與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化.doc

與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化 與耐藥機(jī)制有關(guān)的藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化操作。前言，細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)全球性的問(wèn)題，已對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。耐藥細(xì)菌感染導(dǎo)致病人住院時(shí)間延長(zhǎng)、費(fèi)用增加、死亡率增高，同時(shí)也給臨床醫(yī)生抗感染治療帶來(lái)困難。因此，檢測(cè)細(xì)菌耐藥機(jī)制是當(dāng)今細(xì)菌學(xué)的一個(gè)重要課題，也是正確指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使用抗生素的重要依據(jù)。在細(xì)菌耐藥機(jī)制檢測(cè)方面，包括分子生物學(xué)等許多實(shí)驗(yàn)方法被廣泛運(yùn)用。但這些方法的技術(shù)要求普遍較高，大多數(shù)被用于基礎(chǔ)研究。真正應(yīng)用到臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)方法，要求操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，試驗(yàn)成本不能太高。我國(guó)衛(wèi)生部于1998年規(guī)定：我國(guó)藥敏試驗(yàn)暫按clsi歷年頒布的所有微生物藥敏試驗(yàn)文件作為部頒標(biāo)準(zhǔn)，此決定至今未改變。本節(jié)所講內(nèi)容，主要是clsi（m100-s22）文件推薦的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法。也是我們從事臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)人員必須掌握的內(nèi)容。包括兩個(gè)內(nèi)容，第一個(gè)就是革蘭陽(yáng)性球菌耐藥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目。第二個(gè)內(nèi)容是革蘭氏陰性發(fā)酵細(xì)菌以及其他細(xì)菌的耐藥機(jī)制。首先介紹青霉素酶的檢測(cè)。檢測(cè)青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和顯色頭孢菌素法等，臨床應(yīng)用較多的是顯色頭孢菌素法。其原理是將受菌株與頭孢硝噻吩作用一段時(shí)間后，如受試菌株產(chǎn)生青霉素酶，則可水解頭孢硝噻吩的 - 內(nèi)酰胺環(huán)，產(chǎn)生由黃色向紅色轉(zhuǎn)變的顏色反應(yīng)，即為青霉素酶試驗(yàn)陽(yáng)性。頭孢硝噻吩法是目前檢測(cè)嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌屬產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶的最好方法，具有快速、靈敏和簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但價(jià)格相對(duì)較昂貴。方法，檢測(cè)時(shí)用1滴無(wú)菌水將nitrocefin紙片濕潤(rùn)，將受試菌直接涂抹于濕潤(rùn)后的nitrocefin紙片上，即可觀察顏色的反應(yīng)，產(chǎn)生紅色者為產(chǎn)酶陽(yáng)性。質(zhì)控菌株，陰性株為金黃色葡萄球菌atcc25923；陽(yáng)性株為金黃色葡萄球菌atcc29213。注意事項(xiàng)，目前實(shí)驗(yàn)室多采用bd公司生產(chǎn)的非頭孢硝噻吩顯色頭孢菌素紙片，這個(gè)紙片進(jìn)行 - 內(nèi)酰胺酶測(cè)試，效果稍好于頭孢硝噻吩，可降低金黃色葡萄球菌陽(yáng)性結(jié)果的反應(yīng)時(shí)間。葡萄球菌可誘導(dǎo) 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。這項(xiàng)內(nèi)容呢是 clsim100 s21 。方法，如果青霉素對(duì)葡萄球菌的mic值小于等于0.12每毫升微克的時(shí)候 或者抑菌環(huán)直徑大于等于 29毫米 的時(shí)候，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行可誘導(dǎo) - 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。將待檢菌株傳代到血瓊脂平板或者是mha瓊脂平板上，用苯唑西林紙片或者是頭孢西丁紙片作為誘導(dǎo)劑，具體方法可參照紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，大氣環(huán)境孵育16到18小時(shí)后，檢測(cè)抑菌圈周邊細(xì)菌的產(chǎn)酶情況?？烧T導(dǎo) - 內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陽(yáng)性的菌株，應(yīng)報(bào)告對(duì)不耐酶青霉素耐藥。