p h f 5 a t yc h r o m a t o g r a p h y , p r o t e i nh i s b m p h f 5 aw a s o b t a i n e d i m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t hf u s i o np r o t e i ng e n e r a t e dh i g ht i t e r ( 1 ：3 2 0 0 0 ) p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ，m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e mb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ea n t i b o d yc o u l db i n dt h e e x p r e s s i o nh i s - b m p h f 5 as p e c i f i c a l l y p h f 5 aw a s i i 浙江理工大學碩士學位論文 f o u n di nn u c l e u sb ys u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n k e y w o r d s ：p h f 5 a ；b o m b y xm o r i ； z i n cf i n g e rp r o t e i n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ； c e l lc y c l e i i i 浙江理工大學學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：我恪守學術道德，崇尚嚴謹學風。所呈交的學位論文，是 本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和 引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及 成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負責，并完全意識到本聲 明的法律結果由本人承擔。 學位論文作者簽名：壺1 毒選 日期：沙哆年3 月日 浙江理工大學學位論文版權使用授權書 學位論文作糞完全了解學校有關保留、使用學位論文的艦定，同_ ；蠹：學校傈鞭 并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。 本人授權浙江理二e 大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)疼遴 行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。 本學位論文藩予 保密口在年解密后適用本版權書。 不保密腳 學位論文作者簽名：玉1 毒睦 日期：沙審年；月咫日 臌輒夠幽 日期：2 岬年多月崢日 浙江理工大學碩士學位論文 第一章綜述 植物同源域蛋白( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r p r o t e i n ，p h d ) 亦稱白血病關聯(lián) 蛋白1 1 1 ( l e u k e m i aa s s o c i a t e dp r o t e i n ，l a p ) 。是在1 9 9 3 年s c h i n d l e r f l l 在研究擬 南芥同源域蛋白( h o m e o d o m a i n ) h a t 3 蛋白時發(fā)現(xiàn)的。它含有一類特征為 c y s 4 h i s - c y s 3 的鋅指蛋白結構域( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r ，p h d f i n g e r ) 長約 5 0 個氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均與r i n g f i n g e r ( c y s 3 一h i s c y s 4 ) 和l i m 結構域( c y s 2 一h i s c y s 5 ) 相似【2 1 。經(jīng)研究證明p h d f i n g e r 除了在植物中，它也 廣泛存在于酵母、線蟲與哺乳動物q h 3 , 4 1 。p h i ) 一f i n g e r 主要存在于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白， 和染色質(zhì)調(diào)節(jié)復合物( c h r o m a t i n m o d u l a t i n g c o m p l e x e s ) 中，它可能是蛋白質(zhì)與 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與d n a 或蛋白質(zhì)與r n a 相互作用區(qū)【2 1 。 