Q-PCR技術(shù).ppt

定量聚合酶鏈反應(yīng) Q PCR 測(cè)定技術(shù)及其臨床應(yīng)用 此ppt下載后可修改 1 PCR PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝 凱利 穆利斯 KaryMullis PCR只是一個(gè)概念 所發(fā)生的奇跡是 PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù) 后者又上升成為新的概念 它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式 摘自 MakingPCR AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow 2 3 什么是PCR 我不認(rèn)為PCR能夠用兩種 革命 政治革命和科學(xué)革命 加以說(shuō)明 它的發(fā)明并沒(méi)有改變基因操作的本質(zhì) 有了PCR 我們能在更廣的范圍內(nèi)更快 更容易地進(jìn)行基因操作 學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR 它只不過(guò)是一種新工具 凱利 穆利斯 KaryMullis 4 5 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 1 1983Cetus公司的K Mullis在這年底 12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn) 發(fā)明了PCR 6 PCR發(fā)明過(guò)程的簡(jiǎn)單回顧 7 8 9 10 11 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 2 1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表 R Saiki S Scharf F Faloona K Mullis G Horn H ErlichandN Arnheim 12 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 3 1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國(guó)獲得PCR基本技術(shù)專(zhuān)利批準(zhǔn) 成立于1985年底的Perkin ElmerCetus儀器公司 PECI 于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀 1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn) 預(yù)示著分子時(shí)代的到來(lái) 12月 Science 雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè) 年度分子 Hoffmann LaRoche公司和Cetus開(kāi)始合作將PCR應(yīng)用于臨床診斷 13 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 4 1990Cetus科學(xué)家D Gelfand和S Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法 第一個(gè)PCR試劑盒用于HLA定量檢測(cè)分析 Cetus科學(xué)家H Erlich和K Mullis在德國(guó)臨床化學(xué)領(lǐng)域獲得生化分析獎(jiǎng) 1991TaqMan技術(shù)發(fā)表 當(dāng)年11月Hoffmann LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專(zhuān)利權(quán) RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進(jìn)行RT PCR技術(shù) 并用于臨床RNA病毒檢測(cè) 耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶首次由Cetus科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道 14 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 5 1992當(dāng)年3月Cetus公司獲得Taq酶 熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專(zhuān)利 1993AMPLICORHCV 首次用于臨床RNAPCR標(biāo)準(zhǔn)試劑盒 KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 15 PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史 6 九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開(kāi)1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開(kāi)始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)1999年西方發(fā)達(dá)國(guó)家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查 16 PCR循環(huán) 第一步 加熱變性 靶序列 靶序列 17 PCR循環(huán) 第二步 引物與靶序列退火 靶序列 靶序列 Primer1 Primer2 Biotin Biotin 5 3 5 5 3 5 3 3 18 PCR循環(huán) 第三步 引物延伸 靶序列 靶序列 Primer1 Primer2 Biotin Biotin 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 19 第1個(gè)PCR循環(huán)完成后 得到兩個(gè)拷貝的靶序列 靶序列 靶序列 Biotin Biotin 20 30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量 No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 21 22 PCR擴(kuò)增過(guò)程圖示 23 PCR擴(kuò)增的理論模式 PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增 每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá) Yn Yn 1 1 E Yn 2 