質(zhì)控菌株，陰性株用金黃色葡萄球菌 atcc25923；陽(yáng)性株用金黃色葡萄球菌 atcc29213。cxim100 s22 文件中增加了用10單位青霉素紙片作為誘導(dǎo)劑檢測(cè)葡萄球菌可誘導(dǎo) 內(nèi)酰胺酶的方法，具體方法同苯唑西林和頭孢西丁紙片法。第二個(gè)內(nèi)容介紹甲氧西林耐藥葡萄球菌，也就是mrs檢測(cè)。檢測(cè)meca基因和其表達(dá)的青霉素結(jié)合蛋白 2a ，是預(yù)報(bào)葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥最準(zhǔn)確的方法，它也被用于證實(shí)從嚴(yán)重感染病人分離的葡萄球菌紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果。攜帶meca 基因或者是產(chǎn)pbp 2a 的葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥。不攜帶meca或不產(chǎn)pbp 2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。由于罕見(jiàn)的非meca基因介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制，在紙片擴(kuò)散法確定為苯唑西林耐藥時(shí)，應(yīng)加測(cè)苯唑西林mic，若mic值大于等于4個(gè)每毫升微克，即使meca基因和pbp 2a 檢測(cè)為陰性，也應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥?？捎眉埰瑪U(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感性。苯唑西林紙片擴(kuò)散法篩選試驗(yàn)，方法，使用含1個(gè)微克的苯唑西林紙片，而不是甲氧西林或萘夫西林來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性。用直接菌落懸液法制備接種物，配成0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛染?，接種mh瓊脂平板，待瓊脂表面的水份干后，貼苯唑西林紙片，于33至35度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)，檢測(cè)抑菌圈直徑。結(jié)果判斷，按clsi解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于10個(gè)毫米為耐藥，大于 13毫米 為敏感。質(zhì)控菌株用金黃色葡萄球菌atcc25923。注意事項(xiàng)，試驗(yàn)溫度超過(guò)35度不能檢測(cè)出mrs；孵育時(shí)間不能少于24小時(shí)；在透射光下仔細(xì)觀察苯唑西林紙片周圍抑菌圈內(nèi)有沒(méi)有細(xì)小菌落或者輕微彌漫生長(zhǎng)，如果有生長(zhǎng)提示苯唑西林耐藥；如果金黃色葡萄球菌紙片擴(kuò)散法結(jié)果中，結(jié)果為中介時(shí)也就是直徑在11到 12毫米 時(shí)，或者 mic 為0.5到2個(gè)每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶陰性葡萄球菌引起嚴(yán)重感染時(shí)，必須進(jìn)行meca基因或者是pbp 2a 測(cè)定，或者是頭孢西丁紙片試驗(yàn)、苯唑西林mic試驗(yàn)或者是苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗(yàn)，來(lái)確定是否為mrs菌株，選擇其中一種試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)用的mh瓊脂中含苯唑西林每毫升6個(gè)微克，并添加有4%的氯化鈉，或者是每毫升0.68摩爾。方法，直接菌落懸浮液獲得0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，使用1微升接種環(huán)蘸取菌液，在平板上涂成直徑10到 15毫米 斑點(diǎn)。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點(diǎn)或劃滿四分之一區(qū)域。將瓊脂平板置33到35度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)后用透射光檢查有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，任何生長(zhǎng)都表示對(duì)苯唑西林耐藥。注意事項(xiàng)，試驗(yàn)溫度超過(guò)35度不能檢測(cè)出mrs；為從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測(cè)出甲氧西林耐藥菌株，需將瓊脂平板孵育48小時(shí)。質(zhì)控菌株，敏感株atcc29213；耐藥株atcc43300。頭孢西丁紙片法。方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種mh瓊脂平板，使用含30微克頭孢西丁紙片，33到35度大氣環(huán)境孵育。