轉(zhuǎn)錄起始因子是在基因表達中具有轉(zhuǎn)錄起始作用的一類蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。 p h f 5 a ( p l a n t h o m e o d o m a i n f i n g e r p r o t e i n5 a ) t 5 1 亦稱i n i ( i n i = i m t i m i o n ) 【6 1 也是一種 含有p h d f i n g e r 的蛋白質(zhì)，屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子【5 】，并在 p r e r n a 剪接【7 】，細胞周期及d n a 損傷修復中具有重要的作用。 1p h f 5 a 的發(fā)現(xiàn) i n i 是在研究受雌激素誘導的子宮肌層間隙連接蛋白c x 4 3 時發(fā)現(xiàn)的，并因其 具有轉(zhuǎn)錄起始因子的作用而命名【5 1 。 受雌激素誘導的子宮肌層間隙連接蛋i ! t c x 4 3 屬于c o n n e x i n 家族【8 1 ，它是一種 跨膜蛋白，在胎兒發(fā)育早期表達【9 1 ，在成體中的許多組織中都有發(fā)現(xiàn)。它在心肌 中表達量最高，并且是組成型表達【1 0 1 。在子宮中，c x 4 3 在調(diào)節(jié)肌肉同步收縮中 是相當必要的】，與心肌的組成型表達不同，c x 4 3 在子宮中的表達受到固醇類 激素調(diào)控”】。為了研究雌激素在子宮肌層中的誘導機制，陳等提出在家鼠 t a t a 框上游1 2 b p 處有激活蛋白( a c t i v a t o r p r o t e i n ) 1 位點，轉(zhuǎn)錄激活因子家族c “h 和c - f o s 通過結合在激活蛋白1 位點而間接發(fā)揮作用。但是人們發(fā)現(xiàn)如果突變a p 一1 位點從而使c q u n 和c - f o s 不能與a p 一1 位點結合并不能消除c x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆?應f 7 】。通過分析表明，臨近c x 4 3 啟動子的區(qū)域?qū)τ赾 x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆磻彩?非常重要的。此區(qū)域可以與含1 1 0 個氨基酸的蛋白質(zhì)結合，人們通過掃描受雌激 浙江理工大學碩士學位論文 素誘導的鼠子宮肌層表達文庫而鑒定出這是一個新的保守性相當高的鋅指蛋白 1 5 ，它屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子7 1 ，能增強c x 4 3 對雌激素的應答 f 1 。因為這種蛋白具有轉(zhuǎn)錄起始因子的作用，取起始( i n i = i n i t i a t i o n ) 前三個字母 命名之，即i n i ”，后來有人在鼠的基因組中分選出了這種蛋白質(zhì)，因其含有 p h d f i n g e r 結構域就將其命名為p h f 5 a i ”，目l j 關于這種蛋白質(zhì)還沒有統(tǒng)一的名 稱，本文中以p h f 5 a 命名。 2 p h f 5 a 的特征 p h f 5 a 是一種高度保守且廣泛存在的蛋白質(zhì)，分布在從酵母到人類的真核生 物中，但迄今為止在原核生物中沒有發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 的存在7 1 。n o r t h e r nb l o t 分析表 明，p h f 5 a 在不同的組織中，如：腦、心臟、卵巢、子宮、骨骼肌、睪丸中都只 有單一的轉(zhuǎn)錄本，長約1 2k b t ”。 2 1p h f 5 a 的保守性 p h f 5 a 只有短短的1 1 0 個氨基酸【5 1 ，但它在進化上是極度保守的。在蛋白質(zhì) 水平上，在n c b i 上進行b l a s t 時發(fā)現(xiàn)( 如圖1 1 所示) ，p h f 5 a 在脊椎動物中的 同源性為1 0 0 ，在多細胞生物中，p h f 5 a 的同源性要超過8 0 ，即使在同源性 最低的啤酒酵母中p h f 5 a 的同源性也超過t 5 0 t 羽。在核酸水平上，p h f 5 a 也是 相當保守的，在n c b i 上進行b l a s t 時發(fā)現(xiàn)，鼠和人的同源性超過了9 0 。在用 家蠶進行b l a s t 時發(fā)現(xiàn)，家蠶與人、鼠等脊椎動物及果蠅、岡比亞按蚊的同源 性都超過了9 0 ，但是家蠶與果蠅、岡比亞按蚊的同源性低于人、鼠等脊椎動物 等的同源性，相差的部分來自于羧基端的n l s 序列。 