（預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）豬IFNγ基因的表達(dá)及抗體制備和雞Ii鏈功能的研究.pdf

摘要一干擾素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是一類(lèi)具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用的細(xì)胞因子，能增強(qiáng)細(xì)胞毒性t 細(xì)胞功能、促進(jìn)b 細(xì)胞分化、m h ci 和、m h ci i 類(lèi)分子的表達(dá)以及活化巨噬細(xì)胞。為研究豬丫干擾素( p o i f n q , ) 的生物學(xué)活性及其在機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用機(jī)理，本研究進(jìn)行了該基因的克隆、表達(dá)和多克隆抗體的制備。首先，應(yīng)用r t - p c r 方法通過(guò)一對(duì)自行設(shè)計(jì)的引物從豬脾臟淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增了豬丫干擾素基因片段，經(jīng)單酶切鑒定，與g e n b a n k 中登錄的豬i f n 一丫基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。p c r 產(chǎn)物分離純化后連接到p g e x 4 t - 1 和p e t - 3 2 a 載體，經(jīng)菌液p c r篩選出陽(yáng)性重組克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明，克隆獲得的蜊吖基因全長(zhǎng)為5 1 6 個(gè)堿基，o r f 為5 0 1 個(gè)堿基，編碼1 6 6 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為1 7 k d 。此基因與g e n b a n k 上發(fā)表的豬i f n 吖基因的核苷酸同源性為1 0 0 ，并且在氨基酸水平上也完全一致。其次，將重組質(zhì)粒p g e x p o l f n - y 和p e t - p o i f n q , 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌b l 21 ，經(jīng)i p t g誘導(dǎo)，得到高效表達(dá)。所表達(dá)的融合蛋白主要是以不溶性的包涵體形式存在，分子量約4 3 0 k d 和3 5 0 k d ，與理論推算值相符。通過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒p g e x p o i f n q , 和p e t - p o i f n - ) , 的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度后，對(duì)含有p g e x p o l f n - 丫和p e t - p o l f n 吖質(zhì)粒的b l 2 1 菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了較高濃度的g s t - i f n 吖和h i s i f n - 丫包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性g s t - i f n - y 和h i s i f n - 3 , 原核融合表達(dá)蛋白。最后，利用上述純化的g s t - i f n 吖融合蛋白作為抗原免疫小鼠制備鼠抗豬i f n 吖多克隆抗體。在對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行復(fù)性和親和層析純化之后，用其免疫小鼠，制備了針對(duì)該蛋白的鼠多克隆抗體。e l i s a 和w e s t e r nb l o t t i n g 結(jié)果說(shuō)明g s t - i f n - 丫融合蛋白可誘導(dǎo)出針對(duì)p o l f n 吖蛋白的特異性抗體。綜上所述，本研究成功地克隆了豬i f n 謹(jǐn)因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行了原核蛋白的表達(dá)并制備出了針對(duì)p o i f n 吖蛋白的特異性抗體，為進(jìn)一步研究豬i f n 饈組蛋白的免疫學(xué)特性和生物學(xué)活性及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬1 ，干擾素，克隆，原核表達(dá)，抗原性摘要二恒定鏈( i n v a r i a n tc h a i n ，l i ) 是m h ci i 類(lèi)分子的伴侶蛋白，主要存在于人、哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)的體細(xì)胞表面，如b 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞等。人類(lèi)和小鼠的i i 基因都是單拷貝基因，其m r n a 都能夠以不同的拼接模式產(chǎn)生不同形式的i i 鏈異構(gòu)體。i i 鏈可以輔助m h ci i 類(lèi)分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行正確折疊并遷移出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；提供m h c i i 類(lèi)分子進(jìn)入內(nèi)體溶酶體的靶信號(hào)；阻止m h c i i 類(lèi)分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)源性抗原結(jié)合。m i - i c i i - i i 復(fù)合體的內(nèi)體分選信號(hào)已被證明為i i 鏈胞漿尾部的兩個(gè)獨(dú)立的亮氨酸基元，即i i 鏈胞漿尾部的l e u7 i l e8 和p r o1 5 m e t1 6 l e u1 7 。雞i i 鏈及其異構(gòu)體胞漿尾部也含有l(wèi) e u8 i l e9 和g l y1 6 v a l1 7 l e u18 兩個(gè)基元。為研究雞恒定鏈p 3 1 基因的該基元是否具有內(nèi)體定位功能，我們用兩對(duì)引物通過(guò)p c r 從p m d l 8 - t i ip 3 1 質(zhì)粒中擴(kuò)增出雞的p 3 1 基因，將該基因分別插入真核表達(dá)載體p e g f p n 1 和p e g f p c i 中，構(gòu)建成p e g f p n 1 一p 3 1 和p e g f p c 1 p 3 1 質(zhì)粒。