金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌孵育16到18小時(shí)報(bào)告結(jié)果，凝固酶陰性葡萄球菌除路鄧葡萄球菌以外要孵育24小時(shí)，如耐藥則在孵育18小時(shí)后可報(bào)告結(jié)果。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判讀，頭孢西丁對(duì)金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于 21毫米 時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，大于等于 22毫米 應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。除路鄧葡萄球菌外其他凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于 24毫米 時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，大于等于 25毫米 應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。注意事項(xiàng)，試驗(yàn)溫度超過(guò)35度不能檢測(cè)出mrs；檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥性，頭孢西丁紙片試驗(yàn)是首選方法，因?yàn)轭^孢西丁較苯唑西林的敏感性高。meca基因及pbp 2a 檢測(cè)，方法，可采用乳膠凝集或分子生物學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判斷，meca基因或pbp 2a 檢測(cè)陽(yáng)性的葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林和甲氧西林耐藥。不攜帶meca基因或不產(chǎn)pbp 2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林和甲氧西林敏感。質(zhì)控菌株，meca陰性用atcc29213；meca陽(yáng)性用atcc43300。苯唑西林mic試驗(yàn)方法，可采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法或etest等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判讀，若苯唑西林mic值大于等于每毫升4個(gè)微克，即使meca基因和pbp 2a 檢測(cè)為陰性，也應(yīng)報(bào)苯唑西林耐藥?？赏瑫r(shí)用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感性。注意事項(xiàng)，一，試驗(yàn)溫度超過(guò)35度不能檢測(cè)出mrs；二，孵育時(shí)間不能少于24小時(shí)；三，在透射光下觀察瓊脂上有無(wú)細(xì)小菌落或輕微彌漫生長(zhǎng)，如果有生長(zhǎng)提示苯唑西林耐藥。質(zhì)控菌株，敏感株atcc29213；耐藥株 a tcc43300。mrs的臨床報(bào)告，對(duì)于甲氧西林耐藥的葡萄球菌即 m rs，應(yīng)報(bào)告對(duì)所有 - 內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而不考慮這些藥物的體外試驗(yàn)結(jié)果是否敏感。因?yàn)榇蠖鄶?shù)文獻(xiàn)報(bào)告了mrs感染對(duì) - 內(nèi)酰胺類治療反應(yīng)差或者沒(méi)有令人信服的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)這些藥的臨床效果。萬(wàn)古霉素耐藥葡萄球菌的篩選試驗(yàn)，一，紙片篩選法；方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種mh瓊脂平板，使用含30微克萬(wàn)古霉素紙片，35度加減2度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)。結(jié)果判斷，clsi m100-s19中已經(jīng)取消了萬(wàn)古霉素對(duì)葡萄球菌的紙片擴(kuò)散法判斷折點(diǎn)。紙片擴(kuò)散法只能檢測(cè)vana基因型的萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌，這種菌株無(wú)抑菌圈，應(yīng)確認(rèn)該菌株的鑒定結(jié)果。對(duì)未測(cè)定萬(wàn)古霉素mic，而萬(wàn)古霉素抑菌圈直徑大于等于 7毫米 的葡萄球菌，不能報(bào)告其對(duì)萬(wàn)古霉素敏感。注意事項(xiàng)，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)萬(wàn)古霉素結(jié)果不可靠。紙片擴(kuò)散法不能區(qū)分萬(wàn)古霉素敏感，也就是mic范圍在0.5至2個(gè)微克每毫升和萬(wàn)古霉素敏感性減低的菌株，也就是mic值在4到8每毫升微克。萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌mic大于16每毫升微克，在萬(wàn)古霉素紙片周圍僅見(jiàn)輕微生長(zhǎng)。