圖1 1p h f 5 a 在不同物種中的同源性比對1 8 i 2 浙江理工大學碩士學位論文 f i 9 1 1a n a l y s i so fp h f 5 ah o m o l o g yi nd i f f e r e n ts p e c i e s ，i d e n t i c a lr e s i d u e sa r eb o x e di n b l a c k , c o n s e r v e dr e s i d u e sa r eb o x e di ng r a y 2 2p h f 5 a 的分布 從酵母到人類的真核生物中都發(fā)現(xiàn)了p h f 5 a ，但在原核生物中尚沒有發(fā)現(xiàn) p j 。在挪威鼠中的n o r t h e r nb l o t 分析表明，p h f 5 a 在不同的組織中，如：腦、心 臟、卵巢、子宮、骨骼肌、睪丸中都只有單一的轉(zhuǎn)錄本 ”。而在對家鼠進行染色 體定位時發(fā)現(xiàn)，p h f s a 存在假基因，并且p h f 5 a 與假基因分別位于不同的染色 體上【6 】。用融合了g f p 的重組g f p p h f 5 a 進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 位于細胞核 內(nèi)，并在核仁中沒有發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 的存在【7 1 。目前，所有的研究都集中在脊椎動物 中的人、鼠及無脊椎動物的酵母、線蟲中，在昆蟲中尚沒有報道。 2 3p h f s a 的結構特征 對p i t f 5 a 進行二級結構預測發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 從n 端到c 端依次為：三個鋅指結構、 一個亮氨酸拉鏈、一個核定位信號( n l s ) 【7 】( 如圖1 2 所示) 。在此結構中，最 n 端的鋅指結構含有較多的堿性氨基酸，體# b e m s a 實驗發(fā)現(xiàn)，當切除此區(qū)域發(fā) 現(xiàn)p h f 5 a 不能結合至i d n a 上，而切除后兩個鋅指結構并不妨礙p h f 5 a 結合到 d n a ，說明最n 端的鋅指結構是結合d n a 所必須的。雖然切除后兩個鋅指結構并 不妨礙p h f 5 a 結合到d n a ，但是p h f 5 a 并不具備轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子的功能。c 端n l s 序列在p h f 5 a 的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要的作用，人們發(fā)現(xiàn)【釀，如果切除 n l s 序y l j p h f 5 a 將不能進入細胞核內(nèi)，而是富集在細胞質(zhì)中。 t 鸛揀獅矬輔糖輔甜 狂獼符戡鍆髓t 0 2t 琦 戳瞪疆童趟立篷毯越盎：越函杰波士士捌翻 材抖e e ee ee eeeeelgllr k 拭螭髓 = 罱= 墨= 目霉# t t _ 蚴 r h 婚f 嘲 h 秈z t p l w 圖1 2p h f 5 a 序列分析h i f i 9 1 2a n a l y s i so ft h ep h f 5 as e q u e n c e 3 p h f s a 的功能特點 3 1p h f s a 在基因表達時的調(diào)節(jié)作用 浙江理1 ：人學碩士學位論文 3 1 1 作用特點 p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子結合到基因的啟動子7 5 - 3 4 附近的區(qū)域啟動 或促進基因的轉(zhuǎn)錄【5 1 ；p h f 5 a 在不同的細胞或組織中對雌激素的反應可能是不同 的f 7 ，m 】，例如，在非洲綠猴腎纖維原細胞中p h f 5 a 的表達量隨雌激素的濃度的 升高而增；9 1 1 7 1 ，而在人肝癌上皮細胞p h f 5 a 的表達量與雌激素的濃度沒有關系 【7 】：在生物發(fā)育的不同時期具有不同的作用【1 7 】，如在線蟲的幼蟲中p h f 5 a 是必 需的，缺失了它將造成幼蟲的死亡，但是缺失了p h f 5 a 的成體不會死亡。 3 1 2p h f 5 a 在c x 4 3 表達時的作用 c x 4 3 作為一種跨膜蛋白聚合在一起在細胞表面形成間隙連接通道【1 8 】，有利 于細胞間的物質(zhì)和能量的交流。另外c x 4 3 能夠調(diào)節(jié)細胞的電勢差【1 9 】，在信號轉(zhuǎn) 導途徑中發(fā)揮重要的作用，比如，c x 4 3 能夠調(diào)節(jié)心肌細胞有節(jié)律的跳動餑】。c x 4 3 基因在表達過程中受雌激素受體調(diào)節(jié) 7 , 2 0 , 2 1 】。 o l t r a 等人【5 】在研究中發(fā)現(xiàn)，在c x 4 3 表達過程中需要p h f 5 a 的參與。p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子能夠特異結合在c x 4 3 基因啟動子一7 5 3 4 附近的區(qū)域增強 c x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆磻尽?。