（細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)論文）轉(zhuǎn)基因番茄葉綠體特征及其蛋白質(zhì)差異研究.pdf

轉(zhuǎn)基因番茄葉綠體特征及其蛋白質(zhì)組差異研究 摘要 本實驗以一株轉(zhuǎn)基因番茄( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u mv a nc e r a s i f a r m ) 為實驗材料，通 過對其細(xì)胞學(xué)特征、倍性和蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，為研究變異機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。主要取 得以下進(jìn)展： 1 轉(zhuǎn)基因植株葉片總?cè)~綠素含量較對照株略微增加，而保衛(wèi)細(xì)胞和柵欄組織中的葉 綠體數(shù)目則分別是對照株的1 7 和1 6 倍。 2 經(jīng)透射電子顯微鏡分析葉綠體的顯微結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)基因植株中的葉綠體表現(xiàn)出明顯的 膨脹，且內(nèi)囊體膜發(fā)育不良，呈現(xiàn)出模糊和不連續(xù)現(xiàn)象。 3 利用流式細(xì)胞儀分析d n a 含量，結(jié)果表明此轉(zhuǎn)基因植株為3 倍體植株。 4 通過雙向電泳技術(shù)，共得到了3 6 8 個差異蛋白。以對照株的蛋白組圖譜為參考， 轉(zhuǎn)基因植株有1 2 2 個蛋白上調(diào)，2 4 6 個蛋白下調(diào)。 5 成功鑒定出1 6 個豐度百分比差異在二倍以上的蛋白點，它們涉及到很多生物學(xué)功 能。 關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因，櫻桃番茄，透射電鏡，流式細(xì)胞技術(shù)，雙向電泳 r e s e a r c ho nc h l o r o p l a s tc h a r a c t e r sa n d p r o t e o m i cv a r i a t i o n so f t r a n s g e n i ct o m a t o a b s t r a c t a t r a n s g e n i ct o m a t o ( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u my a ec e r a s i f a r m ) p l a n th a sb e e ns t u d i e da n di t s c y t o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，d n ap l o i d y a n dp r o t e i ne x p r e s sv a r i a n c e sc o m p a r e dw i t ht h e w i l d t y p ep l a n tw e r ec h a r a c t e r i z e d t h e s e r e s u l t sw i l lp r o v i d et h eb a s i so fm u t a t i o n m e c h a n i s m h e r ea r es o m ec o n c l u s i o n sw ea c h i e v e di nt h i sr e s e a r c h ： 1 l e a ft o t a lc h l o r o p h y l lc o n t e n to ft r a n s g e n i cp l a n th a v ei n c r e a s e ds l i g h t l yc o m p a r i n gt h e c o n t r o l ，w h i l et h en u m b e r so fc h l o r o p l a s t si nt h eg u a r dc e l l sa n dp a l i s a d et i s s u ei nt r a n s g e n i c p l a n tw e r e1 7a n d1 6t i m e sm o r et h a nt h a ti nc o n t r 0 1 2 m i c r o s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s tw a sa n a l y z e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e s t m c t u r eo fc h l o r o p l a s ti nt r a n s g e n i cp l a n t l e ts h o w e de x p a n s i q n ，a n dt h es h a p eo ft h y l a k o i d s w a sb l u r r ya n di n c o m p a e t 3 f l o wc y t o m e t r yr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n tw a st f i p l o i d 4 u s i n gt h et w o d i m e n s i o n a lg e le l e e t r o p h o r e s i s ，w ef o u n d3 6 8p r o t e i nv a r i a n c e s t h e c o n t r o lg e lw a ss e r v e d 雒t h er e f e r e n c e i nt r a n s g e n i cp l a n t l e t ，12 2p r o t e i ns p o t ss h o w e da d e c r e a s ei nt h e i ri n t e n s i t y ，w h i l eo t h e r2 4 6s p o t sw e r ei n c r e a s e d 5 1 6p r o t e i ns p o t s ( v a l u er a t i o 一2 ) w e r ei d e n t i t i e ds u c c e s s f u l l y t h e s ep r o t e i n si n v o l v e di n m a n yb i o l o g i cf u n c t i o n s k e yw o r d s ：t r a n s g e n e ，l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，f l o w c y t o m e t r y , t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s 西北大學(xué)學(xué)位論文知識產(chǎn)權(quán)聲明書 本人完全了解西北大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定。 學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版。 