將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染h e k2 9 3 細(xì)胞，經(jīng)4 8 h 培養(yǎng)后用熒光顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒p e g f p n 1 p 3 1 和p e g f p c 1 p 3 1 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光主要出現(xiàn)在胞漿區(qū)的細(xì)胞器內(nèi)，而由p e g f p 對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中綠色熒光則主要分布在胞核。這說(shuō)明雞i ip 3 1 分子具有內(nèi)體定位的作用。應(yīng)用大引物p c r 突變法，將雞i i 鏈的第8 位和第1 8 位的l e u 分別突變?yōu)閍 l a后，突變體的g f p 都仍能定位于內(nèi)體。進(jìn)一步將雞i i 鏈的第8 位和第1 8 位的l e u均突變?yōu)閍 l a 后，雞鏈的內(nèi)體定位功能消失，這表明雞i i 鏈胞漿區(qū)存在l e u8 i l e9和g l y1 6 v a l1 7 l e u1 8 兩個(gè)獨(dú)立的內(nèi)體分選信號(hào)。關(guān)鍵詞：恒定鏈，內(nèi)體定位功能va b s t r a c tii n t e r f e r o n ( n ) i sak i n do fc y t o k i n e st h a th a v ee f f e c to na n t i v i r u sa n di m m u n es y s t e m nc a l le x e r ta n t i v i r a la c t i v i t ya n dan u m b e ro fi m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t ss u c ha se n h a n c e m e n to ftc e l lm e d i a t e dc y t o t o x i c i t y , bc e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，m h cia n dm h ci ie x p r e s s i o n ，a n dm a e r o p h a g ea c t i v a t i o n i no r d e rt or e s e a r c ht h eb i o l o g i c a lf u n c t i o na n dt h em e c h a n i s mo ft h ep o r c i n ei n t e r f e r o n - g a m m a ( p o i f n - 丫) i ni m m u n er e s p o n s e ，i np r e s e n ts t u d yt h i sg e n ew a sc l o n e d ，e x p r e s s e da n dg e n e r a t e dm i c ea n t i - p o r c i n e n 吖m u l t i - a n t i b o d y f i r s t l y , p o l f n 吖g e n ew a sa m p l i f i e df r o ms p l e e nl y m p h o c y t e sb yr t - p c rw i map a i ro fd e s i g n e dp r i m e r si nt h i se x p e r i m e n t t h er e s u l to fe n d o n u c l e a s et a qid i g e s t i n gr t - p c rp r o d u c t ss h o w e dt h a tt h eg e n ef r a g m e n th a st h es a m er e s t r i c t i o ne n z y m es i t ea sk n o w np o i f n 吖t h ep c rp r o d u c t sw a sc l o n e di n t op g e x 4 t - 1a n dp e t - 3 2 a ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si d e n t i f i e db yp c ra n de n d o n u c l e a s ee c o ri + s a lid i g e s t i o n t h es e q u e n cr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n eo fp o i f n 吖c o n s i s t e do f516n u c l e o t i d e s t h e0 r fw a sc o n s i s t e do f 5 0 1n u c l e o t i d e s ，e n c o d i n g1 6 6a m i n oa c i d s ，m o l e c u l a rw e i g h to f t h ep r o t e i ni sa b o u t17 k d 1 1 1 en u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h et a r g e tg e n eh a v e10 0 s i m i l a r i t yt ot h ec o r r e s p o n d i n gg e n ew h i c hp u b l i s h e di ng e n e b a n k s e c o n d l y , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g e x p o l f n 吖a n dp e t - p o l f n 吖w e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21s t r a i na n dh i g h l ye x p r e s s e db yi p t gt h ef u s i o np r o t e i ns o l u b i l i t yw a si d e n t i f i c a t e da n dt