p h f 5 a 結合到c x 4 3 啟動子上時，促進了雌激素受 體轉(zhuǎn)錄激活作用1 1 2 2 2 3 l ( a c t i v a t i n gf u n c t i o n1 ) ，而不是轉(zhuǎn)錄激活作用2 【7 l ( a c t i v a t i n g f u n c t i o n2 ) 。用重組質(zhì)粒p c d n a f l a g 。p h f 5 a 轉(zhuǎn)染h e l a 細胞發(fā)現(xiàn)【7 】，p h f 5 a 的過量表達以劑量效應的方式增強c x 4 3 的表達。在研究p h f 5 a 對c x 4 3 表達調(diào) 節(jié)作用是發(fā)現(xiàn)了一個十分奇特的現(xiàn)象，o l t r a 等人1 7 1 將p h f 5 a 與雌激素一同處理 小鼠，n o r t h e r n b l o t 分析表明，p h f 5 a 的m r n a 含量提高了，似乎表明p h f 5 a 的表達與受雌激素相關。 3 1 3p h f 5 a 對e r a 調(diào)節(jié)作用 雌激素受體( e r e 0 是配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子【2 4 , 2 5 1 ，屬核受體超家族成員。維 持雌性性征、卵泡發(fā)育、排卵等生理活動2 5 ，26 1 ，并在子宮成熟和胚胎附植過程 中起著重要作用2 ”。 在研究p h f 5 a 對c x 4 3 調(diào)節(jié)作用時，o l t r a 等人【7 坼帶熒光素酶的重組質(zhì)粒 h e l 5 p h f 5 a 轉(zhuǎn)染到h e l a 細胞中，此質(zhì)粒只表達e r a 的轉(zhuǎn)錄激活作用i ( a f 1 ) 結構域，在與只帶有熒光素酶而沒有e r a 的重組質(zhì)粒h e l 5 比較發(fā)現(xiàn)，熒光素 水平有明顯提高，暗示p h f 5 a 能夠增強e r c t 的活性，并且能夠激活a f l 7 , 2 8 。 隨后他們又構建了重組質(zhì)粒h e o p h f 5 a ，此質(zhì)粒中可表達的e r a 的a f 一1 和轉(zhuǎn) 4 浙江理l ：人學碩士學位論文 錄激活作用2 ( a f 一2 ) 雙結構域7 ，2 8 9 1 ，出現(xiàn)了同樣的結果。但是當用只表達a f 2 的載體h e l 9 構建重組質(zhì)粒h e l 9 p h f 5 a ，轉(zhuǎn)染h e l a 細胞時發(fā)現(xiàn)，熒光素水平 并沒有明顯變化。這說明p h f 5 a 能夠特異地與a f 1 結構域作用。 3 2p h f 5 a 在p r e - m r n a 剪接中的作用 r n a 剪接( r n as p l i c i n g ) 是t r n a 、r r n a ，特別是m r n a 加工與成熟的重 要生物學過程，也是蛋白質(zhì)分子多樣性產(chǎn)生的關鍵機制之一f 3 0 , 3 1 。r n a 剪接 是一個多步驟、形成多種中問狀態(tài)復合物的復雜過程。r n a 剪接需要多種因 子參與，包括雜性核r n a ( h e t e r o g e n e o u s n u c l e a r r n a ，h n r n a ) 結合蛋白 h n r n ( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n ) 、小核r n a ( s m a l ln u c l e a rr n a ， s n r n a ) 結合蛋白s n 時姐( s m a l l n u c l e a rr i b o n u e l e o p r o t e i n ) 等【3 2 ，3 3 ，3 4 1 。 p h f 5 a 是一種與p r e m r n a 剪接相關的蛋白質(zhì)，2 0 0 2 年，o h i 等人對s c e r e v i s i a e 和p o m b e 中純化的復合物u 2 ，u 5 腳6s n 對妤進行光譜分析時發(fā)現(xiàn)了 p h f 5 a 1 3 5 】，同時如果阻斷t p h f 5 a 的表達，會產(chǎn)生剪接不完全的p r e m r n a t 6 ，15 1 。 通過r t - p c r 檢測正常細胞的p r e m r n a 與剔除了p h f 5 a 的細胞的p r e - m r n a ，發(fā) 現(xiàn)在突變體中p r e - m r n a 累積【6 】，這些p r e m r n a 是c d c 2 5 ，c d c 2 8 ，p r p l 2 ，它們編 碼的蛋白在細胞周期中具有重要的作用。