本人允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西北大學(xué)可以將本學(xué)位論文的 全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃 描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研 究所等機(jī)構(gòu)將本學(xué)位論文收錄到中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫或其它 相關(guān)數(shù)據(jù)庫。 保密論文待解密后適用本聲明。 學(xué)位論文作暑簽名：二牡指導(dǎo)教師簽名： a 滬了年6 月暑 日 知了 年6 月羅日 西北大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研 究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和 致謝的地方外，本論文不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成 果，也不包含為獲得西北大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使 用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已 在論文中作了明確的說明并表示 身 意。 靴敝零鬻唆日 炒了年月宕日 西北人學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展 第一章前言 1 1 1 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 1 1 1 1 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展 植物生物技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破了物種間的界限，將有用的外源基因轉(zhuǎn)入其他物 種，使遠(yuǎn)緣生物之間可以進(jìn)行基因的交換，創(chuàng)造新種質(zhì)或品種。到目前為止，人們已經(jīng) 設(shè)計和提出了很多的轉(zhuǎn)基因方法，它們各具特色，其中一些主要的、常用的方法如下： 1 ) 根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)： 在所有產(chǎn)毒的根瘤土壤桿菌中普遍都存在著t i 質(zhì)粒，分子量大：b 2 0 0 2 5 0 k b 。在不同 株系的根瘤土壤桿菌中，t i 質(zhì)粒一般分為四個區(qū)域，即與腫瘤形成有關(guān)的t - d n a 區(qū)和v i r 區(qū)，還有兩個與接合轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒自身復(fù)制有關(guān)的區(qū)域。在腫瘤形成過程中，t o d n a 可以 被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中并插入到染色體基因組。這種方法是目前最常用的方法之一，主要 用來對雙子葉植物進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化，具有很高的轉(zhuǎn)化成功率。同時也被用于其它植 物的轉(zhuǎn)化形式【1 1 。 2 ) 植物病毒載體系統(tǒng)： 植物病毒載體系統(tǒng)的主要原理是將外源基因插入到病毒基因組中，利用病毒對植物 細(xì)胞的感染，將外源基因?qū)氲街参锛?xì)胞。目前，比較常見的植物病毒載體系統(tǒng)有三種： 單鏈r n a 植物病毒載體系統(tǒng)、單鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng)和雙鏈d n a 植物病毒載體 系統(tǒng)。 a 單鏈r n a 植物病毒載體系統(tǒng) 大多數(shù)植物病毒的遺傳物質(zhì)都是具有感染性的正鏈r n a ，因此選擇以單鏈r n a 植物 病毒作載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。b i s a r o 和s i e g e l1 2 ：j ：1 9 8 0 年應(yīng)用煙草脆裂病毒( t r v ) 進(jìn)行轉(zhuǎn)基 因操作，并首先提出了這種病毒載體系統(tǒng)。它的主要步驟是：首先用反轉(zhuǎn)錄酶和d n a 聚合酶將單鏈的病毒r n a 合成為雙鏈的e d n a 拷貝，然后將其克隆到原核生物的質(zhì)粒或 粘粒載體上，通過常規(guī)的遺傳操作和分子生物學(xué)的方法對載體d n a 進(jìn)行改造，將外源基 因插人到病毒的c d n a 部分，最后，再通過體外轉(zhuǎn)錄，將帶有外源基因的病毒d n a 感染 并進(jìn)入植物受體細(xì)胞。 隨著研究的深入，又有很多單鏈r n a 病毒載體被發(fā)現(xiàn)。其中，有一些已得到廣泛應(yīng) 第一章前言 用，對其的研究也較為充分，例如雀麥花葉病毒( b m 、，) f 3 j 、煙草花葉病毒( t m v ) 訓(xùn)。 b 單鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng) 雙粒病毒是一類單鏈d n a 植物病毒，其病毒顆粒一般是成對存在的。它的基因組比 較小，其大小約為2 5 3 5 k b ，主要是由單鏈的環(huán)狀d n a 分子組成，但也含有少量的復(fù)制 型雙鏈d n a 分子。雙粒病毒成對的兩個顆粒中所包含的基因組可以不同，但只有當(dāng)兩種 d n a 混合時才具有感染性網(wǎng)。這種二連基因組載體系統(tǒng)的優(yōu)點就在于此，當(dāng)病毒的復(fù)制 基因只在一種基因組上時，那么在另一種基因組上插入外源基因，將不會影響到整個基 因組的復(fù)制。這種載體系統(tǒng)也存在著一定的局限性，它的感染部位僅局限在植株的維管 組織，而且大部分靠媒介昆蟲傳毒，不能機(jī)械轉(zhuǎn)移接種；另外，這種病毒都是球形顆粒， 插入外源d n a 的片段不能太大【6 1 。 c 雙鏈d n a 植物病毒載體系統(tǒng) 雙鏈d n a 病毒載體系統(tǒng)的典型代表是花椰菜花葉病毒( c a m v ) 。c a m v 的基因組是 雙鏈環(huán)狀的d n a ，長度大約為8 o k b 。雖然c a m v 本身可以作為承載小片段外源d n a 的 克隆載體，但由于在它的大多數(shù)限制性酶切位點中插入外源d n a 都會導(dǎo)致病毒失去感染 性，而且它不能包裝具有大于原基因組3 0 0 b p 的重組體基因組。因此，近年來人們主要 研究將c a m v 的d n a 整合到t i 質(zhì)粒d n a 中組成混合的載體系統(tǒng)1 7 1 。 2 ) d n a 直接導(dǎo)入法： 由于土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和植物病毒載體系統(tǒng)的操作要求高，而且步驟比較繁瑣， 所以近些年來，d n a 的直接導(dǎo)入法被越來越廣泛的應(yīng)用。d n a 直接導(dǎo)入法的植物材料 對象大多是原生質(zhì)體，另外其他的一些植物材料也可以作為細(xì)胞受體，包括器官分生組 織、未成熟的胚、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、花粉、卵細(xì)胞等等。 