（微生物學(xué)專業(yè)論文）致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述.pdf

題目 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 專業(yè) 微生物學(xué) 碩士生 王聞 指導(dǎo)教師 邱禮鴻副教授 摘要 昆蟲病原線蟲共生菌目前已定名的有兩個屬 致病桿菌屬 x e n o r h a b d u s 和發(fā)光桿菌屬 p h o t o r h a b d u s 這類細(xì)菌存在于其宿主線蟲的腸道內(nèi) 兩者形 成典型的共生關(guān)系 昆蟲病原線蟲及其共生菌復(fù)合體已成為一類新型生物殺蟲 劑 在害蟲生物防治中發(fā)揮著重要作用 共生菌產(chǎn)生的多種具有生物活性的代謝 產(chǎn)物 如殺蟲毒素 抗生素等已引起人們的關(guān)注 成為另一研究熱點(diǎn) 共生菌的 采集 鑒定和分類是開發(fā)利用這類重要生物資源的基礎(chǔ) 本研究對我室采集到的三個昆蟲病原線蟲新種 s t e i n e r n e m aa c i a r ig d h 7 l e i z h o u e n s eg d e 3 2 8 和 e m e r n e m as p y n d 7 2 所攜帶的三株共生菌g d h 7 g d e 3 2 8 和y n d 7 2 進(jìn)行了鑒定和描述 首先采用p c r 克隆和測序手段獲得這 三株菌的1 6 sr d n a 和母相基因的近乎全長序列 基于1 6 sr d n a 全長序列構(gòu)建 的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示g d h 7 g d c 3 2 8 和y n d 7 2 屬于致病桿菌屬 它們之間的序列 相似性低于9 8 7 與該屬已定名種的相似性低于9 7 9 基于g y r b 基因序列分 析得到的g d h 7 g d e 3 2 8 和y n d 7 2 的分類地位與上述基于1 6 sr d n a 序列分析 所得結(jié)果基本一致 對這三株共生菌的形態(tài)與生理生化特性的分析結(jié)果顯示 該 三株菌的大部分生理生化特性與致病桿菌屬相符 而這三株菌之間以及它們與該 屬各已定名種之間在生理生化特征上存在一些明顯差異 采用基因組d n a d n a 雜交的方法對這三株菌以及與其親緣關(guān)系較近的兩個定名種進(jìn)行同源性分 析 結(jié)果顯示所測五株菌之間的同源性均低于6 0 綜合上述研究結(jié)果可以初步 判定g d h 7 g d c 3 2 8 和y n d 7 2 為致病桿菌屬的三個新種 當(dāng)然 只有正式發(fā)表 后才能成為有效新種 關(guān)鍵詞 昆蟲病原線蟲共生菌 1 6 sr d n a 表型鑒定 d n a d n a 雜交 t i t l e i d e n t i f i c a t i o na n d d e s c r i p t i o no f t h r e ep o t e n t i a ln e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s m a j o r m i c r o b i o l o g y n a m e w a n gw e n s u p e r v i s o r q i ul i h o n ga s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t s p e c i e s o fx e n o r h a b d u sa n dp h o t o r h a b d u sa r e s y m b i o t i cb a c t e r i ao f e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e so fs t e i n e r n e m aa n dh e t e r o r h a b d i t i s r e s p e c t i v e l y t h e n e m a t o d e b a c t e r i ac o m p l e x e sh a v eb e c o m ei m p o r t a n tb i o l o g i c a lc o n t r o la g e n t s i th a s a l s ob e e nd e m o n s t r a t e dt h a tt h e s eb a c t e r i ap r o d u c e dm a n ys e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw i t h v a r i o u sb i o l o g i c a la c t i v i t i e s s u c ha si n s e c t i c i d a lt o x i n s a n t i b i o t i c sa n da n t i f e e d a n t s c o l l e c t i o na n dc o r r e c tc l a s s i f i c a t i o ni st h eb a s i sf o rf u r t h e rs t u d ya n du t i l i z a t i o no f t h e s eb e n e f i c i a lb a c t e r i a i nt h i ss t u d y t h et a x o n o m i cs t a t u so ft h eb a c t e r i ag d h 7 g d e 3 2 8a n dy n d 7 2 w h i c hw e r ei s o l a t e df r o me n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s a c i a r ig d h 7 s l e i z h o u e n s eg d c 3 2 8a n ds t e i n e r n e m as p y n d 7 2 r e s p e c