h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s e dp r o t e i nl o c a t e di ni n c l u s i o nb o d i e sa n dt h em o l e c u l a rw e i g h tw e r ea b o u t4 3 0a n d3 5 0k da sw ee x p e c t e d a f t e ro p t i m i z i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nc o n d i t i o n s ，w ed e t e r m i n e dt h eo p t i m u mi n d u c e m e n tt i m ea n dc o n c e n t r a t i o no fi s o p r o p y l t h i o p - d g a l a c t o s i d e ( i p t g ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g e x - p o l f n - q , a n dp e t - p o l f n 吖w a si n d u c e dt oe x p r e s sl a r g e - s c a l ef u s e dp r o t e i ng s t - i f n - 丫a n dh i s - n 吖，t h ei n d u c e dr e c o m b i n a n tb a c t e r i aw e r el y s e db yf r e e z e - t h a wa n ds o n i c a t i o n a tl a s t ，w eo b t a i n e dt h eg s t - 州a n dh i s 一n 吖i n c l u s i o nb o d yp r o t e i n ，w h i c hc o u l db es o l u b i l i z e db ys o n i c a t i o na f t e rt h ed e t e r g e n tl a u r o y l s a r c o s i n ew a sa d d e d f i n a l l y , m i c ew e r ei m m u n i z a t e dw i t ht h ep u r i f i e dg s t - i f n - 丫f u s i o np r o t e i n sa n dt h ep o l y c l o n a la n t i s e r u ma g a i n s tg s t - i f n 吖w e r ec o l l e c t e d as p e c i f i cr e a c t i o na p p e a r e db e t w e e nt h ea n t i b o d i e sa n dg s t - 叭a n dh i s - i f n - qf u s i o np r o t e i ni na g a rd i f f u s i o na s s a y ，e l i s aa n dw e s t e r nb l o t t i n g ，t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tg s t - i f n 吖f u s i o np r o t e i n sc a l li n d u c e da n t i b o d yw h i c hs p e c i f i c e df o rp o l f n 吖i i ii nc o n c l u s i o n ，i nt h ep r e s e n ts t u d yw ec l o n e da n de x p r e s s e dp o r c i n e n 吖g e n ei np r o k a r y o c y t ea n di n d u c e da n t i b o d yw h i c hs p e c i f i c e df o rp o l f n 吖s u c c e s s f u l l y a n dt h i sp r o v i d e st h ef u r t h e rr e s e a r c ho i li m m u n o l o g i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n di t sa m p l i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tp o i f n yp r o t e i n k e yw o r d s ：p o r c i n ei f n - ，c l o n i n g ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，a n t i g e n l e i t yi va b s t r a c ti ii n v a r i a n tc h a i n ( ) i sac h a p e r o n eo fm h ci im o l e c u l e ，w h i c hm a i n l ye x p r e s s e so nt h es u r f a c eo fbc e l l s ，m a c r o p h a g ec e l l s ，d e n d r i t i cc e l l sa n dt h y m i ce p i t h e l i a lc e l l se t c t h eb i o s y n t h e s i so fd i s t i n c tf o r m so ft h ei n v a r i a n tc h a i n ( 五) p r o t e i nf r o mau n i q u eg e n ea st h er e s u l to fd i f f e r e n t i a ls p l i c i n gp a t t e r n sh a sb e e no b s e r v e di nh u m a n sa n dm i c e i ic a l lf a c i l i t a t et h ep r o p e rf o l do ft h em h ci ih e t e r o d i m e r i ca n de g r e s sf r o mt h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m i tc a l lp r o v i d eat a r g e t i n gs i g n a lf o re n d o s o m a l l y s o s o m a lc o