d n a 直接導(dǎo)入法可分為：化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、微注射法、基因槍法 ( 微彈轟擊法) 和花粉管通道法等等。 a 化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法 現(xiàn)在被使用最多的化學(xué)物質(zhì)是聚乙二醇( p e g ) ，它能刺激原生質(zhì)體，使其較好地 接受外源d n a 的進(jìn)入。p e g 通過電荷之間的相互作用與d n a 形成緊密復(fù)合物，植物細(xì)胞 通過內(nèi)吞作用吸收這些復(fù)合物到細(xì)胞內(nèi)。一般低濃度的p e g 不會對原生質(zhì)體造成傷害。 p e g 法首先用于轉(zhuǎn)導(dǎo)象t i 質(zhì)粒那樣比較大的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)的原生質(zhì)體一般來源于煙草等雙 子葉植物。現(xiàn)在用此法來轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌質(zhì)粒這樣小的d n a 分子，轉(zhuǎn)化率可達(dá)l o 4 【8 1 。 b 脂質(zhì)體法 2 西北大學(xué)碩士學(xué)位論文 脂質(zhì)體法的基本原理是將包含外源基因的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體相融 合，從而達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的【9 ，1 0 1 。一般可分為以下四個步驟：原生質(zhì)體分離和純化；脂 質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體與脂質(zhì)體的融合以及轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)：篩選和鑒定。結(jié)合使用p e g 或p v a 等化學(xué)試劑可以促進(jìn)植物原生質(zhì)體與大腸桿菌或農(nóng)桿菌的融合【1 1 j 。 c 電穿孔法 植物細(xì)胞膜在外界高壓電脈沖下會造成非對稱穿孔，由于這種孔孔徑較小( 8 4 r i m 左右) ，加之可在很短時間內(nèi)( 2 0 0 n s ) 恢復(fù)到0 5 n m ，所以這對細(xì)胞本身的生理活動的 影響不大。在每個細(xì)胞膜上的穿孔多達(dá)上百個，因此外源基因可以由此進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。 電穿孔法大致可分兩類：高壓短時程法和低壓長時程法。一般是根據(jù)細(xì)胞種類和實驗條 件來具體選擇方法。 d 微注射法 微注射法是使用毛細(xì)微管( 一般針尖的直徑為0 5 n m ) ，在顯微鏡下將外源d n a 直接 注射入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的一種方法。這種方法首先在動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因中使用【1 2 】， 由于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的彈性，此法在植物上的應(yīng)用時進(jìn)行了一些改進(jìn)，即 將細(xì)胞用瓊脂糖多聚賴氨酸固定。此外科學(xué)家們使用此方法不僅對細(xì)胞質(zhì)，而且還對細(xì) 胞核【1 3 】、細(xì)胞器【1 4 1 等進(jìn)行了定點的d n a 注射。 e 基因槍法 基因槍法又被稱為高速微彈法或微彈轟擊法，一般是用鎢或金微粒( 直徑1 - 2 # m ) 包裹外源d n a ，接著用一定的方法加速這種微粒，從而穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使外 源d n a 能進(jìn)入到植物細(xì)胞中?；驑尫ㄊ紫仁莍 掃s e k im 【1 5 】等用于研究擬南芥組織細(xì)胞 的瞬時表達(dá)系統(tǒng)，后來又有人用于玉米【1 6 1 、水稻【1 7 1 、大豆【1 8 】和小麥i 1 9 】等一些標(biāo)記基因 的表達(dá)，以便為研究外源基因在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)提供參考的數(shù)據(jù)?；驑屴D(zhuǎn)化效 率的主要影響因索有：微粒的大小、微粒的加速程度、外源d n a 的量、微粒與外源基因 結(jié)合程度、受體細(xì)胞的生理狀態(tài)等等。 f 花粉管通道法 k o n s t a n t i n o v t 2 0 1 首先應(yīng)用這種方法將外源d n a 導(dǎo)入植物的技術(shù)。在授粉后向子房注 射含有外源目的基因的d n a 溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將 外源d n a 導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā) 育而成為攜帶有外源基因的新個體?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ膬?yōu)點是操作方便，而且能馬上得到 種子，在時間上比較節(jié)省，而且不需要專門的儀器和昂貴的藥品：但其缺點是工作量相 3 第一章前言 對巨大【2 。 1 1 1 2 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用、展望 隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越受到人們的重視和利用。選定帶有特殊作 用的外源基因轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞內(nèi)，使得植物獲得某種特性，最終達(dá)到增加產(chǎn)量、改良 種系和生產(chǎn)外源蛋白等。為人類認(rèn)識和利用自然，并為我所用作出了重要貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)基因 植物的主要有以下幾個應(yīng)用方面： 1 ) 抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物 將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，能有效地防治田間雜草。目前從植物和微生物中己克 隆出多種抗除草劑基因，如抗除草劑甘瞵的a r o a 基因【2 2 】和水解溴苯腈的b x n 基因【2 3 1 等。 2 ) 抗病毒轉(zhuǎn)基因植物 通過導(dǎo)入植物病毒的外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶的基因、核糖體失活蛋白基因和干 擾素基因等，使植物獲得或者提高抗病毒能力。已經(jīng)利用煙草花葉病毒( t m v ) 2 4 】、苜 ?；ㄈ~病毒( a i m v ) 2 5 l 、大豆花葉病毒( s m v ) 1 2 6 】、馬鈴薯x 和y 病毒( p v x 和p r y ) 2 7 , 2 8 】 等進(jìn)行試驗，使植物獲得了對相應(yīng)病毒的抗性?？