Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染.ppt

Sf 9細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Sf 9細(xì)胞 Sf 9細(xì)胞是由G E Smith和C L Cherry在1983年從細(xì)胞株IPLB SF21AE得來的一個(gè)克隆 IPLB SF21AE是1977年由Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到的 Sf 9是半貼壁的細(xì)胞 貼壁性不強(qiáng) 可貼壁培養(yǎng)也可懸浮培養(yǎng) Sf 9細(xì)胞的形態(tài) 培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境溫度 28 氧pH 7 2 7 4滲透壓3 無污染4 無毒 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用品 超凈工作臺(tái) 壓力蒸汽消毒器 電熱干燥箱 濾器 酸缸生化培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀耗材 培養(yǎng)瓶 吸管 電動(dòng)吸引器 培養(yǎng)板 凍存管 超凈臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃粒 使空氣得到凈化 凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面 使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境 生化培養(yǎng)箱 生化培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為28 使用生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題 1 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈 定期消毒 90 14h 2 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000ml蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度 避免培養(yǎng)液蒸發(fā) 培養(yǎng)瓶 拿培養(yǎng)瓶的正確姿勢 拇指和食指夾住培養(yǎng)瓶 瓶口向外 中指托住瓶底 保持瓶子的水平 防止培養(yǎng)液倒向瓶口 血球計(jì)數(shù)板 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 凍存和復(fù)蘇的原則 慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下 可以產(chǎn)生以下變化 細(xì)胞器脫水 細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高 并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 如果緩慢冷凍 可使細(xì)胞逐步脫水 細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶 相反 結(jié)晶就大 大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜 綱胞器的損傷和破裂 復(fù)蘇過程應(yīng)快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重結(jié)晶 慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序 當(dāng)溫度在 25 以上時(shí) 1 2 min當(dāng)溫度達(dá) 25 以下時(shí) 5 10 min當(dāng)溫度達(dá) 100 時(shí) 可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存簡易程序 將冷凍管 管口要朝上 放入紗布袋內(nèi) 紗布袋系以線繩 通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口 按每分鐘溫度下降1 2 的速度 在40分鐘內(nèi)降至液氮表面 停30分鐘后 直接投人液氮中 細(xì)胞復(fù)蘇方法 1 從液氮中取出冷凍管 迅速投入37 38 水浴中 使其融化 1分鐘左右 2 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上 3 低速離心10分鐘 4 去上清 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞 Sf9細(xì)胞的傳代 判斷分離 散 細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁 一般來說 原代培養(yǎng)物未達(dá)到生長基質(zhì)的80 表面面積 不要急于傳代 對于擬行首次傳代的培養(yǎng)物更如此 Sf9的分裂周期大概是27小時(shí)左右 Sf9傳代的方法 1 吸取或者傾出舊培養(yǎng)液 2 加入一定量的新培養(yǎng)基 用吸管吸取培養(yǎng)液 反復(fù)吹打瓶皿底壁 使半貼壁的細(xì)胞脫離瓶皿底壁 吹打過程須有序進(jìn)行 亦即要從一邊開始到另一邊結(jié)束 尤其是器皿的邊緣地帶和四角處 確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞均被吹打脫離 吹打時(shí)動(dòng)作不宜過猛 吹出液體的力度要適中 否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡 或者使細(xì)胞碎片增多 經(jīng)吹打后 得到細(xì)胞懸液 Sf9傳代的方法 3 接種在新的培養(yǎng)瓶皿內(nèi) 一般接種兩個(gè)或者多個(gè)培養(yǎng)瓶皿內(nèi) 有時(shí)候 傳代僅為了使培養(yǎng)物經(jīng)歷并適應(yīng)傳代處理過程 在培養(yǎng)物細(xì)胞數(shù)量不大的情況下 傳代時(shí)還只是接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶皿內(nèi) 加入培養(yǎng)液 平時(shí)不做實(shí)驗(yàn)時(shí) 只需要傳一瓶 以1 5或更多為宜 每2 3天傳代一次 28 培養(yǎng) 不用CO2培養(yǎng)箱 4 送入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 換液 對于像Sf9這樣的半貼壁的培養(yǎng)物 可按如下步驟操作 吸去或傾出 部分或全部 舊培養(yǎng)液 加入新鮮的培養(yǎng)液 加入的量與換液前的量相同 放回原來的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染 transfection 指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程 化學(xué)包括 DEAE 葡聚糖法 磷酸鈣法 人工脂質(zhì)體法物理包括 顯微注射 電穿孔 基因槍 Bacmid Bac to Bacexpressionsystem 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) BaculovirousExpressionVectorSystem BEVS 與細(xì)菌 酵母 哺乳動(dòng)物細(xì)胞一起被公認(rèn)為當(dāng)今世界的基因工程的四大表達(dá)系統(tǒng) 特點(diǎn) 能對高效表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行較完善的翻譯后加工 如糖基化 磷酸化 ?；?信號(hào)肽的切除等 與其他真和細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比能獲得重組蛋白的高水平表達(dá) 最高甚至可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50 對脊椎動(dòng)物無感染性 并且也已經(jīng)證明它們的啟動(dòng)子在大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也是沒有活性的 因此這對于表達(dá)一些致癌基因和潛在的毒蛋白比其他的表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)勢 能容納大分子片段的插入和表達(dá) 能同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞和載體上表達(dá)多個(gè)外源基因 能保證高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確的折疊 二硫鍵的搭配等 桿狀病毒 現(xiàn)已知基因組全序列的桿狀病毒僅有7種 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒 AcMNPV 家蠶核多角體病毒 BmNPV 黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒 OpMNPV 舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒 LdMNPV 甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒 SeMNPV 棉鈴蟲核型多角體病毒 HaNPV 斜紋夜蛾核型多角體病毒 SpltMNPV 多角體蛋白 多角體蛋白是形成包含體 在顯微鏡下可以識(shí)別的病毒合成和積貯的部位 常是細(xì)胞內(nèi)的病毒晶體 它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體 包含大部分的表達(dá)蛋白 的主要成分 感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)30 50 是病毒復(fù)制非必需成分 但對病毒粒子卻有保護(hù)作用 可使之保持穩(wěn)定和感染能力 Bacmid 能快速 高效產(chǎn)生的重組AcMNPV病毒 取桿狀病毒 baculovirus 和質(zhì)粒 plasmid 的英文字頭字尾命名為Bacmid 即桿狀病毒質(zhì)粒之意 該載體可像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中生長 又對鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成 表達(dá)過程 1 將外源目的基因插入到啟動(dòng)子下游與桿狀病毒重組 獲得重組病毒 酶切酶連轉(zhuǎn)化 2 將重組的病毒純化3 感染昆蟲細(xì)胞或蟲體 轉(zhuǎn)染 4 外源基因隨著病毒的復(fù)制而獲得表達(dá) 人 細(xì) 小 病 毒 B 1 9 X A 株 V P 1 蛋 白 在 B a c t o B a c 系 統(tǒng) 中 的 表 達(dá) 及 其 反 應(yīng) 原 性 Bac toBac BaculovirusExpressionS