m p a r t m e n t sa n dp r e v e n t sp e p t i d ef r o ma s s o c i a t i n gp r e m a t u r e l yw i t hm h ci im o l e c u l e t h ee n d o s o m a ls o r t i n gs i g n a lf o rn e w l ys y n t h e s i z e da p c o m p l e x e sw e r ei d e n t i f i e da st w oi n d e p e n d e n tm o t i f sr e s i d u e sa tp o s i t i o n sl e u7 i l e8a n dp r o15 m e t16 l e u17i nt h ei ic y t o p l a s m i ct a i l t w os i m i l a rs i g n a l s ，l e u8 n e9a n dg l y16 v a l17 l e u18 ，w e r ef o u n di nt h ec y t o p l a s m i ct a i lo fc h i c k e ni ia n di t si s o f o r m s t or e s e a r c ht h ee n d o s o m a l 。s o r t i n gf u n c t i o na n di t sm e c h a n i s mo fc h i c k e n ，g e n ew a sa m p l i f i e df r o mp m d18 一t i i p 31b yp c ru s i n gt w op a i r so fp r i m e r s ，t h e nm e yw e r ei n s e r t e di n t op e g f p - n 1a n dp e g f p - c1 ，r e s p e c t i v e l yt of o r mt w or e c o m b i n a n tp l a s m i d s ，p e g f p - n 1 - p 31a n dp e g f p - c 1 - p 31 t h et w or e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f e c t e di n t oh u m a n2 9 3c e l l ss t r a i na n dt h ec e l l sw e r ec u l t i v a t e df o r4 8 h ，t h e no b s e r v e db yaf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e t h er e s u l t ss h o wt h a tab r i g h tg r e e nf l u o r e s c e n c ea p p e a r e di nt h ee n d o c y t i cc o m p a r t m e n t si nt h ec e l l st r a n s f e c t e dw i 廿lp e g f p - n 1 一p 31o rp e g f p c 1 一p 31 ，b u to n l yi nt h en u c l e a ri nt h ec o n t r o lc e l l st r a n s f e c t e dw i t l lp e g f p a l lt h e s es u g g e s tt h a tc h i c k e ni is h o w e dat a r g e t i n gf u n c t i o n w h e nm u t a t e dl e u 8o rl e u18t o 舢a(chǎn)o fc h i c k e ni i ，t h eg f pw a ss t i l ld e t e c t e di ni n t r a c e l l u l a rc o m p a r t m e n t s w h i l eb o t hl e u 8a n dl e u18w e r em u t a t e dt oa l a ，g f pw a sd i s t r i b u t e di nt h ec y t o p l a s m t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt w oi n d e p e n d e n te n d o s o m a ls o r t i n gs i g n a l ( l e u8 i l e9a n dg l y16 v a l17 l e u18 ) w e r ee x i s t e di nt h ec y t o p l a s m i ct a l lo fc h i c k e ni i k e yw o r d s ：i n v a r i a n tc h a i n ，t a r g e t i n gf u n c t i o nv i圖表目錄圖卜1p c r 擴(kuò)增產(chǎn)物及其單酶切鑒定結(jié)果1 5圖卜2p g e x p o i f n y 、p e t y 雙酶切鑒定結(jié)果1 6圖卜3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)1 7圖卜4 融合蛋白的可溶性鑒定與初步純化1 8圖卜5 不同誘導(dǎo)時(shí)f 司p g e x 一4 t i f n y 的表達(dá)量1 9圖卜6 圖2 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白( b s a ) 曲線及其方程式2 0表卜l 鼠抗g s t e f n y 抗體的e l i s a 檢測(cè)結(jié)果2 l圖卜7 鼠抗豬i f n y 抗體的w e s t e r nb l o t 鑒定2 1圖卜8i i 鏈三聚體并h m h c i i 鏈復(fù)合體模式圖3 l圖卜9p c r 擴(kuò)增物3 9圖卜1 0p e g f p n 1 一p 3 l 、p e g f p c 1 一p 3 l 雙酶切鑒定結(jié)果3 9圖卜l l 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的h e k 2 9 3 細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)4 0附圖a ：p e t 一3 2 a c ( + ) 質(zhì)粒圖4 7附圖g ：p g e x - 4 t l 質(zhì)粒圖譜4 7i xa m pa p cb pb s ad ) n ac o n