1 E 2 X 1 E n0 E 1其中E表示擴(kuò)增效率 Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量 Yn 1為n 1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量 等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù) 通常為20或30 內(nèi)成立 超過(guò)此周期數(shù) 擴(kuò)增過(guò)程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率 最終達(dá)到平臺(tái) 不再擴(kuò)增 24 影響PCR擴(kuò)增效率的因素 PCR定量的困難 引物 靶的雜交反應(yīng)試劑的相對(duì)量樣本在擴(kuò)增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴(kuò)增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過(guò)量可致E降低 25 PCR和定量問(wèn)題 高濃度 高效率高濃度 低效率低濃度 高效率N 擴(kuò)增分子的數(shù)目n 擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) log phaseanalysis N n end pointanalysis 26 定量PCR與定性PCR測(cè)定的最根本的區(qū)別 定量PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)為PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期 而定性PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)則多為PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期 27 定量PCR的方法 定量PCR方法可歸為三大類(lèi) 即外標(biāo)方法 動(dòng)力學(xué)方法和內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法定量還可分為絕對(duì)定量 即測(cè)定X的分子數(shù)量 和相對(duì)定量 即測(cè)定不同樣本中X的比率 28 用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法 29 使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 1 方法簡(jiǎn)便 容易建立 2 使用雙孔重復(fù)測(cè)定 這種方法可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果 甚至可排除管間的差異 但不能排除樣本間的差異 缺點(diǎn) 1 PCR反應(yīng)體系中小的區(qū)別也會(huì)對(duì)測(cè)定造成較大的影響 由于最后在擴(kuò)增效率上的差異 從而使得定量測(cè)定精密度和重復(fù)性不佳 因此 如果建立一個(gè)使用外標(biāo)準(zhǔn)的PCR定量方法 則必須進(jìn)行方法的精密度 批內(nèi)變異 和重復(fù)性 批間變異 分析 以確定其應(yīng)用的局限性 30 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR 31 32 分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 33 動(dòng)力學(xué)定量PCR方法 第一步 確定PCR擴(kuò)增的效率 第二步 根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算原始模板數(shù) 34 擴(kuò)增效率的計(jì)算 1 如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常數(shù) 則可通過(guò)在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期的數(shù)個(gè)連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴(kuò)增樣本 然后測(cè)定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來(lái)測(cè)定E值 有必要收集2份以上的樣本 最好是盡可能多的樣本以確證擴(kuò)增效率保持恒定 換句話說(shuō) 也就是PCR尚未達(dá)到擴(kuò)增效率開(kāi)始降低時(shí)的階段 如果取的是連續(xù)的樣本 則可從公式 1 測(cè)得E值 35 擴(kuò)增效率的計(jì)算 36 擴(kuò)增效率的計(jì)算 2 如果取的樣本不連續(xù) 則可使用下述將公式 2 重排后得到的更為通用的公式 用參數(shù)j 取樣中間隔的周期數(shù) 替代n Yj 在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量 替代Yn Yi j 在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量 替代X E 1 Yi Yi j 1 j 3 37 X 原始模板數(shù) 的計(jì)算 一旦效率確定后 根據(jù)公式 4 可從測(cè)定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計(jì)算得到X 公式 4 來(lái)源于公式 2 的重新排列 X Yn 1 E n 4 38 X的另一種計(jì)算方式 1 另一種方式是 根據(jù)公式 2 的對(duì)數(shù)形式 以所測(cè)定的Yn值的對(duì)數(shù)對(duì)函數(shù)n繪圖得到X值 logYn logX n log 1 E 5 當(dāng)n 0時(shí) 可在圖上讀出X值 或通過(guò)對(duì)公式 5 的線性回歸計(jì)算X值 圖2 39 40 動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn) 這種方法的優(yōu)點(diǎn) 1 不需要外標(biāo)準(zhǔn) 2 如果能測(cè)定PCR產(chǎn)物分子的絕對(duì)數(shù)量 則可得到待測(cè)樣本的不同的擴(kuò)增效率 Ee 41 使用非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法 非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)準(zhǔn) 1 一般為與靶核酸無(wú)關(guān)的基因組 