因此，用含每毫升6個(gè)微克萬(wàn)古霉素的bhi 瓊脂平板篩選平板，可提高檢測(cè)萬(wàn)古霉素中介和萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。瓊脂篩選法，用含每毫升6個(gè)微克萬(wàn)古霉素腦心浸液瓊脂對(duì)耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌進(jìn)行篩選試驗(yàn)。方法，直接菌落懸液獲得0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋褂梦⒘课芪【?0個(gè)微升，點(diǎn)種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余的菌液，在平板上涂成直徑10 到 15毫米 斑點(diǎn)或在部分區(qū)域劃線接種，35加減2度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)，觀察結(jié)果。結(jié)果判斷，在透射光下仔細(xì)觀察，如果點(diǎn)種位置出現(xiàn)1個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性減低。注意事項(xiàng)，用含每毫升6個(gè)微克萬(wàn)古霉素bhi瓊脂篩選平板，可提高檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。 但瓊脂篩選法不能可靠檢測(cè)visa，這是葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素中介的菌株，mic值等于4個(gè)每毫升微克菌株不生長(zhǎng)。質(zhì)控，敏感株 atcc29212；耐藥株 atcc51299。萬(wàn)古霉素mic確認(rèn)試驗(yàn)。方法，可采用瓊脂或肉湯稀釋法或etest等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判斷，金黃色葡萄球菌mic值小于等于每毫升2個(gè)微克為敏感，mic值在4到8每毫升微克為敏感性降低，mic值大于16每毫升微克為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌mic值小于等于每毫升4個(gè)微克為敏感，mic值在4到16每毫升微克為敏感性降低，mic值大于等于32每毫升微克為耐藥。注意事項(xiàng)，檢測(cè)到萬(wàn)古霉素mic值大于等于每毫升8個(gè)微克的金黃色葡萄球菌，或者是mic值大于等于每毫升32微克的凝固酶陰性葡萄球菌，應(yīng)送參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步確認(rèn)。誘導(dǎo)性克林霉素耐藥試驗(yàn)檢測(cè)，耐藥機(jī)制，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯耐藥的葡萄球菌或者是 - 溶血鏈球菌，可能存在有結(jié)構(gòu)性或者是誘導(dǎo)性對(duì)克林霉素的耐藥，或者只對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥。檢測(cè)方法，誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)又稱“d”抑菌環(huán)試驗(yàn)。配養(yǎng)基，用 mh 瓊脂，加或不加5%的綿羊血。接種物，直接菌懸液法，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度。孵育，35度加減2度，大氣環(huán)境16到18小時(shí)。方法，貼紅霉素紙片和克林霉素紙片，紙片間距離15至26毫米。結(jié)果判斷，若靠近紅霉素紙片一側(cè)克林霉素的抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，也就是稱為“d”抑菌環(huán)，則菌株存在克林霉素誘導(dǎo)耐藥，應(yīng)報(bào)告對(duì)“克林霉素耐藥”。在報(bào)告單中可注明“經(jīng)誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)推測(cè)此菌株對(duì)克林霉素耐藥，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若無(wú)“截平”現(xiàn)象，則應(yīng)報(bào)告菌株對(duì)克林霉素敏感。質(zhì)控菌株，陰性對(duì)照，金黃色葡萄球菌 atcc 25923或者是金黃色葡萄球菌 atcc baa-976。陽(yáng)性對(duì)照，金黃色葡萄球菌 atcc baa-977。金黃色葡萄球菌，高水平莫匹羅星耐藥性檢測(cè)。紙片擴(kuò)散法，方法，用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種mh瓊脂平板，使用含200微克莫匹羅星紙片，35度加減2度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)。在透射光下仔細(xì)觀察紙片周圍抑菌圈內(nèi)有無(wú)細(xì)小菌落或輕微彌漫生長(zhǎng)，如果有生長(zhǎng)提示莫匹羅星耐藥。結(jié)果判讀，無(wú)抑菌圈等于高水平莫匹羅星耐藥； 有抑菌圈等于非高水平莫匹羅星耐藥。