臨床免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)總論

1 臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn) 2 第一章概論免疫學(xué) Immunology 是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能 并通過(guò)對(duì)其在免疫應(yīng)答過(guò)程中所產(chǎn)生的免疫保護(hù)與免疫損傷機(jī)制的研究 探討有效的免疫措施 實(shí)現(xiàn)以防病 治病為目的的一門(mén)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科 3 免疫學(xué)經(jīng)驗(yàn)時(shí)期 11 17世紀(jì) 中國(guó)醫(yī)生發(fā)明了用人痘苗預(yù)防天花將天花痂粉吹入正常人鼻孔來(lái)預(yù)防天花不十分可靠仍然有感染的危險(xiǎn) 免疫學(xué)的形成與發(fā)展 4 經(jīng)典免疫學(xué)時(shí)期 18世紀(jì)末到20世紀(jì)中葉 抗感染免疫英國(guó)醫(yī)生創(chuàng)造出牛痘苗接種法為人類戰(zhàn)勝了天花做出了貢獻(xiàn)1880年 法國(guó)微生物學(xué)家L Pasteur偶然發(fā)現(xiàn)接種陳舊的雞霍亂桿菌培養(yǎng)物可使雞免受毒性株的感染 成功地創(chuàng)制了炭疽桿菌減毒疫苗和狂犬病疫苗 并開(kāi)始了免疫機(jī)制的研究 1883年 俄國(guó)動(dòng)物學(xué)家發(fā)現(xiàn)了白細(xì)胞的吞噬作用并提出了細(xì)胞免疫學(xué)說(shuō) 1890年 德國(guó)醫(yī)師和日本學(xué)者北里發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素 1894年比利時(shí)血清學(xué)家J Bordet發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體 5 1896年H Durham等人發(fā)現(xiàn)了凝集反應(yīng) 1897年R Kraus發(fā)現(xiàn)了沉淀反應(yīng) 1900年K Landsteiner發(fā)現(xiàn)了人類ABO血型 J Bordet發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) 1901年 免疫學(xué) 一詞首先出現(xiàn)在 IndexMedicus 中 1916年 JournalofImmunology 創(chuàng)刊 此后的幾十年中 血清學(xué)研究代表了免疫學(xué)發(fā)展的主流 6 近代免疫學(xué)時(shí)期 20世紀(jì)中葉 1945年R Owen發(fā)現(xiàn)同卵雙生的兩只小牛的不同血型可以互相耐受 1948年C Snell發(fā)現(xiàn)了組織相容性抗原 1953年R Billingham等人成功地進(jìn)行了人工耐受試驗(yàn) 1956年Witebsky等人建立了自身免疫病動(dòng)物模型 這些免疫生物學(xué)現(xiàn)象迫使人們必須跳出抗感染的圈子 甚至站在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之外去看待免疫學(xué) 7 克隆選擇學(xué)說(shuō) cloneselectiontheory 于1958年由澳大利亞學(xué)者F Burnet提出 該學(xué)說(shuō)認(rèn)為 體內(nèi)存在識(shí)別各種抗原的免疫細(xì)胞克隆 抗原通過(guò)細(xì)胞受體選擇相應(yīng)的克隆并使之活化和增殖 變成抗體產(chǎn)生細(xì)胞和免疫記憶細(xì)胞 胚胎時(shí)期與抗原接觸的免疫細(xì)胞可被破壞或抑制 稱為禁忌細(xì)胞株 forbiddenclone 部分免疫細(xì)胞可因突變而與自身抗原起反應(yīng) 這個(gè)理論雖不十分完善 但解釋了大部分免疫現(xiàn)象 為多數(shù)學(xué)者所接受并被后來(lái)的實(shí)驗(yàn)所證明 可以說(shuō)是一個(gè)劃時(shí)代的免疫學(xué)理論 8 現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期 器官 細(xì)胞和分子水平1956年B Glick發(fā)現(xiàn)了腔上囊的作用1961年J Miller發(fā)現(xiàn)了胸腺的功能1966年H Claman等人區(qū)分出B細(xì)胞與T細(xì)胞 并且發(fā)現(xiàn)了它們的免疫協(xié)同作用 以后又相繼發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞中不同的亞群及其鑒定方法 1950年R Porter用蛋白酶水解獲得了抗體的片段 G Edelman用化學(xué)斷裂法得到了抗體的多肽鏈 共同證明了抗體的分子結(jié)構(gòu) 1957年G K hler和C Milstein等人用B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體 1978年S Tonegawa發(fā)現(xiàn)了免疫球蛋白的基因重排 80年代以來(lái) 眾多的細(xì)胞因子相繼被發(fā)現(xiàn) 9 基本概念 免疫 機(jī)體識(shí)別 自身 與 非己 抗原 對(duì)自身抗原形成天然免疫耐受 對(duì) 非己 抗原產(chǎn)生排異作用的一種生理功能 免疫功能 免疫系統(tǒng)在識(shí)別和清除 非己 抗原過(guò)程中所產(chǎn)生的各種生物學(xué)作用的總稱 主要包括三方面的內(nèi)容 免疫防御 免疫自穩(wěn) 免疫監(jiān)視 10 免疫防御 immunologicaldefence 指機(jī)體排斥外源性異物的能力 免疫自穩(wěn) immunologicalhomeostasis 指機(jī)體識(shí)別和清除自身衰變殘損的組織細(xì)胞的能力 以維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 免疫監(jiān)視 immunologicalsurveillance 指機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞的能力 以監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng) 免疫系統(tǒng)的三大生理功能 11 免疫應(yīng)答反應(yīng) immuneresponse 是指機(jī)體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生一系列反應(yīng) 并以排出或分解該抗原為目的的反應(yīng)過(guò)程 免疫應(yīng)答的過(guò)程主要分為 識(shí)別階段 recognitionphase 活化階段 activationphase 效應(yīng)階段 responsephase 抗原識(shí)別處理傳遞信息 免疫細(xì)胞活化增殖產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞 分子 執(zhí)行效應(yīng)功能 12 免疫應(yīng)答效應(yīng)大多為生理性 是機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原或自身變性抗原的清除效應(yīng) 免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)強(qiáng)時(shí) 可致機(jī)體組織或器官發(fā)生病理?yè)p傷 出現(xiàn)臨床疾病 如 自身免疫性疾病 超敏反應(yīng)性疾病等 13 免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn) 14 二 免疫組織與器官 免疫系統(tǒng) immunesystem 由免疫器官 免疫細(xì)胞和免疫分子構(gòu)成 免疫器官按功能不同 分為中樞免疫器官和外周免疫器官 15 通過(guò)免疫網(wǎng)絡(luò) 免疫細(xì)胞能及時(shí)到達(dá)機(jī)體各臟器及皮膚粘膜的病原微生物入侵部位 又能將機(jī)體各部位的抗原成分經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞攜帶至相應(yīng)淋巴組織及淋巴器官 活化T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞 執(zhí)行特異性免疫應(yīng)答功能 單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)及淋巴循環(huán) 進(jìn)出于外周淋巴組織及淋巴器官 形成機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫網(wǎng)絡(luò) 16 一 中樞免疫器官 免疫細(xì)胞產(chǎn)生 分化和成熟的場(chǎng)所 骨髓 1 是造血干細(xì)胞生成 分化發(fā)育的場(chǎng)所 2 是功能性B細(xì)胞分化成熟的唯一場(chǎng)所 3 提供各種免疫細(xì)胞的前體細(xì)胞 T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所胸腺 T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所 二 外周免疫器官 免疫應(yīng)答的場(chǎng)所 淋巴細(xì)胞定居和發(fā)揮功能的場(chǎng)所 淋巴結(jié) 脾臟 粘膜相關(guān)淋巴組織 17 淋巴結(jié)的功能 主要有以下3個(gè)方面 生成淋巴細(xì)胞 淋巴細(xì)胞可以在淋巴結(jié)內(nèi)進(jìn)一步分化 轉(zhuǎn)化和增殖 過(guò)濾淋巴液 由淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬來(lái)完成 淋巴液中衰老的細(xì)胞及顆粒物質(zhì)都可被吞噬 例如 人體吸入的塵埃顆粒 通過(guò)呼吸道進(jìn)入支氣管淋巴結(jié) 被巨噬細(xì)胞吞噬 以致此淋巴結(jié)成為黑色 免疫作用 通過(guò)淋巴結(jié)內(nèi)的各種細(xì)胞本身具有的殺傷作用及其產(chǎn)生的抗體 即免疫球蛋白 來(lái)防御 殺滅和消除體內(nèi)的病原菌 腫瘤細(xì)胞等 18 三 淋巴細(xì)胞再循環(huán)與歸巢淋巴細(xì)胞通過(guò)淋巴循環(huán)和血液循環(huán)往返于全身器官組織 通過(guò)循環(huán)可增加與抗原接觸的機(jī)會(huì) 并將被抗原激活的淋巴細(xì)胞引流入局部淋巴組織及器官 完成防御 自穩(wěn) 監(jiān)視等免疫功能 19 外周免疫器官及外周淋巴組織既是淋巴細(xì)胞再循環(huán)的起點(diǎn)和中途站 也是淋巴細(xì)胞歸巢的終點(diǎn) 淋巴細(xì)胞在發(fā)揮免疫效應(yīng)的同時(shí) 被歸巢受體引導(dǎo)回該類細(xì)胞的原定居處 進(jìn)行修整 增殖和發(fā)育 以提高該類淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能 這是保證淋巴細(xì)胞功能健全的重要環(huán)節(jié) 20 三 免疫細(xì)胞 凡參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞統(tǒng)稱為免疫細(xì)胞 按免疫細(xì)胞在體內(nèi)的作用不同分為三大類 21 T細(xì)胞 Thymus dependentcell 淋巴細(xì)胞B細(xì)胞 Bonemarrowdependentcell NK細(xì)胞 NaturalKillercell 能增殖分化并產(chǎn)生免疫效應(yīng) 淋巴細(xì)胞分類 22 單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞 免疫輔助細(xì)胞 參與輔助淋巴細(xì)胞的活化 中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞免疫應(yīng)答細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞肥大細(xì)胞 參與免疫應(yīng)答中的某一環(huán)節(jié) 23 表1 1不同淋巴細(xì)胞及功能簡(jiǎn)介 24 四 免疫分子 免疫分子是由一些免疫活性細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)及小分子多肽物質(zhì)組成 它們參與機(jī)體的免疫反應(yīng)或免疫調(diào)節(jié) 25 免疫球蛋白 Immunoglobulin Ig 補(bǔ)體系統(tǒng) Complement C 細(xì)胞因子 Cytokine 細(xì)胞粘附分子 CellAdhesionMolecules CAM 白細(xì)胞分化抗原 ClusterDifferentiationantigen CD 主要的免疫分子 26 抗體和免疫球蛋白抗體 antibody Ab 由抗原刺激B細(xì)胞活化 增殖 分化成漿細(xì)胞而產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的糖蛋白 主要存在于血清等體液中 是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白的統(tǒng)稱 27 抗體與免疫球蛋白的關(guān)系1 所有的抗體都是免疫球蛋白 2 免疫球蛋白并非都是抗體 免疫球蛋白是化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念 抗體是生物學(xué)功能上的概念 28 免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) 四肽鏈分子 即由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過(guò)鏈間二硫鍵連接而成的免疫球蛋白單體 呈 Y 形 29 重鏈和輕鏈 重鏈 heavychain H鏈 根據(jù)H鏈恒定區(qū)抗原性的差異可將其分為 五類 與L鏈組成完整的Ig分子 分別稱為IgM IgG IgA IgD和IgE 