葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)ppt課件VIP

葡萄球菌腸毒素C的純化研究 1 一 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選二 用分子截留方法濃縮腸毒素原液三 用DEAE 纖維素 系Pharmacia產(chǎn)品 柱層析作第一步提取四 用SephadexG 75分子篩層析柱進(jìn)一步純化五 純化前后SET C的SDS PAGE鑒定六 純化后的SET C分子量測(cè)定七 對(duì)SET C純化品的N末端氨基酸測(cè)定 2 前言 為了檢測(cè) 金葡素 制劑中有效成份葡萄球菌腸毒素C SET C 我們對(duì)提純SET C方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究 經(jīng)多次試驗(yàn) 認(rèn)為按四部法提取SET C能獲得較好效果 并對(duì)SET C的某些生物學(xué)特性作了探索 現(xiàn)總結(jié)如下 3 一 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選 我們比較了豬心胨湯 原生產(chǎn) 金葡素 用培養(yǎng)基 酶解豬心湯和胰酪胨綜合培養(yǎng)基 接種復(fù)壯后種子液 以靜置與搖瓶 156r min 二種方式作48小時(shí)培養(yǎng) 取出以高速離心法除去菌細(xì)胞 再用0 45um微孔濾膜過(guò)濾除去殘存菌 取其無(wú)菌濾液用反相膠乳凝集試驗(yàn) RPLA 測(cè)SET C含量 4 結(jié)果證明 胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖瓶培養(yǎng)金黃色葡萄球菌 其產(chǎn)生SET C最高 因此 我們?cè)谧鱏ET C提純時(shí)就決定采用胰酪胨綜合培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方式來(lái)制備腸毒素原液 5 二 用分子截留方法濃縮腸毒素原液 采用中科院上海原子核研究所裝配的POST FLOTM 型流動(dòng)循環(huán)超濾泵 以10000dalton超濾膜對(duì)腸毒素原液進(jìn)行截留濃縮 除去原液中水份及10000dalton以下的小分子物質(zhì) 使原液濃縮達(dá)20倍以上 離心除沉淀 取其上清 經(jīng)透析作為純化SET C的原液 6 三 用DEAE 纖維素 系Pharmacia產(chǎn)品 柱層析作第一步提取 一般要求DEAE 纖維素40 100目 臨用前過(guò)篩 再以蒸餾水漂洗 去除細(xì)微粒子 用1 NaoH和和1 HCL交替處理后直至洗滌液呈中性 再用0 01mol LPH5 4PB沖洗平衡 裝柱 柱大小為4 1 42cm 裝柱時(shí)切忌氣泡進(jìn)入 裝好柱后用同一PB緩慢洗滌使整個(gè)柱內(nèi)達(dá)到平衡 然后上樣 7 即將上一步濃縮透析過(guò)的SET C原液緩慢加入使全部入柱后 先用PH5 00 01mol LPB洗滌 使有色液體流盡 其后作分管收集 每10分鐘收集一管 其量為7 5ml 對(duì)收集液逐管在OD280nm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)蛋白峰出現(xiàn)管數(shù) 8 其后相繼換用PH6 6 0 06mol LPB和PH6 8 0 2mol LPB分步洗脫 洗速為45ml hr 每管仍用OD280nm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)洗脫液蛋白吸收峰 并對(duì)各峰洗脫液合并 再用反相膠乳凝集試驗(yàn) RPLA 檢測(cè)是否有SET C存在 合并蛋白峰 收集結(jié)果證明SET C在第 峰 結(jié)果見(jiàn)圖1 并對(duì) 峰用PEG濃縮至一定量 提供下一步純化 9 圖1 用DEAE 纖維素層析結(jié)果 10 四 用SephadexG 75分子篩層析柱進(jìn)一步純化 對(duì)收集經(jīng)DEAE 纖維素層析分離的第 峰洗脫液合并 用PEG濃縮 將濃縮液置透析袋中 用0 01mol LPH7 4PB透析平衡后 將第一步濃縮透析液再通過(guò)事先準(zhǔn)備好的SephadexG 75分子篩柱 2 6 30cm 過(guò)柱 11 上樣后用0 01mol LPH7 4PB洗脫 洗脫液出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰 用RPLA檢測(cè)毒素即在此峰 收集 峰混合 濃縮 結(jié)果見(jiàn)圖2 圖2 用SephadexG 75分子篩結(jié)果 12 對(duì)截留后濃縮液及通過(guò)DEAE纖維素柱層析與SephadexG 75分子篩過(guò)柱后各項(xiàng)內(nèi)容的變化情況見(jiàn)表1 表1 SET C的提純及回收率 從表1可見(jiàn) 通過(guò)DEAE 纖維素柱層析后 SET C回收率為66 而純度為46 再通過(guò)SephadexG 75分子篩過(guò)柱后回收率達(dá)76 而純度則達(dá)96 4 13 五 純化前后SET C的SDS PAGE鑒定 對(duì)分子截留濃縮的截留原液 經(jīng)DEAE 纖維素初步提以的濃縮液及再經(jīng)SephadexG 75分子篩純化后濃縮液 在同一塊10 的SDS PAGE凝膠板上 分別滴樣進(jìn)行電泳后染色觀察 結(jié)果見(jiàn)圖3 14 CBA A 濃縮液B 經(jīng)DEAE柱C 經(jīng)SephadexG 75柱 圖3SET C各部樣品的電泳圖譜 從圖3可見(jiàn) 經(jīng)DEAE 纖維素柱層析后 雜蛋白帶顯著減少 而再經(jīng)SephadexG 75分子篩提純后 在SDS PAGE中呈現(xiàn)一條清晰的條帶 15 六 純化后的SET C分子量測(cè)定 對(duì)純化后的SET C制品與已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一塊10 SDS PAGE凝膠板進(jìn)行電泳后作染色檢定 結(jié)果見(jiàn)圖4 圖5 16 M standardproteinS sample 圖4SDS PAGE測(cè)定腸毒素C分子量 圖5SETC分子量測(cè)定結(jié)果 30000 17 從圖4 圖5中可見(jiàn)純化SET C在PAGE中呈現(xiàn)單一條帶 通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量比較計(jì)算 SET C的分子量約在28000dalton左右 18 七 對(duì)SET C純化品的N末端氨基酸測(cè)定 由我公司提供純化SET C 請(qǐng)上?；瞪锛夹g(shù)