共《巨D(zhuǎn)基因煙草已在進(jìn)行田間試驗， 且增產(chǎn)效果顯著，這對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)方面都有著重要的意義【2 9 1 。 3 ) 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 把抗蟲基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，由作物本身合成殺蟲劑，從而獲得抗蟲性?？瓜x基因有很 多的來源。來源于微生物蘇云金芽孢桿菌( b t ) 的基因被廣泛的應(yīng)用1 3 0 , 3 1 l ，可以產(chǎn)生一 種6 一內(nèi)毒素，它可進(jìn)入害蟲腸道后導(dǎo)致孔洞，進(jìn)而導(dǎo)致害蟲腸道受損，停止進(jìn)食直至死 亡。來源于植物本身，主要包括蛋白酶抑制劑基因，例如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因( c p t i ) 【3 2 ，3 3 】；淀粉酶抑制劑基因，例如菜豆駱淀粉酶抑制劑基因( a a i p v ) 3 4 】：植物外源凝 集素基因，雪花蓮?fù)庠茨鼗? g n a ) 【3 5 】等。來源于動物的抗蟲基因包括蛋白酶抑 制劑基因，如牛胰腺胰蛋白酶抑制劑( b p t i ) 3 6 1 、脾抑制劑( s i ) 【3 7 1 、o a - 抗胰蛋白酶 ( 一a t ) 1 3 8 】、幾丁質(zhì)酶基因【3 9 】和神經(jīng)毒素基因【刪等。 4 ) 抗逆境轉(zhuǎn)基因植物 向植物導(dǎo)入一些與脅迫抗性有關(guān)的基因可以提高植物的脅迫耐受能力。例如在水稻 中過量表達(dá)大麥的l e a 蛋白h v a i 時，轉(zhuǎn)基因水稻種子苗和成熟植物對鹽和干旱的抗性 均得到增強(qiáng)【4 。在煙草中過量表達(dá)大腸桿菌g r 基因，其葉片中g(shù) r 的含量水平將提高3 倍，對百草枯和s o ：的耐受力得到明顯增強(qiáng)【4 2 1 。將煙草線粒體m n s o d 基因轉(zhuǎn)移到苜蓿中， 苜蓿獲得了對冰凍和干旱脅迫的耐性增加【4 3 1 。 4 西北大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 ) 醫(yī)藥領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因植物 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，利用植物生產(chǎn)細(xì)胞因子、抗體、疫苗和酶等藥物蛋白 已經(jīng)成為可能，出現(xiàn)了大量的植物反應(yīng)器。利用植物反應(yīng)器，一般表達(dá)的藥物蛋白都具 有很高的應(yīng)用價值。例如將人的溶菌酶基因用水稻谷蛋白g t - 1 啟動子調(diào)控，并連接轉(zhuǎn) 運肽序列，得到能夠表達(dá)溶菌酶的轉(zhuǎn)基因水稻。用其作為食品的添加劑，能夠減少腹瀉 或上呼吸道感染的機(jī)會【刪。 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以優(yōu)化植物的農(nóng)藝性狀，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。但是，關(guān)于植物 轉(zhuǎn)基因研究中還存有一些潛在的問題，例如：食品安全性問題、一些病蟲的抗性問題、 環(huán)境生態(tài)平衡問題等等。此外，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面也存在一些問題：外源基因尚未能定 點、定量導(dǎo)入受體細(xì)胞基因組中，并獲得穩(wěn)定、高效的表達(dá)和遺傳，但卻又不影響受體 生物本身優(yōu)良性狀的表達(dá)。隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也將會更加的 完善，產(chǎn)生的作用也將會是越來越重要。 1 1 2 轉(zhuǎn)基因植株變異及其原因 j 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良作物品種時，理想的結(jié)果是只將目標(biāo)性狀導(dǎo)入受體植物， 實現(xiàn)作物的定向改良。外源基因的導(dǎo)入會使植株獲得新的特性，但隨著其插入目標(biāo)植物 基因組中，也將導(dǎo)致染色體上插入位點處的基因發(fā)生缺失而產(chǎn)生突變體【4 5 1 。 植株變異產(chǎn)生的原因是受多方面的因素所影響的。例如，基因的轉(zhuǎn)化方法、組織培 養(yǎng)體系的篩選、再生組織的擴(kuò)繁和繼代等。此外，在很大程度上，變異是由外源基因的 導(dǎo)入而引起的。目前，比較認(rèn)可的原因被概括如下： 1 ) 外源基因本身特性及其表達(dá) 為了增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，提高其表達(dá)的穩(wěn)定性，科學(xué)家們先后設(shè)計出了一系列的 策略和載體，包括強(qiáng)啟動子、修改植物偏好密碼子1 等等。然而，當(dāng)外源基因與受體植 物基因存在較高的序列同源性時，則會導(dǎo)致內(nèi)、外源基因表達(dá)同時受到抑制，即產(chǎn)生共 抑制現(xiàn)象【4 7 1 。因此，在轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建時，要注意以下幾個方面的問題：避免使用與內(nèi) 源基因同源的序列，盡量保持與內(nèi)源基因在序列上的多樣性；避免使用重復(fù)序列或基因 組片段，以防被甲基化酶識別：避免使用相同的啟動子，應(yīng)該從同一方向開始閱讀以免 形成異常或反義r n a 。 2 ) 外源基因的位置效應(yīng) 外源基因的表達(dá)受到插入位點及其周圍序列的影響，這就是所說的位置效應(yīng)?，F(xiàn)在 普遍認(rèn)為外源載體轉(zhuǎn)基因到宿主染色體內(nèi)，其整合位點是隨機(jī)的，外源基因可以插入到 與 第一章前言 植物基因組的任何一條染色體的任何位點上，但是往往對轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域具有優(yōu)先插入 的特性【4 8 1 。外源基因在植物基因組中插入情況大致有三種：當(dāng)外源基因插入到轉(zhuǎn)錄活躍 區(qū)域中時，外源基因就會順應(yīng)該區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其可以高水平的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；當(dāng) 外源基因插入到轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū)域的異染色質(zhì)區(qū)中時，它只能進(jìn)行低水平轉(zhuǎn)錄或發(fā)生基因 沉默；當(dāng)外源基因插入到內(nèi)含子中時，它會在轉(zhuǎn)錄后的剪接過程中將被剪接掉，最終得 不到表達(dá)【4 9 1 。 