輕鏈 lightchain L鏈 分為 和 兩型 30 31 免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段胃蛋白酶水解片段 32 33 F ab 2片段的意義 既保留了結(jié)合雙價(jià)抗原的生物學(xué)活性 又避免了Fc段作為抗原的免疫原性和免疫結(jié)合性 用于治療時(shí) 可以避免或減輕可能引起的毒副作用 用于免疫檢測(cè)時(shí) 可以避免標(biāo)本中抗抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾 34 第二節(jié)臨床免疫學(xué) 35 臨床免疫學(xué) clinicalimmunology 是將免疫學(xué)基礎(chǔ)理論 臨床醫(yī)學(xué)疾病與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合 用于研究疾病的免疫病理機(jī)制 診斷與鑒別診斷 評(píng)價(jià)治療效果和判斷愈后的多個(gè)分支學(xué)科的總稱 36 臨床免疫學(xué)發(fā)展的主要方向 是將基礎(chǔ)免疫學(xué)研究所取得的理論成果應(yīng)用于臨床疾病的診治 探討新的免疫現(xiàn)象與臨床疾病的關(guān)系 37 免疫病理學(xué) immunopathology 通過(guò)研究免疫細(xì)胞 炎性細(xì)胞 免疫分子 了解當(dāng)這些細(xì)胞或分子的功能失衡或缺陷與導(dǎo)致自身免疫性疾病 免疫缺陷病 免疫增殖病之間的相互關(guān)系 探討免疫相關(guān)性疾病患者疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的免疫病理改變 對(duì)治療與預(yù)后評(píng)價(jià)有著重要的臨床意義 一 免疫病理與免疫性疾病 38 移植免疫學(xué) transplantationimmunology 通過(guò)組織 細(xì)胞或器官移植 以替代機(jī)體喪失功能的組織器官或細(xì)胞 移植后保證移植物存活 不發(fā)生排斥反應(yīng)的一門(mén)科學(xué) 二 移植免疫 39 腫瘤免疫學(xué) tumorimmunology 是研究腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤的免疫診斷 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀況 機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答和抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制的一門(mén)分支學(xué)科 三 腫瘤免疫 40 感染免疫學(xué) infectionimmunology 是研究病原生物與宿主相互關(guān)系的學(xué)科 是傳統(tǒng)免疫學(xué)的基礎(chǔ)與核心 當(dāng)前感染免疫研究的重點(diǎn) 掌握免疫系統(tǒng)在殺傷被病原體感染的宿主細(xì)胞時(shí)對(duì)宿主的損傷程度 免疫應(yīng)答過(guò)程中激活或抑制的效應(yīng)細(xì)胞當(dāng)病原體被清除后所發(fā)揮的作用 固有性免疫與獲得性免疫間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系 生物疫苗在免疫防御中的特點(diǎn) 四 感染免疫 41 第三節(jié)臨床免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn) 42 一 免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展 免疫學(xué)檢驗(yàn) laboratoryimmunology 是研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的重要學(xué)科 43 發(fā)展進(jìn)程的主要階段 自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 凝集反應(yīng) 加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng) 電泳技術(shù) 分離技術(shù) 標(biāo)記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性 敏感性半自動(dòng) 自動(dòng)化檢驗(yàn)儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合 加快了反應(yīng)過(guò)程標(biāo)記技術(shù) 單克隆技術(shù) 高智能自動(dòng)化技術(shù)的最佳組合 44 免疫檢驗(yàn)可分為兩部分 一部分為利用免疫檢測(cè)原理與技術(shù)檢測(cè)免疫活性細(xì)胞 抗原 抗體 補(bǔ)體 細(xì)胞因子 細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì) 另一部分是利用免疫檢測(cè)原理與技術(shù)檢測(cè)體液中微量物質(zhì)如激素 酶 血漿微量蛋白 血液藥物濃度 微量元素等 二 臨床免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn) 45 放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)流式細(xì)胞免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)免疫印跡技術(shù)速率散射免疫技術(shù)單克隆抗體技術(shù) 免疫檢驗(yàn)涉及的主要技術(shù) 46 確定診斷分析病情調(diào)整治療方案判斷預(yù)后 提供有效實(shí)驗(yàn)依據(jù) 臨床應(yīng)用 47 丙型肝炎的免疫檢驗(yàn) 1974年 紐約血液中心的工作人員發(fā)現(xiàn)除乙肝外 還有另一種因子能引起輸血后肝炎 當(dāng)時(shí)稱為非甲非乙型 nonA nonB 肝炎 但顯微鏡下看不到病毒 分離培養(yǎng)不成功 常規(guī)制作EIA和RIA試劑 檢測(cè)均無(wú)結(jié)果 感染動(dòng)物成功 能做理化性質(zhì)測(cè)定 分子量 沉降系數(shù) 對(duì)酸堿環(huán)境的耐受能力等 48 用分子克隆的方法來(lái)甄別和鑒定病毒 建立特異性的免疫及基因檢測(cè)方法 用含病毒的血液感染黑猩猩 并對(duì)其進(jìn)行免疫抑制 使感染加重 病毒滴度提高 從高滴度的病毒濃縮物中提取總RNA 采用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 插入載體中表達(dá) 用表達(dá)的蛋白作為抗原 與患者血清反應(yīng) 對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選 1989年得到第一個(gè)特異性的陽(yáng)性克隆 逆轉(zhuǎn)錄PCR 擴(kuò)增并克隆cDNA 完成了HCV全基因組序列克隆和序列測(cè)定 