t i v e l y w a se x a m i n e d t h e a p p r o a c ho fp c r a m p l i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n gw a su s e dt oo b t a i nt h en e a r l y c o m p l e t e ds e q u e n c e so f16 sr d n aa n dg y r bg e n eo ft h eb a c t e r i ae x a m i n e d 1 1 1 e p h y b g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e16 sr d n as e q u e n c e ss h o w e dt h a tg d h 7 g d c 3 2 8a n d y n d 7 2b e l o n gt ox e n o r h a b d u s a n dt h es e q u e n c es i m i l a r i t i e sw e r el o w e rt h a n9 8 7 a m o n gt h e ma n dl o w e rt h a n9 7 9 b e t w e e na n yo n go f t h e ma n da n yd e s c r i b e d s p e c i e so f x e n o r h a b d u s t h et a x o n o m i cs t a t u so ft h e s et h r e eb a c t e r i ar e v e a l e db yt h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do ng y r bg e n es h o w e ds i m i l a rr e s u l t st ot h a to f16 sr d n a p h e n o t y p i cc h a r a c t e r i z a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e r a lc h a r a c t e r so f t h e s et h r e e b a c t e r i aw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h o s eo fx e n o r h a b d u sw h i l es u b s t a n t i a ld i f f e r e n c e s c o u l dh ef o u n db e t w e e na n yo n eo ft h eb a c t e r i ae x a m i n e da n da n yd e s c r i b e d x e n o r h a b d u ss p e c k s d n a d n ah y b r i d i z a t i o nf o u n dt h a tt h eg e n o m i cd n a h y b r i d i z a t i o nr a t e sb e t w e e ng d h 7 g d c 3 2 8 y n d 7 2a n dt w od e s c r i b e ds p e c i e so f x e n o r h a b d u st h a ta r ec l o s et ot h eb a c t e r i ae x a m i n e dw e r el o w e rt h a n6 0 t 1 1 e n c o m b i n a t i o no ft h ea b o v er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tg d h 7 g d c 3 2 8a n dy n d 7 2a r e l i k e l yt ob et h r e en e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s k e yw o r d s s y m b i o t i c b a c t e r i ao fe n t o m o p a t h o g e n i c n e m a t o d e s 16 sr d n a p h e n o t y p i ci d e n t i f i c a t i o n d n a d n ah y b r i d i z a t i o n 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學(xué)位論文 是本人在導(dǎo)師的指 導(dǎo)下 獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果 除文中已經(jīng)注明引 用的內(nèi)容外 本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或 撰寫過的作品成果 對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集 體 均已在文中以明確方式標(biāo)明 本人完全意識到本聲明的 法律結(jié)果由本人承擔(dān) 學(xué)位論文作者簽名 王i 司 日期 砂7 年莎月矽日 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 本人完全了解中山大學(xué)有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī) 定 即 學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國家主管部門或其指定 機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版 有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏 利目的的少量復(fù)制并允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館 院系資料室 被查閱 有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索 可以采用復(fù)印 縮印或其他方法保存學(xué)位論文 學(xué)位論文作者簽名 王j 剿 導(dǎo)師簽名 邱x 夠 日期 刃9 年舌月莎日 王聞中山大學(xué)碩士論文 2 0 0 9 i 厶 j l 月i j吾 昆蟲病原線蟲與其它昆蟲寄生線蟲的主要區(qū)別在于其體內(nèi)攜帶特異的細(xì)菌 線蟲與其所攜帶的細(xì)菌形成典型的共生關(guān)系 線蟲依靠細(xì)菌產(chǎn)生的多種有生物活 性代謝產(chǎn)物 如殺蟲毒素 胞外酶 抗生素和取食驅(qū)避劑等 致死昆蟲 將蟲尸 轉(zhuǎn)化為其能利用的養(yǎng)分和保護(hù)蟲尸免受環(huán)境中其它有機(jī)體的侵害 從而保證e n 的順利生長和繁衍 而細(xì)菌則依靠線蟲將其帶入昆蟲體內(nèi)并保護(hù)其免受對其有害 的環(huán)境因素的影響 昆蟲病原線蟲現(xiàn)已成為一類新型生物殺蟲劑 已商品化并成功用于防治多種 害蟲 除了作為生物殺蟲劑外 近年來在e n 共生菌有生物活性代謝產(chǎn)物 如抗 生素 殺蟲蛋白毒素等的基礎(chǔ)和開發(fā)研究方面取得的突破性進(jìn)展也引起了廣泛地 重視 成了另一研究熱點(diǎn) 在殺蟲毒素方面 自從1 9 9 8 年b o w e n 等在s c i e n c e 上報道了從e n 共生菌中發(fā)現(xiàn)的一個有強(qiáng)口服殺蟲活性的蛋白毒素以來 現(xiàn)已從 e n 共生菌中發(fā)現(xiàn)了多個類型的蛋白毒素 不同類型的蛋白毒素的殺蟲譜不同 殺蟲機(jī)理也不同 2 0 0 3 年完成的共生菌pl u m i n e s c e n st r o l 菌株的全基因組測序 結(jié)果顯示 該菌株中含有8 類至少4 0 個毒素基因 是目前已完成了全基因組測 序的細(xì)菌中含有殺蟲毒素基因種類和數(shù)量最多的菌株 d u c h a u de ta 2 0 0 3 有 些共生菌毒素基因已被成功轉(zhuǎn)入植物并顯示出良好的抗蟲活性 l i ue ta 1 2 0 0 3 共生菌很可能成為繼蘇云金桿菌之后開發(fā)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的毒素基因源 在抗生 素方面 已從共生菌中分離到屬于二苯乙烯 苯毗哺 雙硫吡咯酮或吲哚類衍生 物 對多種植物或人類病原細(xì)菌或真菌有較強(qiáng)抑殺作用的有機(jī)小分子類物質(zhì)多 種 其中有些很有希望開發(fā)成新一代醫(yī)用或農(nóng)用抗生素 最近還從共生菌代謝產(chǎn) 物中分離到有抗癌 消炎和抗一些自身免疫病作用的物質(zhì) 引起人們從共生菌次 生代謝產(chǎn)物中開發(fā)藥物的興趣 劉衛(wèi)京等2 0 0 4 已有專門從事e n 共生菌藥物 開發(fā)的公司 其中有些產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段 h t t p w w w w e l i c h e m c o r n 不同種或品系的共生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有明顯的不同 從共生菌新種或新 品系中找到新的有活性物質(zhì)的可能性更大 積累共生菌種質(zhì)資源和準(zhǔn)確的分類是 進(jìn)行其它有關(guān)研究的基礎(chǔ) 近年來 本室在廣東和云南等地采集分離到大量的昆 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 蟲病原線蟲及其共生菌 本研究綜合采用了分子鑒定 生理生化測定和d n a d n a 雜交技術(shù)對本室在我國采集到的斯氏屬昆蟲病原線蟲三個新種所攜帶共生 菌進(jìn)行了鑒定與描述 為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用這三種線蟲及其共生菌奠定了基 礎(chǔ) 2 王聞中山大學(xué)碩士論文2 0 0 9 第一章昆蟲病原線蟲共生菌的研究概況 1 1 昆蟲病原線蟲 昆蟲病原線蟲 e n t o m o p a t h o g e n i en e m a t o d e se p n s 是一類體內(nèi)攜帶共生細(xì) 菌的昆蟲寄生性線蟲 隸屬于動物界線蟲動物門 n e m a t o d a 尾感器綱 s e c e m e n t e a 小桿目 r h a b d i t i d a 包括斯氏線蟲科 s t e i n e m e m a t i d a e 和 異小桿線蟲科 h e t e r o r h a b d i t i d a e 其中斯氏線蟲科包括兩個屬 即斯氏線蟲屬 s t e i n e r n e m a 和新斯氏線蟲屬 n e o s t e i n e r n e m a 異小桿線蟲科包括一個屬 即異小桿線蟲屬 h e t e r o r h a b d i t i s 丘雪紅等2 0 0 7 該類線蟲作為一種新型的 生物殺蟲劑 能夠防治鱗翅目 雙翅目和鞘翅目等經(jīng)濟(jì)作物害蟲 b u r n e l le ta 1 2 0 0 0 尤其是土壤害蟲 k a y a e ta 1 9 9 3 g e o r g i se ta 1 1 9 9 4 寄主范圍廣 對 脊椎動物 植物和非靶標(biāo)生物安全 對環(huán)境無負(fù)面影響 可以在昆蟲體內(nèi)外進(jìn)行 大量培養(yǎng) 施用方便 能主動尋找寄主 在寄主中繁殖并快速殺死寄主 可與許 多化學(xué)和其他生物殺蟲劑混用 可通過遺傳選擇獲得想要的特性以及可直接利用 而無需注冊 但是它們也會寄生在一些益蟲體內(nèi) 對環(huán)境變化的適應(yīng)性弱 不能 長期儲存以及價格比化學(xué)殺蟲劑要高 h a z i re ta 1 2 0 0 4 盡管存在這些不足 但昆蟲病原線蟲作為生物防治試劑的前景依然較好 昆蟲病原線蟲在生物防治上的獨(dú)特作用 