在剔除了p h f 5 a 的細胞中除了有 p r e m r n a o b ，人們還發(fā)現(xiàn)細胞周期被阻滯在g 2 期【“，似乎表明在p r e m r n a 的剪 接中p h f 5 a 是必要的，同時一些有絲分裂必需因子m r n a 的形成也需要p h f 5 a 。 3 3p h f 5 a 在細胞周期中的作用 有絲分裂時從g 2 期到m 期的轉(zhuǎn)換i ： t c d c 2 有絲分裂周期蛋白的活性控制【3 6 1 。 有絲分裂中，c d c 2 c d c l 3 - - - - 聚體中的c d c 2 亞基處于活性狀態(tài)，其t h r - 1 5 沒有磷酸 化，而t h r - 1 6 1 被磷酸化。在起始點后，c d c 2 c d c l 3 二聚體的活性被t h r - 1 5 上增加 的磷酸基團抑制p 引。因此，該抑制性磷酸基團的去除是激活有絲分裂的關鍵。 c d c 2 5 編碼酪氨酸磷酸酶，該酶對c d c 2 c d c l 3 二聚體中c d c 2 的去磷酸化是必需的 3 9 4 1 1 。 在通常情況下，細胞分裂周期與細胞大小有關。w e e l 基因通常抑制細胞進 入有絲分裂直到系細胞體積足夠大4 2 1 。w e e l 編碼異常類型的激酶：它可以磷酸 浙江理l ：大學碩士學位論文 化s e r t h r 和t y r ，它通過磷酸化t h r - 1 5 抑帶1 c d c 2 4 3 , 4 4 1 。 w e e l 產(chǎn)物與c d c 2 5 的產(chǎn)物有拮抗作用。w e e l 的激酶活性作用在t h r - 1 5 上抑 制c d c 2 的功能”1 。c d c 2 5 的磷酸化活性作用在同一個位點上激活c d e 2 。c d c 2 5 過量表達的突變與w e e l 的缺失突變有相同的表型。因此，c d c 2 活性的調(diào)控對決 定酵母細胞何時允許自身進入分裂循環(huán)很重要；被w e e l 抑制和被c d c 2 5 激活允 許細胞依賴環(huán)境或其它信號來控制這些調(diào)控因子。 2 0 0 3 年，w e r n e r 等人【”1 構建p h f 5 a 缺失體，發(fā)現(xiàn)細胞變長，失去有絲分 裂能力。而當他們將構建重組質(zhì)粒p j k - r e p 8 1 一p h f 5 a i ( 載體r e p 8 1 含有硫胺素 抑制啟動子n m t 8 1 ) 轉(zhuǎn)染到p h f 5 a 缺失體中，記為a p h f s a l ，發(fā)現(xiàn)細胞恢復有 絲分裂能力，當用硫胺素處理a p h f 5 a 1 時發(fā)現(xiàn)，細胞表型與p h f 5 a 缺失體相 同。 為了檢測w e e l 在a p h f 5 a 1 中是否起作用，w e m e r 等人剔除了w e e l 基 因，然后構建了w e e l 5 0 p 嬲跗j 雙突變體。此雙突變體含有硫胺素抑制啟動 子n m t s l ，又受溫度控制，在2 5 激酶w e e l 表達，而在3 6 就不會表達。經(jīng) 過比較發(fā)現(xiàn)，如果在2 5 加入硫胺素，細胞仍會生長，但如果在3 6 下，細 胞數(shù)目就會增多，出現(xiàn)異常有絲分裂，但8 小時后細胞會大量死亡。而在p h f 5 a 缺失體中細胞延長，但不會死亡。這大概可能是因為w e e l 在p h f s a 缺失體起 保護作用。 3 4 在細胞d n a 損傷中的作用 d n a 破壞檢驗點( d n ad a m a g ec h e c k p o i n t s ) 是指d n a 損傷引發(fā)的能使細胞周 期延遲或阻滯的生化調(diào)控途徑【舶1 ，它指在進入到細胞周期的下一時相前對d n a 的完整性進行檢測的一些特殊時點【4 7 1 。如果d n a 損傷，會引發(fā)一系列細胞反應， 包括：( 1 ) 激活d n a 修復系統(tǒng)，修復受損的d n a ，使d n a 復制繼續(xù)進行；( 2 ) 激活 d n a 破壞檢驗點，使細胞周期阻滯，以便細胞有充分的時間進行修復，避免該 損傷遺傳至后代細胞；( 3 ) 使一些損傷嚴重、修復無望的細胞發(fā)生凋亡；( 4 ) 轉(zhuǎn)錄 某些特定的基因，以利于細胞的生存 4 8 - 5 1 】。 r a d 3 與屬于p 1 3 k 激酶家族 5 2 1 ，在d n a 損傷檢驗點的活化中起著重要的作用 1 5 3 - 5 5 1 ，是作用于d n a 破壞檢驗點早期的一種重要蛋白。 浙江理l 大學碩士學位論文 o l t r a 等人構建了酵母p h f 5 a 的缺失菌株觀測d n a 受損后細胞的反應，他們 檢測了& p o m b e 中的檢驗點激酶r a d 3 。研究發(fā)現(xiàn)r a d 3 并沒有什么變化，細胞也沒 有出現(xiàn)修復的跡象【1 5 1 ，同時細胞仍然不能分裂，這似乎表明p h f 5 a 弓i 起的細胞 分裂中止現(xiàn)象是細胞本身不可修復的。他們隨后構建了重組質(zhì)粒r e p 3 x p h f 5 a 轉(zhuǎn)染到缺失菌中，發(fā)現(xiàn)細胞又能進行有絲分裂。 