此外，隨著外源基因的插入，使得受體植物的染色質(zhì)上原有基因序列發(fā)生變化，進(jìn) 而引起染色質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)變化。此時，外源基因的序列也可能將隨之發(fā)生改變， 從而使得其表達(dá)在一定程度上偏離原先的模式，或者使外源基因和內(nèi)源基因的表達(dá)都受 到一定影響，甚至都出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。 3 ) 受體細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng) 植物擁有著自己的一套防御及表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，這個系統(tǒng)對外源基因或物質(zhì)的進(jìn)入有 著識別、抵御和修復(fù)功能。因此，當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入道受體細(xì)胞中時，可能被受體植物的 基因組調(diào)節(jié)系統(tǒng)所識別，從而被基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)修飾或視為異己加以剔除【矧。植物基 因組的防御體系基本包括兩個：在外源基因整合插入前，復(fù)制修復(fù)系統(tǒng)的各種酶類物質(zhì)， 將對其進(jìn)行作用，使之出現(xiàn)斷裂、降解、重排等，進(jìn)而發(fā)生序列的改變f 5 l 】；在外源基因 整合插入后，其也會在植物的有性傳遞過程中出現(xiàn)重排或丟失【5 2 】。另外，甲基化也是植 物細(xì)胞中一種對外源基因常見的沉默原因【5 3 】。 4 ) 環(huán)境因素 環(huán)境對于植物生長和發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。與動物相比，植物的基因調(diào)控和表 達(dá)對環(huán)境有高度依賴性，其中，光照、溫度、水份、土壤肥力和外源激素等是主要的環(huán) 境因素。在一定環(huán)境條件下，基因的表達(dá)一般是由光控因子、熱休克元件、順式作用元 件和反式作用因子以及其它因子共同協(xié)同作用的結(jié)果【5 4 1 。然而，從植物感受環(huán)境信號到 基因表達(dá)調(diào)控，這中間仍存在著很多不問題，其機(jī)制尚不清楚。 1 2 流式細(xì)胞技術(shù)研究應(yīng)用進(jìn)展 1 2 1 流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，集電子、計算機(jī)、激光、流體理論于體， 被譽(yù)為試驗室的“c t 。 1 2 1 1 流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu) 6 西北大學(xué)碩士學(xué)位論文 流式細(xì)胞儀一般由三部分構(gòu)成：1 ) 傳感系統(tǒng)，包括樣本遞送系統(tǒng)、樣品池、檢測 系統(tǒng)、電子傳感器和激光源等；2 ) 計算機(jī)系統(tǒng)；3 ) 電路、光路和水路系統(tǒng)，包括電源、 光學(xué)傳導(dǎo)和濾片、鞘液循環(huán)和回收部分等。 1 2 1 2 流式細(xì)胞儀的基本工作原理 將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞 的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣， 鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行 排列，依次通過檢測區(qū)域。 流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上， 被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向 光電二極管和9 0 0 方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信 號基本上反映了細(xì)胞體積的大??；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。 y 這些熒光信號的強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光 電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過a d 轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計 算機(jī)識別的數(shù)字信號。計算機(jī)把所測量到的各種信號進(jìn)行計算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示 在計算機(jī)屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查 詢或進(jìn)一步分析。 。 檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形 式表達(dá)，其x 軸為測量強(qiáng)度，y 軸為細(xì)胞數(shù)目。一般來說，流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率 有5 1 2 或1 0 2 4 通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)， 既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三 維立體視圖。 細(xì)胞的分選是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超 高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細(xì)胞就分散在這些 液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在 高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器， 從而實現(xiàn)細(xì)胞的分離。 1 2 2 流式細(xì)胞技術(shù) 7 第一章前言 流式細(xì)胞術(shù)( f l o wc y t o m e t r y , f c m ) 是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子 進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測 得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，成為當(dāng) 代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)嘲。 