進(jìn)行抗原表位的預(yù)測(cè) 合成多肽抗原進(jìn)行免疫篩選 集中選擇特異性好 免疫原性高的表位 據(jù)此建立特異性的免疫和基因診斷 49 人類第一次在還沒(méi)有看到病毒 沒(méi)辦法分離 培養(yǎng)病毒 沒(méi)有免疫學(xué)方法確認(rèn)病毒的情況下 利用分子生物學(xué)技術(shù) 克隆了丙肝病毒 并進(jìn)行測(cè)序及表達(dá)病毒抗原 發(fā)展了特異性的診斷試劑 這一成就 開(kāi)創(chuàng)了反向基因工程學(xué)第一個(gè)成功的范例 有著巨大的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景 是分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷學(xué)成功結(jié)合范例 50 HCV感染者血清中抗原含量極低 培養(yǎng)極為困難 HCV電鏡圖 51 學(xué)習(xí)要求 了解檢測(cè)原理 方法和影響因素 掌握常用檢驗(yàn)的參考值和臨床意義 辯證地 全面的分析問(wèn)題 注意實(shí)驗(yàn)的局限性 52 第二章抗原抗體反應(yīng) 53 抗原抗體反應(yīng) 抗原和相應(yīng)抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng) 既可發(fā)生在體內(nèi) 也可發(fā)生在體外 體外發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)是我們開(kāi)展免疫檢測(cè)的物質(zhì)基礎(chǔ) 根據(jù)反應(yīng)抗原的物理性狀和反應(yīng)的條件不同 抗原抗體反應(yīng)可有不同的現(xiàn)象 如沉淀 凝集 細(xì)胞溶解 補(bǔ)體結(jié)合 毒素中和等 這些現(xiàn)象就是我們免疫檢驗(yàn)的檢測(cè)信號(hào)和判斷結(jié)果的依據(jù) 54 抗原抗體反應(yīng)的原理結(jié)合的部位 抗原表位和抗體超變區(qū) 結(jié)合的條件 二者之間緊密接觸 結(jié)構(gòu)互補(bǔ) 抗原抗體結(jié)合力的存在 靜電引力 范登華引力 氫鍵結(jié)合力 疏水作用力 55 靜電引力 electrostaticforces 范德華引力 作用最小 vanderWaalsinteractions 氫鍵 最具特異性 hydrogenbond 疏水作用力 作用最大 hydrophobicinteractions 抗原抗體結(jié)合力示意圖 一 抗原抗體結(jié)合力 56 抗原抗體的親和性和親和力親和性 affinity 抗體分子單一抗原結(jié)合部位 VH VL 與一個(gè)相應(yīng)抗原決定簇之間互補(bǔ)而存在的引力 親和力 avidity 抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度 與抗體結(jié)合價(jià)直接相關(guān) 親和性和親和力越高 抗原抗體結(jié)合速度越快 結(jié)合越牢固 57 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體未結(jié)合的抗原 抗體為親水膠體 不會(huì)發(fā)生自然沉淀 結(jié)合后的抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)化為疏水膠體 可形成較大塊的沉淀物 可見(jiàn)反應(yīng) 抗原抗體復(fù)合物 疏水膠體 電解質(zhì) 抗原 親水膠體 抗體 親水膠體 表面電荷減少 水化層變薄 失去親水性能 58 第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性可逆性比例性階段性 59 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1 特異性 抗原抗體結(jié)合的專一程度 由抗原表位和抗體超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)吻合程度所決定 共同抗原與交叉反應(yīng)不同抗原分子具有不同的表位 因此各具特異性 但有時(shí)相同或類似的表位也會(huì)出現(xiàn)在不同的抗原上 帶有相同或類似表位的抗原互稱共同抗原 commonantigen 由某一共同抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體 也可以與其共同抗原結(jié)合 這種現(xiàn)象稱為交叉反應(yīng) 在免疫檢驗(yàn)中 交叉反應(yīng)與檢測(cè)的特異性密切相關(guān) 是引起假陽(yáng)性結(jié)果的最主要的原因 60 二 可逆性 可逆性 抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后 在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 抗原抗體復(fù)合物的形成是結(jié)合和解離同時(shí)進(jìn)行的動(dòng)態(tài)過(guò)程 影響因素 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力 親合力越高 結(jié)合越牢固 越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響 pH 離子強(qiáng)度 61 前帶 prezone 抗體過(guò)量后帶 postzone 抗原過(guò)量等價(jià)帶 equivalencezone 抗原抗體比例合適 抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖 比例性 抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系 抗原抗體比例適合時(shí)才能形成大塊的聚合物及肉眼可見(jiàn)反應(yīng) 三 比例性 62 4 階段性第一階段 特異性結(jié)合階段 反應(yīng)快 不可見(jiàn) 第二階段 反應(yīng)可見(jiàn)階段 反應(yīng)慢 出現(xiàn)凝集 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象 63 影響抗原抗體反應(yīng)的因素 一 反應(yīng)物自身因素1 抗原免疫反應(yīng)性和特異性 免疫反應(yīng)性好 結(jié)合速度快 結(jié)合牢固 特異性高 結(jié)合的專一程度也高 免疫反應(yīng)性和特異性由抗原分子表位的性質(zhì)和數(shù)目決定 理化因素 顆?？乖纬赡?