ad n ad 1 v re u s agg s th沖口t gk dl bm r n an u n砌co do i 疆r a c er i 礬ar p mss e cs d slp g主要符號(hào)表a m p i c i l i na n t i g e n p r e s e n t i n gc e l lb a s ep a i rb o v i n es e r u ma l b u m i nc o m p l e m e n t a r yd n ac o n c a n a v a l i nad e o x y r i b o n u c l e o t i d ea c i dd i t h i o t h r e i t o le n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yg r a mg l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s eh o u rh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei n v a r i a n tc h a i ni s o p r o p y l t h i o - b - d - g a l a c a t o s i d ek i l o d a l t o nl u r i a - b e r t a n im e s s a n g er n am i n u t em a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e xo p t i c a ld e n s i t yo p e nr e a df r a m er a p i da m p l i f i c a t i o ne d n ae n dr i b o s o m er n ar e v o l u t i o n sp e rm i n u t es v e d b e r gs e c o n ds o d i u md o d e c y ls u l f a t em i c r o l i t e rm i c r o g r a mx氨芐青霉素抗原呈遞細(xì)胞堿基對(duì)牛血清白蛋白反轉(zhuǎn)錄d n a刀豆素a脫氧核糖核酸二硫蘇糖醇酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)克谷胱甘肽s 轉(zhuǎn)移酶小時(shí)辣根過(guò)氧化物酶恒定鏈異丙基硫代p d 半乳糖千道爾頓l b 培養(yǎng)基信使核糖核酸分鐘主要組織相容性復(fù)合體光密度開(kāi)放閱讀框e d n a 末端快速擴(kuò)增技術(shù)核糖體r n a每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)沉降系數(shù)秒十二烷基硫酸鈉微升微克獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：危扔)、時(shí)間：孵鄉(xiāng)月加關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：第一導(dǎo)師簽名：時(shí)間：緲g 月目時(shí)間：年月日第一部分豬i f n - 基因的克隆表達(dá)及多克隆抗體的制備文獻(xiàn)綜述早在2 0 世紀(jì)3 0 年代，人們就發(fā)現(xiàn)機(jī)體在感染某一種病毒后，會(huì)對(duì)另一種抗原性毫無(wú)關(guān)系的病毒發(fā)生干擾現(xiàn)象。直至1 j 1 9 5 7 年，i s a a c s 和l i n d a n m a n n 發(fā)現(xiàn)將滅活的流感病毒接種雞胚尿囊膜后，其條件培養(yǎng)基具有一種干擾病毒增殖的活性因子，因此將該因子稱(chēng)為干擾素( i n t e r f e r o n ，i f n ) ，成為第一個(gè)( 類(lèi)) 被正式命名的細(xì)胞因子【l 】。干擾素丫具有誘導(dǎo)機(jī)體合成多種阻斷病毒復(fù)制功能的抗病毒酶和蛋白，是抗病毒感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要分子。n 吖還能增強(qiáng)機(jī)體t n 細(xì)胞和d t h 的免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。研究者們對(duì)人類(lèi)、哺乳動(dòng)物及嚙齒類(lèi)動(dòng)物的干擾素進(jìn)行大量的研究，特別是干擾素基因工程和基因治療的研究已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。l 、干擾素的分類(lèi)干擾素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是一類(lèi)由低分子量的可溶性糖蛋白組成的具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子【2 】。根據(jù)其來(lái)源和結(jié)構(gòu)，可分為i 型和i i 型。已報(bào)道的i型干擾素為a 、b 、c o 、1 c 、百、6 等六種類(lèi)型，它們具有相關(guān)的結(jié)構(gòu)并享用同一受體，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒蛋白。0 c 、d 型干擾素有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，如對(duì)熱( 5 6 3 0 m i n ) 、酸( p h 2 ) 、堿( p i l l l ) 穩(wěn)定，抗病毒活性強(qiáng)，誘生m h c ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) i 類(lèi)抗原的表達(dá)等。而i i 型干擾素僅為丫一種類(lèi)型1 3 】，與i 型干擾素享用不同的一類(lèi)受體。0 【型干擾素各亞型均含1 6 5 1 6 6 個(gè)氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)相似，無(wú)糖基化修飾，其分子含有4 個(gè)保守的半胱氨酸。人和小鼠蜊p 基因只有一個(gè)，無(wú)內(nèi)含子，與i f n 旗基酸組成有2 6 3 0 同源性，人i f n p 分子是由1 6 6 個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，含有3 個(gè)半胱氨酸。