受到科學(xué)和產(chǎn)業(yè)界高度重視 g a u g l e r 2 0 0 2 s t o c k 2 0 0 5 其中應(yīng)用與研究最多的是斯氏屬線蟲和異小桿屬線 蟲 斯氏屬線蟲在自然環(huán)境中以感染期線蟲的形式存活 該時期的線蟲可在體外 存活好幾個月而不攝入任何食物 并能主動尋找寄主昆蟲 一旦侵入寄主昆蟲 感染期線蟲便在昆蟲體內(nèi)發(fā)育成三齡 四齡幼蟲 進(jìn)而發(fā)育成第一代成蟲 第一 代成蟲為雌雄異體 它們在昆蟲體內(nèi)產(chǎn)卵 當(dāng)食物缺乏時 卵發(fā)育成一齡幼蟲 一齡幼蟲成長為二齡幼蟲后直接進(jìn)入感染期 當(dāng)食物充足時 卵發(fā)育成一齡幼蟲 一齡幼蟲進(jìn)而成長為二齡 三齡 四齡幼蟲 最終成為成蟲 這種周期可循環(huán)3 3 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 一4 次 一旦食物耗盡 便發(fā)生上述相似的過程以感染期線蟲的形式從寄主中出 來 異小桿線蟲屬生活周期與斯氏線蟲屬類似 不同的是其第一代線蟲為雌雄同 體 圖1 1 摘自w o u t s1 9 8 0 是斯氏線蟲屬的一個種 s c a p t e r i s c i 的生活周期 其他種的生活周期和它類似 s h o r tc y c i e f o o d 軾 a 脫 i j 一九憎呦 竺幻 圳 k l f t m n e g g 螄 s t o p i 一 j 2 j 1 劍嬲警 砬竺曼 脯 竺竺 一 咖c y c l ei f o o dp i e n t u 1 圖1 1 斯氏線蟲屬的生活周期 j 1 j 2 j 3 j 4 一齡 二齡 三齡 四齡幼蟲 u 感染期幼蟲 p l 前感染期幼蟲 g 1 g 2 分別為第一 第二代成蟲 f i g 1 ll i f ec y c l eo f s t e i n e r n e m a j l j 2 j 3 j 4 f i r s t s e c o n d t h i r da n df o u r t hs t a g ej u v e n i l e i j i n f e c t i v ej u v e n i l e p i p r e i n f e c t i v ej u v e n i l e g i g 2 f i r s ta n ds e c o n dg e n e r a t i o na d u l t s 1 2 昆蟲病原線蟲共生菌 1 2 1 概況 4 王聞中山大學(xué)碩士論文 2 0 0 9 昆蟲病原線蟲共生菌是一類與昆蟲病原線蟲專一共生的細(xì)菌 屬于變形菌門 p r o t e o b a c t e r i a y 變形菌亞門 y s u b c l a s so fp r o t e o b a c t e r i a 腸桿菌科 e n t e r o b a c t e r i a c e a e 有兩個屬 致病桿菌屬 x e n o r h a b d u s 和發(fā)光桿菌屬 p h o t o r h a b d u s a d a m se ta 1 2 0 0 6 其中致病桿菌屬細(xì)菌與斯氏屬線蟲共生 發(fā)光桿菌屬細(xì)菌與異小桿屬線蟲共生 t h o m a s p o i n a r1 9 7 9 a k h u r s t1 9 8 3 b 致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬細(xì)菌具有的共同特征是 革蘭氏陰性桿菌 不產(chǎn)孢子 兼性厭氧 具有運(yùn)動性 細(xì)胞平均大小為0 8 2 4 1 0p m t h o m a s p o i n a r 1 9 7 9 營化學(xué)有機(jī)營養(yǎng) 具有氧化酶活性 f o r s te ta 1 9 9 7 存在兩種型態(tài) o w u a m a2 0 0 1 不能還原硝酸鹽 f a r m e re ta 1 1 9 8 9 大部分菌株是溶原性 細(xì)菌 在絲裂霉素c 或高溫的誘導(dǎo)下會產(chǎn)生少量的噬菌體和細(xì)菌素 b o e m a r ee t 講 1 9 9 2 不同的是 致病桿菌屬無過氧化氫酶活性 而發(fā)光桿菌屬有過氧化氫 酶活性 能產(chǎn)生熒光 t h o m a s p o i n a r1 9 7 9 1 2 2 致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬的特征 1 2 2 1 致病桿菌屬的特征 不產(chǎn)孢子 桿狀細(xì)胞 o 3 2 2 1 0r t m 革蘭氏染色陰性 兼性厭氧 具有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型 適宜的生長溫度通常是2 8 或低于2 8 一些 菌能在4 0 生長 能以葡萄糖產(chǎn)酸 難以發(fā)酵一些其他的碳水化合物 過氧化 氫酶陰性 硝酸鹽不能被還原為亞硝酸鹽 該屬對用于鑒定腸桿菌科的大部分測 試顯示為陰性 在生長穩(wěn)定期 培養(yǎng)物有兩種型態(tài) 即i 型和l i 型 i 型培養(yǎng)物 能吸收色素 產(chǎn)生抗生素 產(chǎn)生晶狀包涵體 以周生鞭毛運(yùn)動 可以在o 6 一 1 2 的瓊脂中游動 在蛋黃瓊脂中培養(yǎng)能產(chǎn)生透明圈 即具有卵磷脂酶活性 大部分菌株都呈現(xiàn)出d n a 酶和蛋白酶活性 l i 型培養(yǎng)物不能吸收色素 不產(chǎn)生 抗生素 蛋白質(zhì)包涵體和不具有其他一些i 型所擁有的特征 用t w e e n 2 0 檢測 其具有脂酶活性 并且大部分菌株能水解t w e e n 4 0 6 0 8 0 和8 5 l i 型的脂酶 反應(yīng)比i 型強(qiáng) 一些i i 型菌能運(yùn)動 這一特性在i 型菌中較為普遍 t h o m a se t a 1 1 9 7 9 b o e m a r e a k h u r s t1 9 8 8 g i v a u d a ne ta 1 1 9 9 5 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 