質(zhì)控菌株，atcc25923莫匹羅星抑菌圈直徑在29至38毫米；atcc baa1708無(wú)抑菌圈。肉湯微量稀釋法，用調(diào)節(jié)陽(yáng)離子m-h肉湯配成單一的莫匹羅星，也就是每毫升256微克試驗(yàn)孔。方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的肉湯微量稀釋法試驗(yàn)條件進(jìn)行接種，在35加減2度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)。結(jié)果判讀，在透射光下進(jìn)行判讀。如果有生長(zhǎng)等于高水平莫匹羅星耐藥；無(wú)生長(zhǎng)等于非高水平莫匹羅星耐藥。質(zhì)控菌株atcc 29213， mic 值應(yīng)該在0.06至0.5每毫升微克；atcc 29212 mic 值應(yīng)該在16到128每毫升微克；atcc baa1708應(yīng)該在256每毫升微克生長(zhǎng)。解釋，盡管clsi m100-s22中未提供莫匹羅星的折點(diǎn)，但紙片擴(kuò)散法和mic篩選試驗(yàn)?zāi)茏R(shí)別出莫匹羅星mic值大于512每毫升微克的菌株即高水平耐藥株。腸球菌對(duì)青霉素或者氨芐西林耐藥性檢測(cè)。腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林耐藥是因?yàn)楫a(chǎn)生了低親和力的青霉素結(jié)合蛋白，個(gè)別菌株是產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶。紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)可準(zhǔn)確測(cè)定pbp改變的菌株，但對(duì)產(chǎn) - 內(nèi)酰胺酶的菌株結(jié)果不可靠。此類菌株應(yīng)檢測(cè) - 內(nèi)酰胺酶。高水平氨基糖苷類耐藥腸球菌的檢測(cè)。方法，用高濃度慶大霉素也就是每片120微克，或者是鏈霉素每片300微克紙片可以篩選出此類耐藥性。結(jié)果判斷，無(wú)抑菌圈為耐藥，抑菌圈直徑大于等于 10毫米 時(shí)表示為非高水平耐藥。抑菌圈直徑在7到 9毫米 的菌株應(yīng)使用稀釋篩選試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于慶大霉素，稀釋法的mic值大于每毫升500微克即為耐藥。對(duì)于鏈霉素，微量肉湯稀釋法的mic值大于每毫升1000微克，瓊脂稀釋法的mic值大于每毫升2000微克，即為耐藥。hlar的臨床意義：對(duì)高濃度氨基糖苷類敏感，表示氨基糖苷類與作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株將具有協(xié)同作用，也是敏感的。對(duì)氨基糖苷類高水平耐藥，表示當(dāng)青霉素或糖肽類與一種氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株不會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效果。萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌的檢測(cè)。要想使用紙片擴(kuò)散法準(zhǔn)確檢測(cè)出耐萬(wàn)古霉素腸球菌，需要將平板孵育滿24小時(shí)而不是16到18小時(shí),借透射光仔細(xì)檢查抑菌圈內(nèi)有無(wú)細(xì)小菌落或彌漫生長(zhǎng)。紙片擴(kuò)散法結(jié)果為中介度也就是在8到 16毫米 時(shí)應(yīng)選mic值?？刹捎铆傊♂尫?、肉湯稀釋法或etest等方法進(jìn)行mic值的檢測(cè)。篩選試驗(yàn)，用每毫升6個(gè)微克萬(wàn)古霉素的腦心浸液瓊脂篩選試驗(yàn)，35加減2度，大氣環(huán)境孵育24小時(shí)，點(diǎn)種位置出現(xiàn)1個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性減低。青霉素耐藥肺炎鏈球菌的檢測(cè)。一，肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制，青霉素耐藥肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變，改變后使pbp與青霉素的結(jié)合力下降，因而導(dǎo)致耐藥。二，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)。方法，使用含1個(gè)微克的苯唑西林紙片而不是青霉素紙片，來(lái)檢測(cè)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性。培養(yǎng)基用 mh 瓊脂加5%綿羊血。接種物，使用綿羊血瓊脂平板上過(guò)夜生長(zhǎng)的菌落制備接種物，采用直接菌落懸液法，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。孵育，35加減2度，在5%二氧化碳環(huán)境，孵育20到24小時(shí)。結(jié)果判讀，苯唑西林大于等于 20毫米 對(duì)青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19毫米 時(shí)，應(yīng)測(cè)定青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松和美羅培南的mic值。