1 2 2 1 樣本制備的基本原則 樣本制備的基本原則：1 ) 使用的各種液體和懸浮細(xì)胞樣本需為新鮮制備，盡快完 成樣本制備和檢測；2 ) 針對不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或e d t a 處理，以清 除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；3 ) 對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián) 用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；4 ) 對石蠟包埋 組織應(yīng)先切成若干4 0 5 0 u m 厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞 懸液；5 ) 單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于1 0 4 個。 1 2 2 2 植物樣品細(xì)胞核懸液的制備 表1 是5 種常用的植物細(xì)胞核提取液的化學(xué)組成，細(xì)胞核染色質(zhì)在含有鎂離子的溶 液【5 硒8 1 和含有精胺的多胺緩沖液【5 9 】中可以保持穩(wěn)定。在m a r i e 的分離緩沖液中，葡萄糖 的存在可以保持細(xì)胞核的完整性，并且防止核的凝聚【鯽。e d t a 可以結(jié)合二價陽離子， 被作為核酸酶輔助因子使用。檸檬酸鈉作為一種溫和的鰲合劑在很多緩沖液中被大量使 用，而無機(jī)鹽則用來保證溶液達(dá)到一定的離子強(qiáng)度。這些緩沖液的p h 值一般都在7 0 8 0 之間，這與常用的d n a 熒光染料相同。兩種非離子去污劑：t r i t o nx 1 0 0 和t w e e n2 0 ， 被用來將細(xì)胞核從細(xì)胞質(zhì)中分離出來，去除殘留在核表面的細(xì)胞質(zhì)殘片。伊巰基乙醇被 用來保護(hù)染色質(zhì)蛋白，并消除酚類化合物對d n a 染色的干擾作用。由于伊巰基乙醇對 人體有很大的傷害，現(xiàn)在多用p v p 或偏重亞硫酸鉀代替【6 l 】。 1 2 2 3 應(yīng)用范圍 流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用：1 ) 測定細(xì)胞內(nèi)d n a 的變異系數(shù)【6 2 1 ，此方法的準(zhǔn)確性很高， 變異系數(shù)最小，一般在2 以下；2 ) 能準(zhǔn)確地進(jìn)行d n a 倍體分析【6 3 l ；3 ) 借助于熒光 染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)“1 和核酸的定量研究【6 5 】；4 ) 快速進(jìn)行細(xì)胞分選1 6 6 1 和細(xì)胞收集6 7 】； 5 ) 醫(yī)學(xué)應(yīng)用及相關(guān)研究：疾病診斷【鯽，免疫功能研列6 9 1 ，癌癥病人的多藥耐藥性【7 們 7 h ， 細(xì)胞功能及代謝動力學(xué)研究【7 2 1 ，血小板分析( 心血管疾病) 7 3 1 等；6 ) 細(xì)胞生物學(xué)和分 子生物學(xué)研究【7 4 1 。 3 西北大學(xué)碩上學(xué)位論文 表1 常用細(xì)胞核提取緩沖液 t a b 1t h em o s tp o p u l a rb u f f e r su s e df o rp r e p a r a t i o no fn u c l e i 緩沖液名稱 g a l b r a i t h b u f f e r c 5 5 1 組成 4 5 r a mm g c l 2 ，3 0 m ms o d i u mc i t r a t e ，2 0 m mm o p s ，0 1 t r i t o nx 1 0 0 5 0 r a mg l u c o s e ，15 m mk c l ，15 r a mn a c l ，5 m mn a 2 e d t a ，5 0 m ms o d i u mc i t r a t e ， m a r i eb u 婦f e 一1 0 5 t w e e n2 0 ，5 0 m mh e p e s ，0 5 b - m e r c a p t o e t h a n n o l 2 0 0 m mt r i s ，4 m mm g c l 2 6 h 2 0 ，o 5 t r i t o nx - 10 0 b u 丘“5 6 】 a r u m u g a n a t h a n 9 5 3 m mm g s 0 4 7 h 2 0 ，4 7 6 7 m mk c i ，4 7 7 m mh e p e s ，6 4 8 m md t r , 0 2 5 b u f f e i l 5 7 1t r i t o nx 一1 0 0 i5 m mt r i s ，2 m mn a 2 e d t a ，o 5 m ms p e r m i n e 4 h c i ，8 0 m mk c l ，2 0 m mn a c i ， l b 0 1b u f f e r t ”j 1 2 - 3 展望 流式細(xì)胞儀從細(xì)胞技術(shù)的提出發(fā)展至今，6 0 至7 0 年代是其飛速發(fā)展時期，激光技 術(shù)、噴射技術(shù)以及計算機(jī)的應(yīng)用構(gòu)成了流式細(xì)胞儀在原理和結(jié)構(gòu)上形成了特有的、固定 的模式。在隨后的時間里，流式細(xì)胞儀開始逐漸的商品化，這期間不斷有新型號的儀 器推出，在多參數(shù)檢測技術(shù)上得以不斷地提高和完善。 進(jìn)入9 0 年代，隨著微電子技術(shù)特別是計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的功能也越 來越強(qiáng)大，出現(xiàn)了很多新的設(shè)備，例如全反射熒光流式細(xì)胞儀【7 5 】，此外在數(shù)據(jù)管理、數(shù) 據(jù)分析方面有了長足進(jìn)步。然而，在技術(shù)原理和設(shè)計方面一直沒有突破性的進(jìn)展。人們 將更多的注意力開始投向流式細(xì)胞儀的各種應(yīng)用，不斷提出新的熒光探針、新的熒光染 料、新的染色方法等等，使流式細(xì)胞技術(shù)在新的細(xì)胞參數(shù)指標(biāo)分析方面日益發(fā)展。在分 析軟件上，設(shè)計出了更多的、操作簡便的、功能強(qiáng)大的應(yīng)用分析軟件和圖形編輯軟件， 全面的提高隊數(shù)據(jù)自動分析能力。 1 3 雙向電泳技術(shù)的研究應(yīng)用進(jìn)展 1 3 1 蛋白質(zhì)組學(xué) 9 第一章前言 蛋白質(zhì)組( p r o t e o m e ) 指由一個基因組( g e n o m e ) 或一個細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋 白質(zhì)。這一概念的是澳大利亞m a c q u a r i e 大學(xué)的w i l k i n s 和w i l l i a m s 于1 9 9 4 年最先提出 的【7 6 j 。在翻譯轉(zhuǎn)錄時，一個基因可以以多種m r n a 形式進(jìn)行剪接，并且同一蛋白可能 以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾。所以一個蛋白質(zhì)組并不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白 質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。