1 2 2 2 發(fā)光桿菌屬的特征 b o e m a r ee ta 1 1 9 9 3 不產(chǎn)孢子 桿狀細(xì)胞 0 5 2 1 1 0t t m 革蘭氏染色陰性 以周生鞭毛 運(yùn)動 兼性厭氧 同時有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型 適宜的生長溫度為2 8 2 一些菌能在3 7 3 8 2 生長 所有菌株具有過氧化氫酶活性 但不能還原硝酸鹽 對腸桿菌科的大部分特性都顯示為陰性 能水解明膠 大部分菌株能溶解羊血和 馬血 一些菌于2 5 2 在羊血平板上培養(yǎng)可產(chǎn)生不尋常的環(huán)狀噬血圈 所有菌能 水解t w e e n 2 0 即具有脂酶活性 大部分菌能水解t w e e n 4 0 6 0 8 0 和8 5 可 利用葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣 還可利用果糖 d 一甘露糖 麥芽糖 核糖和n 一乙 酰葡萄糖胺產(chǎn)酸 甘油發(fā)酵呈弱陽性 延胡索酸鹽 琥珀酸鹽 葡萄糖胺 l 一 谷氨酸鹽 l 一蘋果酸鹽 l 一脯氨酸和l 一酪氨酸能被作為唯一碳源和能源 型 態(tài)變化發(fā)生在次級培養(yǎng)中 誘發(fā)產(chǎn)生i i 型 型態(tài)i 為自然環(huán)境中分離出來的野生 型 在穩(wěn)定期能產(chǎn)生原生質(zhì)晶體 在細(xì)胞中占很高比例 5 0 8 0 產(chǎn)熒光 通常能在黑暗的環(huán)境中觀察到 在一些分離物中 種間和種內(nèi)的亮度變化只能通 過光度計或閃爍計數(shù)儀才能檢測到 在1 5 0 個已報道的菌株中只有一個分離物不 產(chǎn)熒光 型態(tài)i 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比型態(tài)h 強(qiáng) 型態(tài)i 在n a 板尤其是營養(yǎng)豐富的 培養(yǎng)基中能產(chǎn)生粉紅色 紅色 橙色 黃色或綠色菌落 i i 型很少能產(chǎn)色素或產(chǎn) 生一種不同的色素 型態(tài)i i 在m a c c o n k e y 板上不吸收中性紅 不產(chǎn)抗生素 1 2 3 與昆蟲病原線蟲的共生性 共生菌與昆蟲病原線蟲專一性共生 致病桿菌屬細(xì)菌與斯氏屬線蟲共生 存 在于斯氏屬感染期線蟲特化的腸道囊膜中 b i r de ta 1 1 9 8 3 發(fā)光桿菌屬細(xì)菌與 異小桿屬線蟲共生 存在于異小桿屬感染期線蟲的整個腸道 主要集中于腸道前 端 p o i n a r1 9 9 0 在自然條件下 一種線蟲只攜帶一種共生菌 但某些種類的 共生菌可與幾種線蟲共生 a k h u r s t1 9 8 2 1 9 8 3 a a k h u r s t b o e m a r e19 9 0 感染期線蟲攜帶共生菌通過昆蟲幼蟲的自然開口 如口 肛門和氣孔進(jìn)入昆 蟲體內(nèi) 異小桿線蟲屬的線蟲還可通過節(jié)間膜進(jìn)入 p o i n a r1 9 7 9 b e d d i n g m o l y n e u x1 9 8 2 在昆蟲體內(nèi) 線蟲能夠釋放一些抑制昆蟲免疫系統(tǒng)的物質(zhì) 保 護(hù)共生菌免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊 并將共生菌釋放到昆蟲血腔中 斯氏屬線蟲 通過排便的方式將致病桿菌屬的細(xì)菌釋放出來 m a r t e n se la 1 2 0 0 3 w o u t s1 9 9 1 6 王聞 中山大學(xué)碩士論文 2 0 0 9 而異小桿屬線蟲通過外吐的方式釋放發(fā)光桿菌屬細(xì)菌 c i c h e e n s i g n2 0 0 3 共生菌被釋放后 致病桿菌屬細(xì)菌會以自身細(xì)胞壁中主要成分是脂多糖的內(nèi)毒素 溶解血腔 b r i l l a r de t 講 2 0 0 1 d u n p h y t h u r s t o n19 9 0 發(fā)光桿菌屬細(xì)菌在感染 早期會在血腔中大量繁殖 進(jìn)一步破壞宿主昆蟲的免疫系統(tǒng) 感染后期破壞昆蟲 中腸上皮細(xì)胞 將昆蟲脂肪組織等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì) b o w e ne ta 1 9 9 8 s i l v ae ta 1 2 0 0 2 使昆蟲患敗血癥死亡 此外 在感染后期 兩個屬的細(xì) 菌都會產(chǎn)生一系列的抗微生物物質(zhì) 如細(xì)菌素等 阻遏不同種類的細(xì)菌 酵母和 真菌在蟲尸上繁殖 保證自身繁殖和線蟲的發(fā)育繁殖所需營養(yǎng) a k h t t r s t1 9 8 2 b o e m a r ee ta 1 19 9 7 t h a l e re ta 1 19 9 5 線蟲通過取食共生菌和由脂肪組織等大 分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化來的小分子物質(zhì)在蟲尸內(nèi)繁殖l 一3 代 一旦食物耗盡 線蟲就會 發(fā)育進(jìn)入感染期并攜帶共生菌從蟲尸內(nèi)出來尋找新的宿主 a d a m se ta 1 2 0 0 6 共生菌與線蟲的共生機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn) 雖然還未能從根本上解釋這種 機(jī)制 但近期一些研究結(jié)果表明共生菌與線蟲之間的共生性可能與某些基因有 關(guān) 如c p x r a 基因 當(dāng)該基因突變或缺失時 共生菌很難定植于宿主線蟲中 h e r b e r te ta 1 2 0 0 7 共生菌與線蟲之間種的專一性共生可能與某個單一的基因 座有關(guān) 如xn e m a t o p h i l a 在自然條件下和 c a r p o c a p s a e 專一性共生就與x n e m a t o p h i l a 中的耐i a n i l b 和n i l c 基因有關(guān) 其他菌種因缺乏該類基因而不能 