可溶性抗原形成沉淀等 64 2 抗體 來(lái)源 1 多克隆抗體 來(lái)源于不同動(dòng)物的多克隆抗體親和力 等價(jià)帶范圍等均有差異 對(duì)免疫檢測(cè)的準(zhǔn)確性有直接影響 2單克隆抗體 只針對(duì)同一位點(diǎn)的均一抗體 不適合用于沉淀和凝集反應(yīng) 濃度 合適的濃度才能出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)結(jié)果 特異性與親和力 決定抗原抗體結(jié)合的專一性 結(jié)合的速度和牢固程度 65 二 反應(yīng)環(huán)境條件 電解質(zhì) 促進(jìn)抗原 抗體復(fù)合物由親水向疏水的轉(zhuǎn)換 生理鹽水或緩沖液酸堿度 抗原 抗體均是有生物活性的蛋白質(zhì) 強(qiáng)酸強(qiáng)堿均能使蛋白質(zhì)變性 降低抗原抗體的活性甚至使之失活 酸堿度 pH6 pH9溫度 在一定范圍內(nèi) 提高溫度能加速抗原抗體反應(yīng) 溫度 15 40 37 最適 66 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的類型沉淀反應(yīng) 凝集反應(yīng) 細(xì)胞溶解反應(yīng) 中和反應(yīng) 標(biāo)記免疫的抗原抗體反應(yīng)等 分類的目的是便于我們能在免疫檢測(cè)時(shí)識(shí)別免疫反應(yīng)是否發(fā)生及發(fā)生的程度 來(lái)進(jìn)行免疫檢測(cè)結(jié)果的判斷 67 衡量免疫檢驗(yàn)水平的指標(biāo) 靈敏度特異性準(zhǔn)確度精確度線性可以了解該方法的最高檢測(cè)值和最低檢測(cè)值 可確定該方法的檢測(cè)范圍 以防止含量過(guò)低或過(guò)高樣品的檢測(cè)誤差 穩(wěn)定性簡(jiǎn)易性安全性價(jià)格 68 第三章免疫原和抗血清的制備 69 免疫診斷試劑 用于檢測(cè)相應(yīng)抗原 抗體或機(jī)體免疫狀態(tài)的試驗(yàn)診斷制劑 免疫學(xué)檢測(cè) 用已知抗原檢測(cè)抗體 或用已知抗體檢測(cè)抗原 免疫試劑主要的生物原材料是抗原和抗體 70 天然抗體 未經(jīng)明顯自然感染或人工免疫而在體內(nèi)產(chǎn)生的血清抗體 如針對(duì)ABO紅細(xì)胞血型物質(zhì)的抗體等 多屬I(mǎi)gM類 特異性抗體 抗原激發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗體特異性抗體是免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物 也是免疫檢測(cè)中的試劑 人工制備抗體 多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體 71 多克隆抗體 polyclonalantibody pAb 抗原表位刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆 產(chǎn)生針對(duì)抗原分子上一種或多種表位的抗體的混合物 免疫原 完全抗原 既能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答 也能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物特異性結(jié)合 72 抗血清 含有針對(duì)特定抗原的多克隆定向抗體的動(dòng)物血清 可來(lái)源于用免疫原免疫的動(dòng)物血液 也可來(lái)源于病原微生物感染者的血液 多克隆抗體制備 1 免疫原免疫動(dòng)物 2 抗血清的獲取及多克隆定向抗體的純化鑒定 73 第一節(jié)免疫原的制備 多克隆抗體的制備必須有高純度的免疫原 否則無(wú)法獲得特異 高效多克隆抗體 制備單克隆抗體對(duì)免疫原純度的要求相對(duì)低 除人工模擬抗原外 含天然抗原的物質(zhì)多數(shù)成份復(fù)雜 需要提取 純化后方能作為免疫原應(yīng)用 可作為免疫原的抗原 顆粒性抗原 細(xì)胞 細(xì)菌 寄生蟲(chóng)可溶性抗原 蛋白質(zhì) 糖蛋白 脂蛋白 核酸 74 一 顆粒性抗原的制備細(xì)菌 病毒 細(xì)胞 寄生蟲(chóng)等 不同的顆?？乖兓椒ú煌?一般較為簡(jiǎn)單 如生理鹽水洗滌 甲醛處理等 75 二 可溶性抗原的制備和純化 蛋白質(zhì) 細(xì)菌毒素都是良好的可溶性抗原1 組織細(xì)胞抗原的制備 材料新鮮低溫保存 以防蛋白質(zhì)變性 去除包膜 結(jié)締組織 大血管 清洗灌注 剪成小塊 粉碎 機(jī)械搗碎 研磨等 低溫離心取上清 76 2 培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備 反復(fù)凍融法 20 凍結(jié) 然后室溫融化超聲破碎法 超聲波 1 20kHz 自溶法 自身酶系酶處理法 溶菌酶 纖維素酶 蝸牛酶表面活性劑處理法 SDS 去氧膽酸鈉 二乙基十六烷基溴 77 免疫球蛋白片段的制備 非共價(jià)鍵解離法 改變pH 利用強(qiáng)變性劑使肽鏈亞單位解離共價(jià)鍵解離法 氧化法和還原法 解離二硫鍵 使輕鏈和重鏈分開(kāi)溴化氰裂解法 斷開(kāi)肽鏈酶解法 木瓜酶 胃蛋白酶 78 超速離心法 差速離心法 低速和高速離心交替進(jìn)行 分離大小差別較大的抗原密度梯度離心法 區(qū)帶離心法分離具有不同沉降速度的物質(zhì) 二 可溶性抗原的純化 79 差速離心 低速離心和高速離心交替進(jìn)行 逐步分級(jí)加大離心力 分步獲取沉淀系數(shù)不同的物質(zhì) 兩種物質(zhì)粒子的沉降系數(shù)相差一個(gè)數(shù)量級(jí) 10倍 以上 用差速離心反復(fù)多次可達(dá)到良好的分離效果 按轉(zhuǎn)速 普通 500 4000 高速 8000 25000 超速 25000 80000 超高速 150000rpm 蛋白質(zhì)沉降系數(shù)在2 25之間 一般需要60000rpm以上才能分離 80 2 沉降平衡法 用于分離密度不同的物質(zhì) 密度梯度離心 離心時(shí)離心管中的介質(zhì)是不均一的 從近中心到遠(yuǎn)中心密度不斷增加形成梯度 分離物在離心力作用下 各自停留在與其密度相同的區(qū)域 分層收集 達(dá)到分離效果 常用的梯度介質(zhì)有蔗糖 甘油 氯化銫等 最大密度各不相同 選用介質(zhì)要注意浮力密度范圍合適 被分離物質(zhì)的密度不能大于介質(zhì)的最大密度 81 選擇性沉淀法 核酸去除法 氯化錳 硫酸魚(yú)精蛋 鏈霉素 組織細(xì)胞提取的抗原含有大量核酸 可用氯化錳等沉淀劑去除 也可用DNA和RNA酶將其降解 鹽析法 硫酸銨 硫酸鈉有機(jī)溶劑沉淀法 乙醇 丙酮有機(jī)溶劑能破壞蛋白質(zhì)的水化膜 暴露疏水性氨基酸殘基 增加蛋白質(zhì)上不同電荷引力 引起使蛋白質(zhì)沉淀 尤其在等電點(diǎn)的條件下 沉淀更快速更完全 聚合物沉淀法 聚乙二醇 82 四 凝膠過(guò)濾根據(jù)物質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離 凝膠層析的支持介質(zhì)由惰性的多孔顆粒組成 在層析過(guò)程中 被分離物質(zhì)不僅隨洗脫液均勻向下運(yùn)動(dòng) 而且無(wú)定向在顆粒小孔中擴(kuò)散 大分子不能進(jìn)入顆粒 只能沿顆粒間的空隙隨洗脫液向下移動(dòng) 較快到達(dá)底部并從柱中流出 小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠顆粒的孔隙內(nèi) 在顆粒內(nèi)及顆粒間擴(kuò)散 從一個(gè)顆粒進(jìn)入另一個(gè)顆粒 因此向下流動(dòng)的速度慢 83 五 離子交換層析離子交換劑以一種惰性物質(zhì)為支持物 通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)引入帶電基團(tuán) 