但是，t r a p p 等人在線蟲中進行相同的實驗時發(fā)現(xiàn)【1 7 j ，在胚胎期和幼蟲期缺 失了p h f 5 a 會引發(fā)線蟲的死亡，而在成蟲中缺失了p h f 5 a 不會誘發(fā)細胞的死亡。 4 展望 綜上所述，p h f 5 a 在基因表達、細胞周期、p r e m r n a 剪接等過程中發(fā)揮著 重要的作用。但是作為一種上世紀9 0 年代后期才發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，相關研究還不 是很多，蛋白質(zhì)的功能還不是很明確。比如：人們在p r e m r n a 剪接復合體中發(fā) 現(xiàn)了p h f 5 a t ”1 ，可p h f 5 a 是參與p r e m r n a 剪接復合體的形成，還是作為剪接 復合體的一部分參與p r e - m r n a 的剪接；p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子存在【7 1 ， 那么它調(diào)控哪些基因的表達，具體調(diào)控機制又是怎樣的? 另外，人們發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 在幼體中是必不可少的，而在成體的缺失體又不是致死的【”】，這又是為什么? 在d n a 損傷時會引發(fā)多種細胞反應，但是當p h f 5 a 缺失時，細胞既沒有激活 修復系統(tǒng)，也沒使這些無法修復的細胞發(fā)生凋亡，那么在細胞中應該有一種代償 機制，此機制雖然無法使細胞繼續(xù)分裂，但卻能夠使細胞生存，此機制到底是什 么，又是怎樣發(fā)揮作用的? p h f 5 a 的保守性相當高，但是它的分布又具有局限 性，那么p h f 5 a 是如何進化而來得，為什么只在真核生物中表達，原核生物中 到底有沒有這種蛋白質(zhì)，在真核生物中它最基本的功能到底是什么? 它能否作為 進化的標尺? 鑒于p h f 5 a 的高保守性，我們有理由相信它在生物體的發(fā)育過程 中扮演非常重要的角色。相信在不遠的未來，p h f 5 a 的功能及其保守原因都會 更清楚。 浙江理 大學碩十學位論文 第二章b m p h f s a 的生物信息學分析 1 生物信息學工具 用b l a s t 軟件( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 在g e n b a n k q 6 對獲得的 家蠶新基因的氨基酸序列進行同源性比較，之后使用生物軟件網(wǎng)在線b l a s t 工 具( h t t p ：w w w b i o - s o f t n e t ) 尋找o r f 框，并預測其氨基酸序列及基本性質(zhì)，再 用此氨基酸序列在n c b i 進行b l a s t l l ：對，查找同源蛋白質(zhì)，根據(jù)同源蛋白質(zhì)的 性質(zhì)預測其功能。并用b i o e d i t 軟件對序列進行比對。并用在線工具p r o t s c a l e 、 t m h m m 、s i g n a l p 對p h f 5 a 進行疏水性分析，跨膜結構預測及信號肽預測。 2 生物信息學分析 2 1b m p h f 5 a 的基因分析結果 2 1 1 b m p h f 5 a 的基因分析 將本實驗室的e d n a 序列在家蠶基因組比對確定后，用在線軟件分析o r f ，在 n c b i 上比對后，推測為p h f 5 a ，下表兩方框內(nèi)的部分即為p h f 5 a 的o r f ，按 57 端到3 的方向，依次為起始密碼子與終止密碼子。此基因編碼1 l o 個氨基 酸，在基因的3 u t r 處有三個加尾信號。 1 g t t t g 硝瞻a t a a c a a t c a a a g a a c a t t c g c c a g c a g a c c a g a c c 唧嫩t j 玨a a a d 酊g | g c ma 6 1 a a a g c a t c a t c c a g a t t t a a t t t t c t g c a g g a a a c a g c c c g g a g t c g c t a t t g g a c g t t t khh pdl ifcr kq p gva工grl 1 2 1 a t g t g a g a a a t g t g a c g g a a a a t g t g t g a t t t g c g a t t c t t a t g t g c g t c c g t g c a c g t t cekc d gk cv工c d syvr p ct l 1 8 1 g g t t c g t a t t t g t g a c g a g t g c a a c t a t g g c t c g t a t c a g g g g c g a t g t g t g a t t t g c g g vr i c de cny g syqgrcv工c g 2 4 1 c g g g