與 c a r p o c a p s a e 共生 通過導(dǎo)入該類基因 其他菌種也能與 c a r p o c a p s a e 共 生 c o w l e se la 1 2 0 0 8 隨著研究的深入以及分子生物學(xué)研究手段的應(yīng)用 從本 質(zhì)上揭示共生菌與線蟲的共生機(jī)制成為可能 1 2 4 型變 致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬細(xì)菌存在型變現(xiàn)象 產(chǎn)生兩種型態(tài) 分別為i 型 或 初生型 和1 i 型 或次生型 a k h u r s t1 9 8 0 d y b v i g1 9 9 3 這兩種型態(tài)都能從 感染期線蟲中分離得到 e h l e r se ta 1 1 9 9 0 但是線蟲更傾向于攜帶初生型 因 為初生型更能保證線蟲的繁殖 提供線蟲繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì) s m i g i e l s k ie t a 19 9 4 v o l g y ie ta 1 19 9 8 初生型更適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境 而次生型更適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán) 境 s m i g i e l s k ie ta 1 1 9 9 4 此外 有些共生菌還會出現(xiàn)其他的型態(tài) g e r r i t s e ne t a 1 9 9 2 初生型與次生型的主要區(qū)別見表1 1 o w u a m a2 0 0 1 7 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 表1 1 昆蟲病原線蟲共生菌初生型與次生型的比較 t a b l e1 1p h a s ec h a r a c t e r so fs y m b i o t i c a lb a c t e r i ao fe p n s 型變這一現(xiàn)象在多種細(xì)菌中都會發(fā)生 如沙門氏菌 s a l m o n e l l as p p 因?yàn)?一段染色體片段的倒置產(chǎn)生兩種不同鞭毛類型 b r u i s te t 講 1 9 8 4 l i n o 甜a 1 9 8 3 鏈霉菌 s t r e p t o m y c e ss p p 會因?yàn)榛蛉笔Щ蜣D(zhuǎn)座子的插入而發(fā)生型變 這些型變的發(fā)生與基因的變化密切相關(guān) d y s o ne t 口 1 9 8 7 l e b l o n de ta i 1 9 8 9 但是 昆蟲病原線蟲共生菌的型變并不是由于基因的變化所致 通過對兩種型態(tài) 的共生菌d n a 圖譜分析 發(fā)現(xiàn)兩型菌d n a 具有1 0 0 的同源性 a k h u r s t b o c m a r e1 9 9 4 這種型變也不是外源基因如質(zhì)粒引起的 c o u c h ee ta 1 9 8 7 l e c l e r c b o c m a r e1 9 9 1 s m i g i e l s k i 等 1 9 9 4 研究發(fā)現(xiàn) 環(huán)境因子可增強(qiáng)共 生菌的型變 如營養(yǎng) 氧氣和滲透壓等 靜止培養(yǎng)和厭氧罐培養(yǎng)更容易產(chǎn)生型變 b o c m a r e a k h u r s t1 9 9 0 a k h u r s t1 9 8 0 低滲透壓更容易引起型態(tài)i 轉(zhuǎn)變?yōu)樾?態(tài)i i k r a s o m i l o s t e r f e l d1 9 9 5 這些研究表明共生菌的型變可能與基因無關(guān) 而可能與一些調(diào)控蛋白有關(guān) 是一種外在的調(diào)控 v a nd e rw o u d ee ta 1 9 9 6 h e n d e r s o n 甜a 1 9 9 9 具體的型變機(jī)制還需要通過進(jìn)一步研究才能最終闡明 s 王聞中山大學(xué)碩士論文 1 2 5 致病性 共生菌與線蟲的共生通常是它具有致病性的前提 a k h u r s t1 9 8 2 g e r r i t s e n s m i t s1 9 9 3 共生菌被感染期線蟲攜帶進(jìn)入昆蟲體內(nèi) 通常在侵入的5 小時內(nèi)被 釋放到血腔中 釋放之初共生菌被昆蟲的血細(xì)胞包被 但隨后共生菌使血細(xì)胞喪 失活性 b r e h e l i ne 耐 1 9 9 3 這時細(xì)菌就以血腔中的物質(zhì)為營養(yǎng)進(jìn)行繁殖 破 壞昆蟲血腔 產(chǎn)生多種代謝物質(zhì) 在4 8 小時內(nèi)殺死昆蟲并保護(hù)昆蟲尸體不被其 他微生物侵入 以保證線蟲生長發(fā)育所需營養(yǎng) b a l c e r z a k19 9 1 a k h u r s t d u n p h y 1 9 9 3 通過研究發(fā)現(xiàn) 昆蟲病原線蟲共生菌的致病性與多種因素有關(guān) 如共生菌對 昆蟲免疫的防御機(jī)制 共生菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素 外毒素 一些胞外酶及其他次生代 謝物等對昆蟲的殺傷作用 王立霞等2 0 0 0 1 共生菌對昆蟲免疫的防御機(jī)制 共生菌能產(chǎn)生一些活性溶血因子破壞昆蟲血腔中具有免疫活性的細(xì)胞 如粒細(xì) 胞 血細(xì)胞等 b r i l l a r de ta 1 2 0 0 1 從而削弱昆蟲的細(xì)胞免疫 還可合成一些化 合物抑制昆蟲宿主細(xì)胞中磷脂酶a 2 的活性 導(dǎo)致類二十烷酸的合成受阻 從而 抑制結(jié)節(jié)形成 避免被宿主細(xì)胞清除 p a r ke ta 1 2 0 0 3 a b 2 0 0 4 2 共生菌產(chǎn) 生的內(nèi)毒素 外毒素 一些胞外酶及其他次生代謝物等對昆蟲有殺傷作用 b o w e n 等 19 