可以靜電吸附離子 以靜電作用結(jié)合在離子交換劑上的離子稱為平衡離子 蛋白質(zhì)分子在偏等電點(diǎn)的pH值時(shí)可以帶不同的電荷 因此可以置換離子交換劑上的平衡離子 和離子交換劑結(jié)合 不同蛋白質(zhì)有不同的pI 在同一pH下 各種蛋白質(zhì)所帶的電荷種類和數(shù)量不同 因此置換平衡離子的能力不同 利用這個(gè)原理 可以將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)分開(kāi) 離子交換劑的支持物 樹(shù)脂 纖維素和葡聚糖凝膠 84 親和層析法 利用生物大分子之間具有的專一性親和力 1 親和層析支持物的選擇 非特異性吸附低 液體流速快 在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定 有合適豐富的化學(xué)基團(tuán) 與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合 有豐富的微孔 以增加結(jié)合容量 最常用的支持物是Separose4B 85 2 配體的選擇條件 配體指具有親和力的雙方 這里指抗原和抗體 抗原或抗體必須單一特異性 抗原與抗體必須具有較高的親和力 配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán) 86 3 抗原或抗體與支持物的結(jié)合 活化支持物的功能基團(tuán) 溴化氰 接 手臂 抗原或抗體與支持物結(jié)合 87 4 親和層析條件的選擇 封閉活性基團(tuán) 用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過(guò)柱 除去未結(jié)合和結(jié)合不牢的蛋白 先用NaHCO3洗脫 再用解脫劑處理 解脫劑 3mol L硫氰酸鉀 或鈉 0 1mol LpH2 4甘氨酸緩沖液 88 電泳法 利用分子量和電荷量不同進(jìn)行分離 89 蛋白質(zhì)種類繁多性質(zhì)各異 可采用的純化方法也很多 無(wú)論何種方法 都是根據(jù)蛋白質(zhì)以下幾種性質(zhì)設(shè)計(jì)的分離方法 1 溶解度不同 2 分子大小不同 3 帶電荷的性質(zhì)不同 4 物理吸附性不同 5 生物學(xué)親和性不同 90 蛋白質(zhì)分離純化的策略 了解純化對(duì)象 明確純化目的 調(diào)查所具備的實(shí)驗(yàn)條件 設(shè)計(jì)純化方案 91 三 純化抗原的鑒定 蛋白含量測(cè)定 紫外吸收法 雙縮脲法 酚試劑法分子量測(cè)定 SDS PAGE 凝膠過(guò)濾純度鑒定 醋酸纖維膜電泳 SDS PAGE 毛細(xì)管電泳 等電聚焦 高效液相層析免疫活性鑒定 雙向免疫擴(kuò)散 免疫電泳 ELISA 92 三 半抗原性免疫原的制備 半抗原 hapten 僅有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)如多肽 甾體激素 核苷 某些藥物等 載體 carrier 賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì) 93 常用載體 蛋白質(zhì)缺點(diǎn) 載體本身也是免疫原 其分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于半抗原 因此刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體大部分為抗載體的抗體 抗半抗原的載體效價(jià)和純度皆不理想 多肽聚合物 多抗原肽 MAP 常用多聚賴氨酸 多聚賴氨酸只起連結(jié)作用 本身沒(méi)有免疫原性 采用MAP作為免疫原 較易獲得高效價(jià) 高純度的抗多肽半抗原的抗血清 大分子聚合物常用羥甲基纖維素等 可與半抗原結(jié)合 加入弗氏佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體 94 物理方法 通過(guò)電荷和微孔吸附半抗原吸附的載體有CMC PVP 硫酸葡聚糖等 二 半抗原與載體的連接方法 化學(xué)方法 利用某些功能基團(tuán)將半抗原連接到載體上帶有游離氨基或羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原 碳二亞胺法戊二醛法混和酸酐法過(guò)碘酸氧化法不帶氨基和羧基的半抗原 用化學(xué)方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物 再與載體連接 95 三 半抗原性免疫原的鑒定 一個(gè)載體分子至少要連接20個(gè)以上的半抗原分子 才能刺激產(chǎn)生抗體 測(cè)定半抗原與載體比例的方法 1 吸收光譜分析法2 放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法 96 第二節(jié)免疫佐劑 免疫佐劑 immunoadjuvant 預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi) 可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑 簡(jiǎn)稱佐劑 adjuvant 97 第二節(jié)免疫佐劑 一 佐劑的種類化合物 氫氧化鋁 明礬 礦物油 吐溫 80 弗氏不完全佐劑等生物制劑 如卡介苗 短小棒狀桿菌 百日咳桿菌細(xì)胞因子等 用于人體的佐劑 氫氧化鋁 明礬 polyI C 胞壁酰二肽 細(xì)胞因子 熱休克蛋白常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐劑 弗氏佐劑 Freund sadjuvant 98 二 佐劑的生物學(xué)作用增強(qiáng)免疫原性 使免疫原性弱的物質(zhì)變?yōu)閺?qiáng)免疫原 增加抗體的滴度 包括初次和再次免疫應(yīng)答的抗體滴度 改變抗體類型 可由產(chǎn)生IgM轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG 或由IgG轉(zhuǎn)變?yōu)镮gE等其它類型抗體 99 三 佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制1 改變抗原物理形狀 使抗原在體內(nèi)滯留或緩慢釋放 延長(zhǎng)抗原與免疫細(xì)胞作用的時(shí)間 增強(qiáng)抗原免疫原性 2 抗原經(jīng)佐劑作用后 易被巨噬細(xì)胞吞噬 加工處理 3 刺激單核 巨噬細(xì)胞活化 釋放細(xì)胞因子 4 刺激淋巴細(xì)胞增生分化 100 第三節(jié)抗血清的制備 抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動(dòng)物 該動(dòng)物在含有多種抗原表位的抗原刺激下 體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)某一抗原多種不同表位的抗體 其混合物為多克隆抗體目的 獲取高質(zhì)量的多克隆特異性抗體 需要高質(zhì)量的免疫原 合適的動(dòng)物和有效的免疫方案 101 抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬的關(guān)系種屬差異越遠(yuǎn) 