c y s 3 1 4 1 之間的二硫鍵對(duì)i f n d 的生物學(xué)活性非常重要，但糖基化對(duì)其活性無(wú)影響。人的i f n y 基因定位于1 2 號(hào)染色體( 小鼠的口附吖基因在1 0 號(hào)染色體) ，有4 個(gè)外顯子。人和小鼠i f n - 丫在d n a 水平上有6 5 左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有4 0 左右。人i f n - 7 成熟分子由1 4 3 個(gè)氨基酸組成，分子量為4 0k d ，其生物學(xué)作用有較嚴(yán)格的種屬特異性。豬i f n - - 基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為4 9 8 b p ，編碼1 6 6 個(gè)氨基酸殘基，分子量約為1 9 4 k d ，等電點(diǎn)為l o 2 9 ，疏水氨基酸占4 0 ，親水氨基酸占3 4 9 ，堿性氨基酸占1 5 1 ，酸性氨基酸占9 6 ，基因的6 3 1 3 6 位核苷酸編碼2 3 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，1 3 7 5 6 9 位核苷酸編碼1 4 4 個(gè)氨基酸殘基的成熟片段 4 】。2 、干擾素的生物學(xué)活性目前對(duì)干擾素的生物學(xué)功能研究報(bào)道較多，由于i 型和i i 型干擾素來(lái)源不同( i n f 0 c 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，i n f b 來(lái)源于成纖維細(xì)胞，i 而i n f - v 主要產(chǎn)生于。啦t細(xì)胞、丫6 t 細(xì)胞和n k 細(xì)胞) ，其揮發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)也存在一定差異。i f n 的產(chǎn)生受細(xì)胞基因組控制，由于細(xì)胞d n a 中刪基因抑制物( t e ns u r p r e s s o r ) 與干擾素基因結(jié)合，抑制復(fù)制酶系統(tǒng)，所以一般情況下，i f n 基因處于抑制狀態(tài)。當(dāng)病毒或其他誘生劑作用于細(xì)胞膜后，i f n 基因失去抑制作用，i f n 操縱子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，合成m r n a 并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿，在核糖體上轉(zhuǎn)譯成i f n 前體，切除信號(hào)肽后，成熟的i f n 分泌到細(xì)胞外。干擾素的主要生物學(xué)功能可概括為【5 】：( 1 ) 抗病毒作用干擾素并不直接與靶分子發(fā)揮作用，而首先要與靶細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，通過(guò)信號(hào)傳遞，引發(fā)一系列特定的生化反應(yīng)。刺激細(xì)胞內(nèi)多種效應(yīng)蛋白質(zhì)分子合成，從而發(fā)揮干擾素的功能。病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，同時(shí)病毒感染細(xì)胞導(dǎo)致被感染細(xì)胞的死亡、崩解，干擾素也隨之釋放。干擾素分子向四周擴(kuò)散，并隨血液循環(huán)至全身。干擾素與周?chē)?xì)胞膜上的受體結(jié)合，通過(guò)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶，促使c a m p 的形成。c a m p 作為第二信使而激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒作用機(jī)制，產(chǎn)生一組抗病毒蛋白( a n t i v i r a lp r o t e i n ，a v p ) ，抵抗病毒對(duì)機(jī)體的細(xì)胞感染。i 型干擾素的抗病毒作用強(qiáng)于i i 型干擾素，其主要是通過(guò)旁分泌作用。在這種情況下，病毒感染的細(xì)胞分泌干擾素保護(hù)鄰近細(xì)胞不再受感染，即使鄰近細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)。i f n y 的抗病毒作用有種屬特異性【6 】，它還能通過(guò)其它未知的途徑抗病毒繁殖【7 渴j 。( 2 ) 抗腫瘤作用干擾素的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在：抑制腫瘤的增殖和腫瘤細(xì)胞的增生。改變瘤細(xì)胞表面的性能，誘發(fā)新的抗原，從而使細(xì)胞易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并排斥。通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。其中n y 白勺抗腫瘤作用最強(qiáng)。i f n 謝腫瘤細(xì)胞有直接的抑制作用，通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期抑制腫瘤的發(fā)生與成長(zhǎng)；且硎何癌基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長(zhǎng)和癌基因的表達(dá)均有抑制作用；還可以調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體抗腫瘤免疫力 9 】。i f n y 的抗腫瘤作用是多方面的，包括多方面抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)多方面抗腫瘤的免疫應(yīng)答。( 3 ) 免疫調(diào)節(jié)作用干擾素是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。干擾素可增加免疫球蛋i g g 的受體表達(dá)，從而有利于巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和k 、砌胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷以及t 、b 淋巴細(xì)胞的激活，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力【l0 1 。它可以調(diào)節(jié)t 、b 淋巴細(xì)胞的功能，小劑量起促進(jìn)作用，大劑量起抑制作用。