2 既可是內(nèi)源的也可是外源的 3 與靶核酸無(wú)相同的引物結(jié)合位點(diǎn)和擴(kuò)增序列 對(duì)于DNA的擴(kuò)增 非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)幾乎所有的基因都可應(yīng)用 最常用的有丙酮酸脫氫酶 前腦啡肽或 肌動(dòng)蛋白的基因 而對(duì)RNA的擴(kuò)增 則非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)較難尋找 理想的mRNA內(nèi)標(biāo)應(yīng)該在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)的水平變化不大 此外 其表達(dá)水平應(yīng)接近于靶RNA 而且它們的擴(kuò)增效率應(yīng)相等 因此兩者擴(kuò)增線性區(qū)域是重合的 已有許多的mRNA被嘗試用來(lái)作為此種內(nèi)標(biāo) 如HLA 肌動(dòng)蛋白 GPDH和組蛋白H3 3的mRNA或14SrRNA等 42 以非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn) 內(nèi)標(biāo)的制備簡(jiǎn)單復(fù)管測(cè)定可排除管間差異 并且在一定程度上 可排除樣本間的差異 43 以非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn) 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不同 并且有可能既使針對(duì)的是相同的靶核酸逆轉(zhuǎn)錄效率也會(huì)有很大差異 因此 使用這種方法進(jìn)行RNA的定量PCR測(cè)定極為困難 在擴(kuò)增過(guò)程中的指數(shù)期測(cè)定可對(duì)原始模板相對(duì)定量 但如果沒(méi)有驗(yàn)證在一定的擴(kuò)增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標(biāo)有相同的擴(kuò)增效率 則不能進(jìn)行絕對(duì)定量 44 使用競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法 競(jìng)爭(zhēng)性 內(nèi)標(biāo) 人為構(gòu)建的可與原始靶核酸競(jìng)爭(zhēng)酶 核苷酸和引物分子的核酸標(biāo)準(zhǔn) 其特點(diǎn)是 與靶核酸具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn) 但引物之間的順序需加以修飾 使得擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)能夠很容易地通過(guò)諸如凝膠電泳 探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分 對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的修飾方法包括對(duì)野生型基因組的點(diǎn)突變 部份缺失或插入外來(lái)順序等 目前尚無(wú)通用的規(guī)則或程序來(lái)構(gòu)建這種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) 45 使用競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法 使用競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對(duì)定量也可進(jìn)行絕對(duì)定量 相對(duì)定量具有很好的精密度和重復(fù)性 而絕對(duì)定量 關(guān)鍵是要證明競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)和野生型靶核酸的擴(kuò)增效率相同 亦可將競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時(shí)擴(kuò)增來(lái)評(píng)價(jià) 46 使用競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法 要定量單份的臨床樣本 必須進(jìn)行數(shù)管競(jìng)爭(zhēng)性PCR測(cè)定 每管中靶核酸的量不變 但改變競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)的量 因?yàn)橹挥挟?dāng)待測(cè)靶核酸與競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)等摩爾量時(shí)才能有可靠的定量 由于競(jìng)爭(zhēng)性PCR可排除管間和樣本間的差異 因此 其可作為準(zhǔn)確的PCR定量方法 適用于絕對(duì)定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量 47 定量PCR測(cè)定的臨床應(yīng)用及應(yīng)注意的問(wèn)題 為什么要做定量測(cè)定 定性和定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告上的混淆 48 為什么要做定量測(cè)定 用于已知病毒感染患者抗病毒治療效果的動(dòng)態(tài)觀察及抗病毒藥物的臨床研究 用于基因表達(dá)方面的研究 如特定的mRNA的定量測(cè)定 49 定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告 定量測(cè)定測(cè)定的是量的 多 或 少 定性測(cè)定則是測(cè)定某種物質(zhì)的 有 或 無(wú) 用于未知病人的確認(rèn)診斷 定量測(cè)定結(jié)果報(bào)告 根據(jù)所使用的測(cè)定方法的測(cè)定范圍報(bào)告結(jié)果 如樣本測(cè)定結(jié)果高出此范圍 則可報(bào)告 多少 也可對(duì)樣本稀釋后再檢測(cè) 如低于此范圍 則報(bào)告 多少 如 103拷貝數(shù) ml 而不能報(bào)告為0拷貝數(shù) ml或陰性 50 總結(jié) 1 定量測(cè)定重在定量 即如何改善擴(kuò)增指數(shù)期的線性及其范圍 2 定量測(cè)定的準(zhǔn)確性較之測(cè)定下限要重要得多 3 非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)和競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)對(duì)于使用內(nèi)標(biāo)的定量測(cè)定方法極為關(guān)鍵 合適