c c t g g a g t a t c t g a t g c t t a t t a _ r t g t a a g g a g t g c a c g a t a c a g g a g a a g g a t a g gp gvs day y c ke c ti q e kdr 3 0 1 a g a t g g c t g t c c a a a g a t t g t c a a t t t g g g a a g c t c t a a a a c a g a t c t g t t c t a c g a g a g d gc pk ivnlgss k td lfyer 3 6 1 a a a g a a a t a t g g g t t t a g g a g a c a d t a g 阻t t a g g t t t c t t t t t a g t t t t t a a a t a t t a a kk y gf r rh 4 21 t t t c t g c a a a g t t t c t g t t a t t t a a a a t a a t a a a a a c a g a g g t t t t t c t c a a c t a a a g t t 4 8 1 t g a t t g a a a t a c a a g t t t g t t t t t a t c a a c t a c t t t g t t g t t g a c t t t t t a a a g c c a a c g 5 41 g c t a t t a t g a t c a a g t a t g g t t t t c a a t g t c t a a a g a g t t g c a g c t c g g g t c c a a g a g a a 浙江理f ：人學碩士學位論文 6 0 1a t t c a c a t a t a t t t t t t t a a a t t c a t t c a t t t a t a c a a t t g g a t 粥t 粥t i a t c g a t g a t 6 6 1 a t c t g t t a t t t t t t t a c a a t t t t t t t t a t c c t t t g t t t a t t c a a t g c a g a t t a g t t t t c a 7 21t t t t c c a a c t a g a a a g a a a a t a c t t g a a a a a t a c a t t t a g t t t t t g c a 唧a a a t t a t t a 7 8 1 a g a t t c a t t t t t a t t t t t t a t t t t t c t a c t a a a t t g t c a a t a a a g a t a t t t t t g a c t a c c 8 41 a t g t g c t c t g t a a a a c t a c a g a c a a t a t g t t a g c a a t a t t c a t g t a t g t a a t g a g a g t g a 9 0 1 t t g t a c t g t g t g a a t g t t g t c t g t c a t a t t t t g a a a a c t a t g t t t c t a g t g t g t a c t t a c 9 6 1 a t t a a g a c a t t a t g t a a t t a t t a a t a a a t g c a t t g g t a t t a c a c 2 1 1 口朋f 糾基因的結構分析 我們將b m p h f 5 a 的e d n a 在家蠶基因組中比對時發(fā)現(xiàn)，m p h f 5 a 基因由三 個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，結果如圖2 1 ，其中最兩端的用白色方框表示的部 分從左至右依次為5 u t r 和3 u t r ，黑色方框表示o r f ，黑色方框內(nèi)的線段 表示內(nèi)含子，各部分下面的數(shù)字表示各部分的堿基數(shù)。另外，如圖所示，5 u t r 和3 u t r 分別與o r f 的5 7 端和37 端相連。 5 二】 二 a 5 5 5 27 4 1 9 1 4 4 49 0 6 1 5 2 2 保守性分析 圖2 1b m p h f s a 基因的結構示意圖 f i g2 1t h es c h e m a t i cs t r u c t u r eo f b m p h f s a 經(jīng)過b l a s t 比對確認該基因編碼1 1 0 個氨基酸。所預測的蛋白質(zhì)分子量大約 為1 2 4 7k d a ，等電點約為8 4 。對該蛋白進行同源性分析時，發(fā)現(xiàn)該蛋白是相當 保守的，家蠶p h f 5 a 與人、