因此，蛋白質(zhì)組更為準(zhǔn)確的定義應(yīng)為 一種細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)組隨著組織發(fā)育、功能的建成和受環(huán) 境狀態(tài)的改變而改變。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式， 其內(nèi)容主要包括鑒定和分析蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、存在方式、修飾形式、結(jié)構(gòu)、功能及其 他們的相互作用等。 1 3 1 1 植物蛋白質(zhì)組學(xué) 近些年來，基因組學(xué)研究發(fā)展迅速，先后己經(jīng)完成了多種模式植物和重要農(nóng)作物基 因組的測序工作【7 7 1 。植物基因組學(xué)研究已經(jīng)轉(zhuǎn)入到功能基因組學(xué)的研究上面。目前已經(jīng) 提出了很多功能基因組學(xué)研究的新方法，例如e d n a 微陣列、d n a 芯片、基因表達(dá)系統(tǒng) 分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 和基因敲除( g e n ek n o c ko u t ) ，它們都 能夠有效分析和鑒定大量基因的表達(dá)模式和功能類型。然而基因的功能最終是以蛋白質(zhì) 的形式表現(xiàn)出來的，每種蛋白質(zhì)都有其特有的存在和活動規(guī)律，因此在轉(zhuǎn)錄水平上獲得 的基因表達(dá)的信息并不足以揭示其在細(xì)胞內(nèi)的確切功能，這就需要直接分析蛋白質(zhì)的表 達(dá)模式和功能模式。蛋白質(zhì)組學(xué)即成為了現(xiàn)今生物學(xué)界的新的研究熱點。植物蛋白質(zhì)組 學(xué)是在植物基因組學(xué)的研究成果基礎(chǔ)上，利用高通量的蛋白質(zhì)分析技術(shù)和鑒定技術(shù)，對 植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究的- - f - i 新興學(xué)科。高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)包括雙向電泳技 術(shù)( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和酵母雙雜 交技術(shù)，這些技術(shù)促進(jìn)了植物蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。目前，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究已由植物 類群、組織、器官和細(xì)胞水平深入至亞細(xì)胞水平【7 引，一些重要的細(xì)胞器，如葉綠體、線 粒體等蛋白質(zhì)組已被分析和鑒定，已發(fā)現(xiàn)了許多新的葉綠體和線粒體蛋白質(zhì)【7 9 8 1 】。 1 3 1 2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)大致包括一下三大技術(shù)：1 ) 蛋白質(zhì)分離技術(shù)：2 ) 鑒定技術(shù)( 如生 物質(zhì)譜技術(shù)) ；3 ) 蛋白匹配數(shù)據(jù)庫分析技術(shù)。 該技術(shù)的過程流程基本為：蛋白樣品制備一2 d e 電泳一圖像采集、比對和分析一凝 膠切點一胰蛋白酶( t r y p s i n ) 等消化一提取肽混合物- - m a l d i t o f m s 質(zhì)譜技術(shù)分析 一獲得肽質(zhì)量指紋( p m f ) 一在m a s c o t 等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配一獲得鑒定蛋白質(zhì)一 l o 西北大學(xué)碩士學(xué)位論文 對蛋白進(jìn)行功能驗證。 1 3 。2 雙向電泳技術(shù) 1 9 7 5 年o f a r r e l 等首次提出雙向電泳技術(shù)【8 2 】，其方法可以在同一塊凝膠上同時分離數(shù) 千種蛋白，因此在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一直處于核心地位。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，雙 向電泳技術(shù)與之的結(jié)合使用，滿足了準(zhǔn)確、快速、高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求8 3 , 9 4 】。 目前，雙向電泳系統(tǒng)大都使用的是第一向為等電聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) ， 第二向為s d s 聚丙烯酰胺凝膠電泳( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s d s p a g e ) 的二維電泳體系。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量水平上的兩次分離后，蛋白可以以點的形態(tài)展現(xiàn) 出來。根據(jù)c a r t e s i n 坐標(biāo)系統(tǒng)，從左到右是等電點的增加，從下到上是分子量的增加。 該技術(shù)的基本流程如下： 1 ) 樣品制各 樣品制備的好壞對雙向電泳的最終結(jié)果來說是至關(guān)重要的。它的主要目標(biāo)是去除 鹽、脂類、多糖和核酸等干擾物質(zhì)，盡可能提取組織或細(xì)胞內(nèi)所有蛋白，同時防止蛋白 發(fā)生化學(xué)修飾或降解，保證蛋白的完整性。其主要步驟包括細(xì)胞破碎、干擾物去除、蛋 白提取及復(fù)溶。在這整個過程中，蛋白的提取和復(fù)溶是關(guān)鍵步驟，其中涉及到裂解液的 選擇和嚴(yán)謹(jǐn)度的高低。針對不同樣品和實驗?zāi)康膽?yīng)選用適當(dāng)?shù)牧呀庖汉蛧?yán)謹(jǐn)度。嚴(yán)謹(jǐn)度 越高，樣品中的干擾物就越少，樣品更為純化，但同時會損失部分蛋白，丟失蛋白差異 信息。 目前，在雙向電泳中所用的裂解液一般包括中性促溶劑( 尿素，硫脲) 、非離子去 污劑( n p 4 0 ，t r i t o nx - 1 0 0 ) 或兼性離子去污劑( c l a j p s ) 、還原劑( d t t ，d t e ，t b p ) 、 載體兩性電解質(zhì)或i p g 緩沖液等。 植物組織中一般含有大量的色素、酚類、核酸及次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)都嚴(yán)重影 響雙向電泳分辨效果。v a l c u 等人【8 5 l 設(shè)計出了一種適合溶解分離木本植物的蛋白裂解 液，并且發(fā)現(xiàn)尿素與硫脲組合的溶解效果不因樣品類型的改變而改變，去污劑組合的溶 解效果卻因樣品類型的改變而改變。g o m e z 等人在實驗中建立了一套適用于椰棗樹葉 片中提取全蛋白的提取液體系。m a l d o m a d o 8 7 】等人比較了三種不同的蛋白提取裂解液， 在蛋白產(chǎn)率上沒有顯著的差別，提取的蛋白大多存在p h5 - 8 和1 4 8 0 k d a 范圍之內(nèi)，t c a 丙酮酚法對蛋白點的聚焦、強(qiáng)度、重現(xiàn)性有較好的結(jié)果。