9 8 發(fā)現(xiàn) t c 類殺蟲毒素對鱗翅目昆蟲煙草天眥a n d u c as e x l a 的初孵幼蟲 具有e l 服殺蟲活性 我室 崔龍等2 0 0 3 從xn e m a t o p h i l u sb p 品系中克隆出具 有殺蟲活性的x p t 毒素 g i a n n o u l i s 等 2 0 0 8 發(fā)現(xiàn)共生菌的細(xì)胞壁成分脂多糖主 要是類脂a 能夠促進(jìn)血細(xì)胞破壞 加速細(xì)菌的釋放 具有抑制和增強(qiáng)多酚氧化酶 的雙重作用 k h a n d e l w a l 等 2 0 0 3 2 0 0 4 發(fā)現(xiàn) n e m a t o p h i l u s 會分泌一種外膜泡 其中含有多種蛋白質(zhì)和多肽 對昆蟲幼蟲具有口服毒性 同時從該菌外膜囊中分 離出1 7k d a 的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)亞基 它可粘附在血細(xì)胞表面 使細(xì)胞凝集 j o s h i 2 0 0 8 等也從xn e m a t o p h i l u s 夕l 膜囊中分離出5 8k d ag r o e l 同源蛋白 對昆蟲 幼蟲具有口服毒性 還有很多共生菌代謝產(chǎn)物具有相似的功能 它們在殺蟲方面的作用 引起研 究者們的廣泛關(guān)注 通過對這些代謝產(chǎn)物的研究 可以開發(fā)出一些有應(yīng)用價值的 抗生素農(nóng)藥 從而拓寬生物農(nóng)藥的應(yīng)用范圍 在生物防治上發(fā)揮重要作用 9 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 1 2 6 分類概況 1 2 6 1 共生菌分類研究歷史 1 9 5 9 年 d u t 坶發(fā)現(xiàn)線曲v e o a p l e c t a n ac a r p o c a p s a ed d 1 3 6 現(xiàn)名 s t e i n e r n e m a c a r l c a p s a e 體內(nèi)存在一株具有抑菌活性和防止昆蟲尸體腐敗的細(xì)菌 但他當(dāng)時 并沒有對其進(jìn)行描述和命名 直至1 1 9 6 5 年 該菌的形態(tài)及生理生化特征才由p i o n a r 和t h o m a s 描述 通過他們的研究 該菌被歸在腸桿菌科 e n t e r o b a c t e f i a e e a e 無 色桿菌 a c h r o m o b a c t e r 屬 被命名為a c h r o m o b a c t e rn e m a t o p h i l u s 19 7 4 年 根 據(jù)h e n d r i e 等的描述 無色桿菌屬 a c h r o m o b a c t e r 被取消 其屬內(nèi)的菌株被轉(zhuǎn) 移到產(chǎn)堿桿菌屬 a l c a l i g e n e s 或其他屬 而共生菌卻沒有找到合適的歸屬 沒 有合法的名字 這種狀況一直持續(xù)至1 j 1 9 7 9 年 這年t h o m a s 和p o i n a r t 自r n t e r n a t i o n a l j o u r n a lo f s y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y 現(xiàn)名 i n t e r n a t i o n a lj o u r n a lo f s y s t e m a t i ca n d e v o l u t i o n a r ym i c r o b i o l o g y 上發(fā)表了一篇論文 其中詳細(xì)描述了共生菌的形態(tài)和 生理生化特征 發(fā)現(xiàn)其與腸桿菌科的其他屬種的大部分生理生化特征相同 只有 少數(shù)特征有明顯差異 因此他們將共生菌歸在腸桿菌科下的一個新屬 命名為致 病桿菌屬 x e n o r h a b d u s 當(dāng)時僅包含兩個種xn e m a t o p h i l a 和 l u m i n e s c e n s 也 就在這時他們認(rèn)識到xn e m a t o p h i l a 只能從線蟲屬n e o a p l e c t a n a d p 分離得到 而x l u m i n e s c e n s 只能從線蟲屬h e t e r o r h a b d i t i s 中分離獲得 1 9 8 3 年 a k h u r s t 1 9 8 3 b 根據(jù)形態(tài)和生理生化特征以及對d n ag c 含量的測定 將xn e m a t o p h i l a 下的菌株 分成3 個亞種 xn e m a t o p h i l as u b s p n e m a t o p h i l a xn e m a t o p h i l a 蛐b s p p o i n a n i 和xn e m a t o p h i l as u b s p b o v i e n i i 隨著對共生菌研究的逐步深入和更多數(shù)據(jù)的積 累以及d n a d n a 雜交技術(shù)在共生菌種間分類上的應(yīng)用 共生菌的分類研究取 得了很大的進(jìn)展 a k h u r s t 等 19 8 8 采用數(shù)值分類的方法將xn e m a t o p h i l a 的亞 種提升為種 此時娩加砌6 訪 洧5 個種 xn e m a t o p h i l a xp o i n a r i i zb o v i e n i i x b e d d i n g i i j f l d xl u m i n e s c e n s 由于xl u m i n e s c e n s e j x e n o r h a b d u s 屬的其他種之間 存在某些表型特征的明顯差異 b o e m a r ee t a 1 9 9 3 而且通過d n a d n a 雜交 分析發(fā)現(xiàn) xl u m i n e s c e n s 與x e n o r h a b d u s 屬的其他種之間存在比較低的同源性 因此b o e m a r e 等將其t a