i f n 侑著廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠誘導(dǎo)重要的抗原遞呈輔助分子如抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)因子( t a p ) 、p r o t e a s o m e s 和m h c 分子的表達(dá)，而這些分子是t n 細(xì)胞和細(xì)胞毒t 細(xì)胞識(shí)別外源抗原所需的【1 1 】。i f n 讎顯著增力i a p c 表達(dá)m h c i i 類(lèi)抗原的數(shù)量，增強(qiáng)a p c 與t 細(xì)胞的相互作用，增加輔助t 細(xì)2胞( t - h e l p e re e l l ，t h ) 的數(shù)量和增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)( d e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t y ，d t h ) ，進(jìn)而增強(qiáng)t 細(xì)胞輔助抗體產(chǎn)生和輔助細(xì)胞毒t 細(xì)胞產(chǎn)生的能力 1 2 , 1 3 】。此外干擾素還可以直接調(diào)節(jié)b 細(xì)胞的發(fā)育與增殖、抗體分泌和重鏈的轉(zhuǎn)換。i f n t 還能通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 抑制機(jī)體的體液免疫應(yīng)答【1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 】，而且可能是移植排斥過(guò)程中極為重要的分子 2 0 j 。3 、干擾素的應(yīng)用白干擾素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們即對(duì)其臨床應(yīng)用寄以極大希望，干擾素不但能誘生抗病毒抵抗力，而且能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和增強(qiáng)抗腫瘤活力，涉及范圍很廣，與臨床各科幾乎都有一定的關(guān)系。i 型干擾素是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的基因工程產(chǎn)品，1 9 8 5 年，f d a批準(zhǔn)i f n o 止市，治療病毒感染。利用基因操作方法可生產(chǎn)出大量高效價(jià)的重組干擾素基因工程產(chǎn)品，而且經(jīng)過(guò)臨床應(yīng)用治療表明，用干擾素治療一般無(wú)嚴(yán)重副反應(yīng)，少數(shù)病例可有發(fā)熱、食欲不佳、疲勞不適以及白細(xì)胞減少等，停藥后很快消失。在畜牧獸醫(yī)中，干擾素對(duì)生產(chǎn)具重大威脅的傳染病病毒均具有防御和抑制作用。k g l z u oa k i u a m a 等用重組牛i f n 僅( r b o 吲0 【) 可提高牛免疫調(diào)節(jié)能力和白細(xì)胞功能而間接對(duì)牛呼吸道疾病具有預(yù)防作用【2 1 1 。徐良玉研制的牛血i f n 對(duì)黃犢牛輪狀病毒以及感染豬瘟進(jìn)行試驗(yàn)性治療，效果良好，對(duì)牛的總有效率為9 1 8 7 ，豬為5 8 0 6 【z 2 j 。i f n 是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的重要免疫分子，不論是外源性口臥吖，還是內(nèi)源性的n - 丫，都表現(xiàn)了強(qiáng)大的抗蟲(chóng)效應(yīng)【2 3 1 ，r o s e 等( 1 9 9 1 ) 、m a r t i n 等( 1 9 9 4 ) 、b r e e d 等( 1 9 9 7 ) 、l o w e n t h a l 等( 1 9 9 7 ) 、d i m i e r 等( 1 9 9 8 ) 、l i l l e h o j 等( 1 9 9 8 ) 等先后研究了感染艾美爾球蟲(chóng)病雞體內(nèi)產(chǎn)生c h l f n y 白勺情況，體外注射重組c h i f n 做到了較好的治療效果，且雞的體重在注射后1 2 天有所增a n t 2 4 ，2 5 2 6 ，2 7 ，2 8 2 9 1 。研究表明豬心吖能明顯抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒( p r r s v ) 在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的增殖【3 0 1 ，增強(qiáng)豬體抗豬瘟病毒( c s f v ) 的能力【3 l 】。徐彥祥用豬白細(xì)胞i f n 對(duì)仔豬病毒性腹瀉或病毒、細(xì)菌混合感染引起的腹瀉均有良好的預(yù)防和治療效梨強(qiáng)j ，劉萬(wàn)均用重組的豬白細(xì)胞i f n 能降低豬流行性腹瀉的發(fā)病率【3 3 1 。而且口階吖與疫苗聯(lián)用時(shí)，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，改善感染動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，是既安全又高效的免疫佐劑【3 4 如j 。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，豬的病毒性疾病危害大種類(lèi)多且不易控制，豬i f n 一忙作為動(dòng)物的廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)劑和疫苗佐劑方面有著良好的應(yīng)用前景和美好未來(lái)。在干擾素研究中，仍有一些理論與實(shí)踐方面的問(wèn)題需要進(jìn)一步探討。如干擾素種類(lèi)較多，而且具有多種亞型，它們的生物學(xué)功能需要更深入了解；干擾素的分子結(jié)構(gòu)需要深入研究改造，才能更有效地發(fā)揮其生物功能；重組干擾素不能大量生產(chǎn)，最初曾經(jīng)采用血細(xì)胞誘導(dǎo)生產(chǎn)干擾素，但是血源制品存在潛在危險(xiǎn)，因此目前采用的干擾素都是基因工程產(chǎn)品。其生產(chǎn)成本限制了其廣泛應(yīng)用等等。盡管如此，重組干擾素產(chǎn)品良好的臨床效果，使得干擾素的應(yīng)用前景還是非常廣闊的。