質(zhì)控菌株用肺炎鏈球菌 atcc 49619 。結(jié)果報(bào)告，當(dāng)苯唑西林抑菌圈大于等于 20毫米 時(shí)可報(bào)告肺炎球菌對(duì)青霉素敏感，并同時(shí)可報(bào)告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感，而不需要再檢測(cè)這些藥物的敏感性。當(dāng)苯唑西林的抑菌圈直徑小于等于 19毫米 的菌株應(yīng)當(dāng)檢測(cè)青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松及美羅培南的mic值，因?yàn)橐志h(huán)直徑小于等于 19毫米 時(shí)，可以發(fā)生在青霉素耐藥、中介或敏感的某些菌株中，不能僅僅根據(jù)苯唑西林的抑菌環(huán)直徑小于等于 19毫米 ，就報(bào)告對(duì)青霉素耐藥或中介。肉湯稀釋法檢測(cè)。方法，用加2%到5%融血馬血的調(diào)節(jié)陽(yáng)離子m-h肉湯做肺炎鏈球菌的稀釋法藥敏試驗(yàn)，35加減2度，大氣環(huán)境孵育20到24小時(shí)，瓊脂稀釋法應(yīng)放在二氧化碳環(huán)境下孵育。結(jié)果判讀，一，口服青霉素v，青霉素mic值小于等于0.06每毫升微克時(shí)為敏感， mic 值大于等于每毫升2個(gè)微克為耐藥。二，青霉素注射液，腦脊液分離株，青霉素mic值小于等于0.06每毫升微克為敏感， mic 值大于等于0.12每毫升微克為耐藥。非腦脊液分離株，青霉素mic值小于等于每毫升2個(gè)微克為敏感，mic值大于等于每毫升8個(gè)微克為耐藥。質(zhì)控菌株，肺炎鏈球菌atcc 49619。第二部分， - 內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的革蘭陰性發(fā)酵細(xì)菌的耐藥機(jī)制檢測(cè)。革蘭陰性發(fā)酵細(xì)菌對(duì) - 內(nèi)酰胺類抗生素的主要耐藥機(jī)制，一，產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶水解滅活藥物；二，細(xì)菌外膜通透性下降；三，主動(dòng)泵出藥物。其中產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性發(fā)酵細(xì)菌對(duì) - 內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。臨床上重要的 - 內(nèi)酰胺酶有以下幾種：一，超廣譜 - 內(nèi)酰胺酶，也就是esb l ；二，頭孢菌素酶，也就是ampc酶；三，碳青霉烯酶，主要包括kpc酶。超廣譜 - 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。clsi根據(jù)pk-pd性能評(píng)價(jià)和有限的臨床資料，首次于2010年1月也就是 clsi m100-s20文件修訂了頭孢菌素和氨曲南的解釋標(biāo)準(zhǔn)。因此，在使用新修訂的解釋標(biāo)準(zhǔn)時(shí)不需要常規(guī)檢測(cè)esbl，除非是在使用舊的解釋標(biāo)準(zhǔn)或者是為了流行病學(xué)調(diào)查以及感染控制的目的仍需要檢測(cè)esbl。初篩試驗(yàn)，按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)呢紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作對(duì)肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌，如果下列紙片抑菌圈直徑，提示菌株可能產(chǎn)生 esbl 。對(duì)奇異變形桿菌抑菌圈直徑和上述菌有所不同。按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法進(jìn)行操作。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松或頭孢噻肟任何一種藥物對(duì)的mic值大于等于每毫升2個(gè)微克，頭孢泊肟 mic 值大于每毫升8個(gè)微克，提示菌株可能產(chǎn)生 esbl 。奇異變形桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢泊肟、頭孢他啶或頭孢噻肟mic值大于每毫升2個(gè)微克，提示菌株可能產(chǎn)生esbl。雙紙片協(xié)同法。按照常規(guī)的紙片擴(kuò)散法在mh瓊脂上涂布好受試菌，先在瓊脂平板中心貼上阿莫西林加克拉維酸紙片，然后在其上下左右貼上頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南紙片，各紙片中心距復(fù)合紙片中心距離為20到 30毫米 ，35加減2度，大氣環(huán)境孵育16到18小時(shí)。結(jié)果解釋，如周圍4個(gè)藥物紙片，其中任何一個(gè)抑菌圈在靠近復(fù)合劑紙片一側(cè)的邊緣出現(xiàn)擴(kuò)大或加強(qiáng)，說(shuō)明該菌株產(chǎn)esbl。擴(kuò)散法質(zhì)控，esbl陰性質(zhì)控用大腸埃希菌atcc 25922。esbl陽(yáng)性質(zhì)控肺炎克雷伯菌atcc 700603。微量肉湯稀釋法初篩試驗(yàn)。