免疫原性越強(qiáng)動(dòng)物個(gè)體的選擇適齡 健康 體重符合要求抗原的性質(zhì)不同性質(zhì)的免疫原 適用的動(dòng)物有所不同 一 免疫動(dòng)物的選擇 102 二 免疫方法和途徑抗原劑量 在一定范圍內(nèi) 抗原量與免疫強(qiáng)度成正相關(guān) 抗原量過(guò)大或過(guò)小均易產(chǎn)生免疫耐受 注射途徑 抗原的進(jìn)入途徑?jīng)Q定了抗原吸收 分布和代謝的速度 常用的注射途徑及對(duì)抗原的吸收速度 靜脈 脾臟 淋巴結(jié) 腹腔 肌肉 皮下 皮內(nèi) 103 免疫間隔時(shí)間 根據(jù)免疫原的強(qiáng)弱 代謝情況等決定 一般情況下 第一次加強(qiáng)免疫應(yīng)在基礎(chǔ)免疫后的2 3周 以后每7 10天加強(qiáng)一次 加強(qiáng)免疫的次數(shù) 應(yīng)檢測(cè)血清中的抗體滴度 決定加強(qiáng)免疫的次數(shù) 104 免疫動(dòng)物血清中的抗體滴度合格后即可放血 頸動(dòng)脈采血法 家兔 綿羊 山羊心臟采血法 家兔 豚鼠 大鼠 雞靜脈采血法 家兔 山羊 綿羊血液自然凝固后離心 采集血清 三 動(dòng)物采血法 105 抗體特異性的鑒定 雙向免疫擴(kuò)散法抗體效價(jià)的鑒定 凝集試驗(yàn) 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) ELISA抗體純度的鑒定 SDS PAGE 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 免疫電泳抗體親合力的鑒定 平衡透析法 ELISA RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn) 一 抗血清的鑒定 106 第四節(jié)抗血清的鑒定和保存 一 抗血清的鑒定鑒定的目的 確定有無(wú)目的抗體的存在 含量高低 親和力如何 主要鑒定指標(biāo) 效價(jià) 特異性 抗體純度 抗體親合力等 鑒定方法 單擴(kuò) 雙擴(kuò) ELISA等 二 抗血清的保存2 8 保存 短期保存冰凍保存 保存5年真空干燥保存 保存5 10年反復(fù)凍溶會(huì)嚴(yán)重影響抗體的活性 107 第五節(jié)抗血清的純化抗原免疫動(dòng)物制備的抗血清是成分復(fù)雜的混合物 除含有特異性抗體外 還存在與目的抗體不相關(guān)的成分 純化目的是除去這些不相關(guān)成分 防止抗血清中其他雜質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果 108 鹽析法 硫酸銨鹽析法 硫酸鈉鹽析法凝膠過(guò)濾法 常結(jié)合鹽析法離子交換層析法 DEAE纖維素 QAE sephadex QAE纖維素親和層析法 純化抗原或SPA交聯(lián)Sepharose4B制成親和層析柱 一 特異性IgG抗體 109 單價(jià)特異性是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng) 親和層析法 雜抗原交聯(lián)Sepharose4B柱吸附劑方法 借助雙功能試劑用不含特異抗原的抗原混合液制成固相吸附劑 吸附抗血清中的雜抗體 二 單價(jià)特異性抗血清 110 第四章 單克隆抗體和基因工程抗體的制備 111 1975年Kohler和Milstein成功地將綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 制備出小鼠抗綿羊紅細(xì)胞的單克隆抗體 單克隆抗體在醫(yī)學(xué)生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的用途 免疫檢驗(yàn)由于單克隆抗體的出現(xiàn) 取得了巨大的進(jìn)展 112 單克隆抗體 monoclonalantibody McAb 借助B細(xì)胞雜交瘤技術(shù) 由單個(gè)B細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的 高度均一的 單一特異性的抗體 單克隆抗體的特點(diǎn) 結(jié)構(gòu)均一 純度高 特異性強(qiáng) 效價(jià)高 交叉反應(yīng)少或無(wú) 易于制備 113 單克隆抗體制備的基本原理致敏的B淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體 但不能在體外長(zhǎng)期存活 骨髓瘤細(xì)胞可以在體外大量繁殖 但不能分泌特異性抗體 將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞和能分泌抗體的B淋巴細(xì)胞融合 則融合的雜交瘤細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞易繁殖的特性 又具有B淋巴細(xì)胞分泌抗體的能力 由于每個(gè)致敏的B淋巴細(xì)胞只針對(duì)單一的抗原表位產(chǎn)生抗體 所以克隆化的雜交瘤細(xì)胞能夠分泌針對(duì)單一表位的單克隆抗體 114 一 B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù) 一 細(xì)胞的選擇和融合制備B淋巴細(xì)胞雜交瘤的目的是生產(chǎn)特異性的單克隆抗體 融合細(xì)胞的一方必須是能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞 通常來(lái)源于免疫小鼠的脾細(xì)胞 融合細(xì)胞的另一方是為了保持細(xì)胞的不斷增殖 只有腫瘤細(xì)胞才有這種特性 同時(shí)這種細(xì)胞本身不分泌免疫球蛋白 選擇同一體系的細(xì)胞能增強(qiáng)融合的成功率 骨髓瘤是B淋巴細(xì)胞系的惡性腫瘤 是脾細(xì)胞最理想的融合對(duì)象 細(xì)胞融合的方法多采用化學(xué)試劑助融 最常用的細(xì)胞融合劑為PEG 115 二 選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合液中 細(xì)胞融合是隨機(jī)的 可能出現(xiàn)的細(xì)胞形式 融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞 融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞 融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞 未融合的脾細(xì)胞 未融合的瘤細(xì)胞 細(xì)胞的多聚體 融合及未融合的脾細(xì)胞體外不能長(zhǎng)期存活 細(xì)胞的多聚體也容易死亡 融合和未融合的瘤細(xì)胞則需篩選去除 116 選擇性培養(yǎng)基 只有雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng) HAT選擇性培養(yǎng)基的原理 骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT缺陷株 或TK缺陷株 HGPRT和TK是細(xì)胞合成DNA和RNA旁路途徑上兩種重要的酶 如果缺乏其中任何一種 在正常合成途徑受阻的情況下 