實(shí)驗(yàn)：總維生素C的測定—2,4-二硝基苯肼比色法.doc

實(shí)驗(yàn)：總維生素C的測定2，4-二硝基苯肼比色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解天然維生素C 的結(jié)構(gòu)功能以及天然存在形式。2.掌握測定總維生素C 的原理與方法。二、實(shí)驗(yàn)原理總抗壞血酸包括還原型Vc、脫氫型Vc 和二酮古龍?zhí)撬?。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4 -二硝基苯肼作用生成紅色脎。脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比，由此通過比色可對樣品中總壞血酸進(jìn)行定量。三、儀器和試劑儀器：恒溫水浴鍋（370.5）、紫外-可見分光光度計(jì)、組織搗碎機(jī)。試劑：本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，試劑純度均為分析純。1、4.5mol/L 硫酸：小心將250mL 硫酸(比重1.84)加入到700mL 水中，冷卻后用水稀釋至1000mL。2、(9+1)硫酸：小心將900mL 硫酸(比重1.84)加入到100mL 水中，攪拌均勻。3、2% 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L2，4 -二硝基苯肼溶液)：溶解2g 2，4 - 二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L 硫酸內(nèi)，過濾使用（不用時(shí)存于冰箱內(nèi)，每次用前過濾）。4、2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)：溶解20g 草酸()于700mL 水中，再加水稀釋至1000mL。5、1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)：稀釋500mL 2%草酸溶液到1000mL。6、1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)：溶解5g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。7、2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)：溶解10g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。8、1mol/L 鹽酸：取100mL 鹽酸，加入水中，并稀釋至1200mL。9、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/mL)：溶解100mg 純抗壞血酸于100mL 1%草酸中。10、活性炭：將100g 活性炭加到750mL 1mol/L 鹽酸中，水浴回流1-2h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子（）為止，然后置于110烘箱中烘干。檢驗(yàn)鐵離子方法：利用普魯士藍(lán)反應(yīng)。將2%亞鐵氰化鉀（20g/L亞鐵氰化鉀）與1%鹽酸等量混合，將上述洗出濾液滴入，如有鐵離子則產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。四、操作步驟（全部實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光）(一)樣品的測定1.浸提：鮮樣的制備：稱100g 鮮樣和100g 2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)，倒入搗碎機(jī)中打成勻漿，取10-40g 勻漿(含1-2mg 抗壞血酸)倒入100mL 容量瓶中，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀釋至刻度，混勻。將浸提液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。干樣制備：稱1-4g 干樣(含1-2mg 抗壞血酸)放入乳缽內(nèi)，加入1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)磨成勻漿，倒入100mL容量瓶內(nèi)，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀釋至刻度，混勻。將浸提液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。2.氧化處理：取25mL 上述濾液，加入2g 活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL 此氧化提取液，加入10mL 2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)，混勻（得到樣品氧化液）。3.呈色反應(yīng)：編號123樣品氧化液/ml4442% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml-11加蓋在370.5水浴保溫3h，3h后取出，除空白管外，所有試管放入冰水中2% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml1-1號管在室溫中放置1015min 后放入冰水內(nèi)(9+1)硫酸/ml（邊加邊搖動試管滴加時(shí)間至少需要1min）555硫酸滴加完畢，將試管自冰水中取出，在室溫準(zhǔn)確放置30min 顯色4.比色用1cm 比色杯，以空白液調(diào)零點(diǎn)，于500nm 波長測吸光值。(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制1、加2g 活性炭于50mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液中，搖動1 min，過濾。2、取10mL 濾液放入500mL 容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀釋至刻度（抗壞血酸濃度20g/mL）。3、取5，10，20，25，40，50，60稀釋液，分別放入7個(gè)100mL 容量瓶中，用1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)稀釋至刻度，（最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，5，8，10，12 g/mL）按樣品測定步驟形成脎并比色。 4、以吸光值為縱坐標(biāo)，以抗壞血酸濃度(g/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五、計(jì)算式中： X樣品中總抗壞血酸含量，mg/100g；c由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或回歸方程算得樣品氧化液