方法用調(diào)節(jié)陽(yáng)離子m-h肉湯，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌選用，頭孢他啶每毫升1個(gè)微克，氨曲南每毫升1個(gè)微克，頭孢曲松每毫升1個(gè)微克或頭孢噻肟每毫升1個(gè)微克。奇異變形桿菌選用頭孢泊肟每毫升1個(gè)微克或頭孢他啶每毫升1個(gè)微克或頭孢噻肟每毫升1個(gè)微克。35加減2度，大氣環(huán)境孵育16到20小時(shí)。結(jié)果判斷如果生長(zhǎng)提示菌株產(chǎn)esbl。注意事項(xiàng)，使用一種以上的藥物進(jìn)行檢測(cè)可提高檢測(cè)的敏感性。質(zhì)控菌株，atcc 25922不太明顯；肺炎克雷伯菌atcc 700603的生長(zhǎng)平等。esbl表型確證試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法，使用每片含30微克的頭孢他啶、頭孢噻肟和頭孢他啶加克拉維酸、頭孢噻肟加克拉維酸的復(fù)合劑紙片進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)任何一種復(fù)合紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨(dú)藥敏紙片抑菌圈直徑 5毫米 ，可確認(rèn)該菌株產(chǎn)esbl。質(zhì)控菌株大腸埃希菌atcc 25922小于等于2個(gè)毫米，肺炎克雷伯菌atcc 700603，頭孢他啶加克拉維酸大于等于 5毫米 ，頭孢噻肟加克拉維酸大于等于 3毫米 。表型確認(rèn)試驗(yàn)。瓊脂稀釋法：使用頭孢他啶 mic 范圍在0.25到128每毫升微克、頭孢他啶加克拉維酸范圍在0.25到4，128到4每毫升微克、頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸進(jìn)行mic測(cè)試，當(dāng)與克拉維酸聯(lián)合用藥，mic小于或等于單獨(dú)用藥藥物mic 3個(gè)倍比稀釋度，也就是8倍濃度，可確認(rèn)該菌株產(chǎn)esbl。稀釋法質(zhì)控，esbl陰性質(zhì)控，大腸埃希菌atcc25922；esbl陽(yáng)性質(zhì)控，肺炎克雷伯菌atcc700603。頭孢菌素酶檢測(cè)，對(duì)于頭孢菌素酶，clsi酶目前還沒(méi)有可供推薦的方法進(jìn)行檢測(cè)，也沒(méi)有相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前用于頭孢菌素酶定性的檢測(cè)方法很多，主要有以下幾種。一，單紙片擴(kuò)散法；二，雙紙片協(xié)同法；三，雙紙片增效試驗(yàn)；四，三維試驗(yàn)法。碳青霉烯酶的測(cè)定。碳青霉烯酶定義，指所有能水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類 內(nèi)酰胺酶，分別屬于ambler分類a類、b類、d類酶， 包括kpc 內(nèi)酰胺酶和金屬酶。 cl si目前還沒(méi)有可提供推薦用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)金屬酶的方法，但是2009年的clsi m100-s19文件中增加了對(duì)kpc 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法，即改良的三維方法，即改良的測(cè)序試驗(yàn)。kpc酶檢測(cè)。2001年首次報(bào)道從肺炎克雷伯中分離到kpc-1，它屬于bush分類法中的類 2f 組，ambler分子分類中的屬于a類,克拉維酸對(duì)其活性有抑制作用。kpc 內(nèi)酰胺酶目前已有10種亞型，包括kpc-1至kpc-10，他們之間只有個(gè)別氨基酸發(fā)生了突變。在多個(gè)菌屬中都有報(bào)道。主要為質(zhì)粒介導(dǎo)，但在陰溝腸桿菌中可由染色體介導(dǎo)。國(guó)外報(bào)道， 產(chǎn)kpc 內(nèi)酰胺酶菌株即可表現(xiàn)為對(duì)碳?xì)涿瓜╊惪股啬退?，也可表現(xiàn)為中介或敏感，并存在接種效應(yīng)，這就增加了對(duì)其識(shí)別的難度。用于kpc酶定性的檢測(cè)方法主要有以下幾種：一，3-氨基苯硼酸雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)；二，改良三維試驗(yàn)法；三，分子生物學(xué)方法。紙片篩選法，選用厄他培南、美羅培南，亞胺培南不作為碳青霉烯酶篩選用藥物。一，3-氨基苯硼酸雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)。方法，將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臐舛却龣z菌液涂抹于mh瓊脂平板上，瓊脂稍干后，把含每片600微克的3-氨基苯硼酸紙片貼于mh平板中間，于紙片周圍分別貼上含厄他培南和美羅培南紙片，紙片中心距離為 20毫米 ，置35加減2度， 大氣環(huán)境孵育16到18小時(shí)，有協(xié)同現(xiàn)象出現(xiàn)為mbl陽(yáng)性。改良的hodge試驗(yàn)。改良 hodge 試驗(yàn)是碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法，用于檢測(cè)kpc的敏感性以及特異性均大于9