細(xì)胞將不能利用旁路途徑而死亡 HAT的A為氨甲喋呤 是一種正常途徑的阻斷劑 H和T分別為次黃嘌呤和胸腺嘧啶 它們分別是HGPRT和TK的底物 具備HGPRT和TK的細(xì)胞在正常途徑受阻時(shí) 可利用H和T依靠旁路途徑合成DNA和RNA繼續(xù)生存 在雜交瘤的制備中 致敏的B淋巴細(xì)胞含有HGPRT和TK 可彌補(bǔ)骨髓瘤細(xì)胞缺陷 因此只有雜交的細(xì)胞能在HAT選擇性培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活 其余未雜交的細(xì)胞都將死亡 117 流程 一 雜交瘤技術(shù) 118 三 有限稀釋與抗原特異性選擇克隆化 一種抗原有多個(gè)表位 一個(gè)B細(xì)胞只分泌針對(duì)一個(gè)表位的抗體 一個(gè)動(dòng)物在受到抗原刺激后的體液免疫應(yīng)答 是眾多B細(xì)胞克隆針對(duì)不同表位的抗體分泌 針對(duì)目的抗原表位的B細(xì)胞只是少數(shù) 所以并非所有的雜交細(xì)胞都能分泌針對(duì)目的表位的特異性抗體 需要進(jìn)行用單細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行篩選 119 篩選過(guò)程 融合細(xì)胞的克隆化 將融合細(xì)胞充分稀釋 使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)理論上為一個(gè) 細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋10 20 孔底時(shí) 吸取培養(yǎng)上清檢測(cè)抗體分泌情況 篩選出高抗體分泌孔 將高抗體分泌孔中的細(xì)胞再克隆化 ELISA再次鑒定 選出高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存 120 防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡 細(xì)胞冷凍的意義 121 配制方案 雜交瘤細(xì)胞 1 5 x106 ml 細(xì)胞凍存液 30 40 牛血清 50 60 RPMI 1640培養(yǎng)液 10 DMSO 慢凍 分步冷凍 30 70 液氮 快融 取出立即浸入37 40 水浴中 使其迅速融化 復(fù)蘇 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 122 三 陽(yáng)性雜交細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 雜交瘤形成的初期很不穩(wěn)定 在最初幾天染色體容易丟失 雜交瘤細(xì)胞丟失了目的抗體表達(dá)的基因 仍能生長(zhǎng)繁殖 必須將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次的單細(xì)胞分離培養(yǎng) 以確保單克隆抗體的純一性 避免陰性細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)的影響 123 第二節(jié)單克隆抗體的制備技術(shù) 大量制備單克隆抗體的方法有兩類 動(dòng)物體內(nèi)誘生法 1 腹水型McAb的制備 接種雜交瘤細(xì)胞至小鼠腹腔 待小鼠腹部明顯膨大到一定程度時(shí) 抽取腹水 離心取上清 2 血清型McAb的制備 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射 待腫瘤到達(dá)一定大小后采血分離血清 體外培養(yǎng)法 體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞分泌McAb 收集離心培養(yǎng)上清 124 二 單克隆抗體的純化無(wú)論是腹水還是培養(yǎng)上清 均含有脂蛋白 脂質(zhì) 細(xì)胞碎片等雜質(zhì) 通常采用過(guò)濾的方法去除脂質(zhì)和大顆粒 用離心的方法去除細(xì)胞碎片和大的蛋白聚合物 初步處理后 再按要求采用合理的純化步驟 親和層析 125 Ig類型 亞類測(cè)定 雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測(cè)定 抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測(cè)定 用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示表位測(cè)定 幾株單抗是否為不同表位特異的 用競(jìng)爭(zhēng)抑制法 相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測(cè)定 測(cè)定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體 秋水仙素裂解法 小鼠B細(xì)胞染色體40條 SP2 0細(xì)胞68條 雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量 常用westernblot 三 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 126 單克隆抗體的特性 高度特異性高度的均一性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對(duì)環(huán)境敏感性 單克隆抗體的特性 127 優(yōu)點(diǎn) 在體外 永久 地存活并傳代用相對(duì)不純的抗原 獲得大量高度特異的 均一的抗體 適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療 二 單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性 局限性 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜 費(fèi)時(shí)費(fèi)工 價(jià)格較高 128 第三節(jié)基因工程抗體技術(shù) 根據(jù)研究者的意圖 采用基因工程方法 在基因水平 對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割 拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá) 產(chǎn)生新型抗體 主要包括嵌合抗體 單鏈抗體 人源化抗體 雙價(jià)抗體和雙特異性抗體 129 一 人源化抗體鼠源單克隆抗體的編碼基因經(jīng)DNA重組改造 其部份氨基酸序列為人源序列所代替 保留原來(lái)鼠單抗的特異性和親和力 最大限度地降低鼠單抗的異源性 從而有利于診斷和治療 130 方法 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因 與人Ig恒定區(qū)基因連接 插入適當(dāng)表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 表達(dá)人 鼠嵌合抗體特點(diǎn) 減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力 一 嵌合抗體 131 嵌合抗體 1