引言細(xì)胞因子( c y t o k i n e sc k ) 是由多種淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及一些基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)小分子物質(zhì)，其本質(zhì)為多肽，主要包括干擾素( i f n ) 、腫瘤壞死因子( t n f ) 、白細(xì)胞介素( i d 、集落刺激因子( c s f ) 、表皮生長(zhǎng)因子( e g f ) 、神經(jīng)生長(zhǎng)因子( n g f ) 、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子( h g f ) 等【3 6 1 。細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促進(jìn)造血、參與炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)等多種生物學(xué)功能。在人和動(dòng)物體內(nèi)，絕大多數(shù)細(xì)胞因子含量很低，其作用主要是提高人和動(dòng)物的免疫功能及與機(jī)體的生長(zhǎng)和代謝有判3 7 j 。干擾素根據(jù)其來(lái)源和結(jié)構(gòu)，可分為i 型和i i 型。已報(bào)道的i 型干擾素為a 、p 、k 、t 、6 等六種類(lèi)型，它們具有相關(guān)的結(jié)構(gòu)并享用同一受體，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒蛋白。僅、d 型干擾素有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，如對(duì)熱( 5 6 c3 0 m i n ) 、酸( p h 2 ) 、堿( p h l l ) 穩(wěn)定，抗病毒活性強(qiáng)，誘生m h c ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c )i 類(lèi)抗原的表達(dá)等。而i i 型干擾素僅為丫一種類(lèi)型3 1 ，與i 型干擾素享用不同的一類(lèi)受體。嘶作為最早發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng)中處于中心地位。干擾素1 ，可增強(qiáng)t 、b 細(xì)胞的激活和i g g 的f c 受體表達(dá)，具有誘導(dǎo)機(jī)體合成多種阻斷病毒復(fù)制功能的抗病毒酶和蛋白，是抗病毒感染的重要分子。i f n 吖能增強(qiáng)機(jī)體t n 細(xì)胞和d t h 的免疫應(yīng)答。其機(jī)理是通過(guò)提高抗原遞呈細(xì)胞膜表面m h ci i 類(lèi)抗原的表達(dá)【引。所以i f n 吖也是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在臨床上常用作免疫佐劑?；趇 f n - 丫分子在動(dòng)物免疫學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中的重要理論意義和實(shí)踐意義，通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究現(xiàn)狀和可行性進(jìn)行綜合分析，本研究試圖擴(kuò)增出編碼豬i f n o , 分子成熟蛋白的完整核酸序列，對(duì)豬蜊吖分子成熟蛋白重要功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，并在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，制備了鼠源豬吲吖分子的多克隆抗體，這將為進(jìn)一步開(kāi)展豬i f n 吖分子的結(jié)構(gòu)功能及t 淋巴細(xì)胞的免疫功能的研究積累必要的經(jīng)驗(yàn)、材料和基礎(chǔ)。41 材料與方法1 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1 1 1 仔豬：購(gòu)于安徽某豬場(chǎng)。1 1 2 雌性b a l b e 小鼠：購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1 2 質(zhì)粒、工程菌和細(xì)胞：1 2 1 質(zhì)粒：p g e x 4 t - 1 、p e t - 3 2 a 載體由中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。1 2 2 工程菌：大腸桿菌d h 5 a 、b l 2 1 菌株由中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。1 3 工具酶和試劑：t r i z o lr e a g e n t ：購(gòu)自i n v i t r o g e n 公司。m m l v 反轉(zhuǎn)錄酶、異丙基p d 硫代半乳糖苷( i p t g ) - 購(gòu)自p r o m e g a 公司。瓊脂糖( 西班牙產(chǎn)) 、r n a s i n 、x d n a j h i n d i i i + e c o rim a r k e t s 、e b 、溶菌酶、考馬斯亮藍(lán)r 2 5 0 、s d s 、t r i t o x 1 0 0 購(gòu)自華美生物工程公司。氨芐青霉素、異丙基硫代- p - d半乳糖( i p t g ) 、二硫蘇糖醇( d t r ) 為s i g m a 公司產(chǎn)品。山羊抗小鼠h r p i g g 酶標(biāo)抗體購(gòu)自北京中杉公司。d n a m a r k e rd l 2 0 0 0 、限制性?xún)?nèi)切酶( 包括e c o ri 、s a li ) 、d l 2 0 0 0d n a m a r k e r 、t 4d n a 連接酶和e xt a q 酶：購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。d n a 凝膠回收試劑盒、d n a 清潔p c r 產(chǎn)物清潔試劑盒、小量日常型質(zhì)粒d n a 抽提試劑盒：購(gòu)自北京道普生物技術(shù)有限公司。1 4 實(shí)驗(yàn)溶液的配制：1 4 1l b 液體固體培養(yǎng)基胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 1 0 9 ，酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 5 9 ，n a c l1 0 9 ，加8 0 0 m l蒸餾水，l m o l l 的n a o h 調(diào)p h 值至7 0 ，定容至1 l ，1 1 5 。c ，1 5 m i n 高壓滅菌后4 。c備用。固體培養(yǎng)基再加入瓊脂粉至終