s a r m a1 8 8 1 等人系統(tǒng)地研究了提 高雙向電泳的分辨率的植物蛋白分離提取和穩(wěn)定性的問題，提出將d t t 用于所用的溶 液中，采用含用大量d t t 的高濃度去污劑和交性劑的混合提取液可以提高蛋白的復(fù)溶 1 1 第一章前言 效果，并增強(qiáng)樣品蛋白液的穩(wěn)定性。這些裂解液適合多種組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制 備，但是對具體樣品有時也需要做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。 2 ) i e f 等電聚焦是目前最常用的第一向分離技術(shù)。該技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同而將 它們分開，因此p h 值梯度的維持對其是相當(dāng)重要的。 在最早的等電聚焦中，是通過兩性電解質(zhì)在聚丙烯酰胺管膠內(nèi)產(chǎn)生的p h 梯度將蛋 白質(zhì)分離【8 9 1 。然而這種方法存在著很多的缺點：1 ) 重復(fù)性差：2 ) p h 梯度不穩(wěn)定：3 ) 管膠機(jī)械強(qiáng)度低。g 6 r g 等人【則是首先使固相膠條進(jìn)行等電聚焦電泳。固相膠條發(fā)展至 今，已經(jīng)具有不同p h 范圍、不同線性關(guān)系、不同長度，而且完全商品化。近些年來， 極窄p h 范圍的重疊固相膠條及堿性p h 范圍膠條的出現(xiàn)，進(jìn)一步提高了低豐度蛋白和 疏水蛋白的分辨率，對蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了新的研究平臺。 樣品的上樣量和聚焦程序的選擇是等電聚焦的兩個核心內(nèi)容，需根據(jù)不同樣品特 性、i p g 膠條的p h 范圍和長度、凝膠染色的方法等因素進(jìn)行優(yōu)化選擇。 3 ) 膠條平衡 目前，比較常用的是兩次平衡，分別在平衡緩沖液中加入d t t 和碘乙酰胺。第一 次平衡加入d t t 的作用是打開二硫鍵，保持蛋白還原狀態(tài)，使之能與s d s 充分結(jié)合； 第二次平衡加入碘乙酰胺是為了去除多余的d t t ，保證第二向電泳結(jié)果的穩(wěn)定性。 4 ) s d s p a g e s d s p a g e 一般分為水平式及垂直式兩種類型，兩者各有特色【9 l 】。凝膠的制備也分 為均一膠和梯度膠兩種模式。s d s p a g e 膠濃度的選擇，需根據(jù)樣品性質(zhì)和實驗?zāi)康亩?定，最常用的是分辨范圍在1 5 6 0 k d a 的1 2 t 均一膠。均一膠的優(yōu)點是灌膠方便，重 復(fù)性好；缺點是蛋白點較為集中，分辨率不高。常用的緩沖系統(tǒng)是l a e m m l i 的t r i s g l y c i n e 不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)【9 2 】。針對于低分子量蛋白( 小于1 5 k d a ) 一般采用t r i s t r i c i n e 緩沖液 系統(tǒng)，糖蛋白則采用硼酸鹽。 4 ) 圖像獲得和掃描分析 凝膠染色的目的是把所分離的蛋白可視化，目前常用蛋白染色方法有靠馬斯亮藍(lán)法、 銀染法、熒光標(biāo)記染色法和負(fù)染法等，它們在操作性、靈敏度、兼容性及定量分析等方 面各有特劇9 3 1 。 5 ) 蛋白檢測與鑒定 關(guān)于蛋白質(zhì)的鑒定，現(xiàn)比較常用的方法有h p l c m s 、l c e s i - m s 和m a l d i - t o f - m s ， 1 2 謠北大學(xué)頂i ：學(xué)位論文 它們在操作系統(tǒng)、處理模式、鑒定能力上各有特點【9 4 1 ，應(yīng)根據(jù)具體的實驗?zāi)康倪x定，或 者選取同時多種方法。 1 3 3 雙向電泳技術(shù)在植物蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用 差異蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一個研究策略，它的主要目標(biāo)是研究各種因素引 起的蛋白質(zhì)組成或者含量變化，以發(fā)現(xiàn)具有差異的蛋白質(zhì)，通過對這些差異蛋白進(jìn)行深 入研究，探究影響因素和蛋白質(zhì)變化的機(jī)理。目前，差異蛋白質(zhì)組學(xué)作為專門的技術(shù)體 系廣泛應(yīng)用于植物生理、植物組織器官和亞細(xì)胞、植物突變體、植物遺傳多樣性等多方 面研究。雙向電泳技術(shù)則為差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)。 在植物生理應(yīng)答機(jī)制的研究中，以雙向電泳技術(shù)為核心的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究被大 量應(yīng)用。植物在受到外界環(huán)境中的許多因子作用時，會引起植物體內(nèi)大量的蛋白質(zhì)在表 達(dá)種類和數(shù)量上發(fā)生變化，研究這些差異蛋白質(zhì)可以使我們更好地了解植物對環(huán)境的信 號應(yīng)答和適應(yīng)機(jī)制等。x u 等人【9 5 】利用紫外線照射大豆，發(fā)現(xiàn)其葉片中黃酮含量出現(xiàn)明 顯變化，因此，他們利用雙向電泳技術(shù)分別分析了經(jīng)過和不經(jīng)過紫外照射的大豆葉片蛋 白，鑒定出了6 7 個變化顯著的蛋白質(zhì)，它們分別參與了包括疾病防御、能量代謝、蛋白 合成、轉(zhuǎn)錄和次級代謝等很多生物過程，為研究黃酮在保護(hù)植物葉片抵御紫外線傷害機(jī) 制方面提供了大量的資料基礎(chǔ)。n e i l a 等人【9 6 l 利用雙向電泳技術(shù)研究了鹽脅迫下一種葡萄 品種( t u n i s i a n ) 的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物經(jīng)過濃度為1 0 0 m m o l l 的n a c l 處理1 5 天后，共檢測和鑒定了9 個下調(diào)蛋白，3 2 個上調(diào)蛋白和7 個新蛋白。 此外，在植物轉(zhuǎn)基因突變研究中，應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對經(jīng)轉(zhuǎn)基因或基因敲除產(chǎn)生的 重組體與野生對照株進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并結(jié)合基因功能研究，可為轉(zhuǎn)基因突變 后的生理生化變化提供信息。r o c c o 等人【9 7 】在煙草植物中表達(dá)番茄p r o s y s t e m i n 基 ，煙 草獲得較高的抗病原體和氧化應(yīng)激作用，然后利用雙向電泳技術(shù)分析了煙草葉片的蛋白 質(zhì)組學(xué)，為利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析植物組織轉(zhuǎn)基因的表達(dá)機(jī)制提供資料。k o m a t s u 等人【9 8 】利用雙向電泳技術(shù)分析了突變型的水稻胚蛋白質(zhì)組，鑒定出明顯下調(diào)表達(dá)的7 種 胚蛋白，通過后續(xù)實驗