x e n o r h a b d u s 屬中分出來 獨(dú)立成為一個新屬p h o t o r h a b d u s 1 0 王聞中山大學(xué)碩士論文 1 262 共生菌分類研究現(xiàn)狀 雖然核苷酸編碼分析 e h l e r se ta 1 1 9 8 8 以及1 6 sr d n a 序列分析顯示 r a i n e y e t 講 1 9 9 5 共生菌應(yīng)歸在y 變形菌亞門 但是對于共生菌的歸屬仍 然存在 些分歧 j a n s e 和s m i t s 1 9 9 0 通過對共生菌細(xì)胞全脂肪酸分析發(fā)現(xiàn) 共生菌細(xì)胞中存在腸桿菌科很少含有的支鏈和羥基化的脂肪酸 而且在某些形態(tài) 特征上也與腸桿菌科存在差異 因此對將其放在腸桿菌科下表示質(zhì)疑 腸桿菌科 的屬種具有還原硝酸鹽活性和過氧化氫酶活性 f a r m e r 1 9 8 4 1 9 8 9 等根據(jù)致 病桿菌屬不具有這些活性而對將其歸屬腸桿菌科產(chǎn)生懷疑 同時他們還注意到發(fā) 光桿菌屬也不具有硝酸鹽還原活性 而且該屬還能產(chǎn)生色素和熒光 這些特征在 腸桿菌科中是很少見的 總d n a 雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 x e n o r h a b d u s 屬和大腸桿菌 ec o l d 的總d n a 僅存在4 的同源性 f a r m e r1 9 7 9 但在某些功能基因上 卻具有很高的同源性 如 編碼p n p 和r p s o 蛋白的d n a 序列與ec o l i 的編碼區(qū)具 有7 5 的同源性 此外 它們在編碼序列的相似性 基因組的調(diào)控以及編碼蛋白 的特性等方面也存在較大的一致性 這就說明在腸n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 中的 許多基因與ec o l i 具有很高的同源性 僅在非編碼區(qū)之間存在差異 雖然共生茵 在某些方面與腸桿菌科的其他成員存在差異 但將其作為腸桿菌科下的一類特殊 群體得到了普遍承認(rèn) 伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊 第九版也將其歸在腸桿菌科下 龐在堂 楊懷文2 0 0 3 不僅共生菌歸屬于腸桿菌科存在爭論 而且將娩n o r h a b d u s 分為兩個屬也存 在一些分歧 b o e m a r e 等 1 9 9 3 通過d n a d n a 雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) xl u m i n e s c e n s 與x e n o r h a b d u s 屬的其他菌株的同源性不超過2 0 再結(jié)合表型特征 如生物熒 光 過氧化氫酶活性以及它不能和斯氏線蟲屬共生的特點(diǎn) 將xl u m i n e s c e n s 從致 病桿菌屬中分離出來而獨(dú)立成為一個屬 而s t a c k e b r a n d t 和g o e b e l 1 9 9 4 指出 d n a d n a 雜交適用于種的分類而不適用于屬 r a i n e y 等 1 9 9 5 通過1 6 sr d n a 序列的比較分析 發(fā)現(xiàn)很難將共生菌劃歸為兩個屬 這些分歧的產(chǎn)生可能是由于 所選方法本身存在缺陷所致 這就要求我們要采用多種方法綜合分析 如對于1 6 s r d n a 在共生菌分類上存在的一些不足 我們可通過發(fā)掘一些可靠的分子標(biāo)記來 彌補(bǔ)它的缺陷 同時不斷增加兩個屬的菌株序列數(shù) 得到更加可靠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系 因此 在細(xì)菌分類上要結(jié)合形態(tài)和生理生化特性 1 6 sr d n a 全序列分析和 致病桿菌屬三潛在新種的鑒定與描述 d n a d n a 雜交結(jié)果 才能得出可靠的分類結(jié)果 s t a c k e b r a n d te ta 2 0 0 2 目前 根據(jù)共生菌形態(tài)和生理生化特性 1 6 sr d n a 全序列分析 d n a 分型 以及d n a d n a 雜交結(jié)果 把昆蟲病原線蟲共生菌劃歸為兩個屬 即 x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 其鋤o r h a b d u s 中已定名的種有2 0 它們是x n e m a t o p h i l a xp o i n a r i i xb o v i e n i i xb e d d i n g i i x j a p o n i c a xi n d i c a x b u d a p e s t e n s i s xe h l e r s i i xi n n e x i xs z e n t i r m a i i xc a b a n i l l a s i i xd o u c e t i a e xg r i f f i n i a e xh o m i n i c k i i xk o p p e n h o e f e r i xk o z o d o i i xm a u l e o n i i x m i r a n i e n s i s xr o m a n i i 和xs t o c k i a e p h o t o r h a b d u s 中已定名的種有3 個 s a u xe ta 1 19 9 9 它們匙l u m i n e s c e n s pt e m p e r a t a 和pa s y m b i o t i c a 其中pl u m i n e s c e n s 有五個亞種 e p rl u m i n e s c e n ss u b s p 1 u m i n e s c e n s 旦l u m i n e s c e n ss u b s p a k h u r s t i i pl u m i n e s c e n ss u b s p 1 a u m o n d i i pl u m i n e s c e n ss u b