常用試劑與培養(yǎng)基.doc

第九章 微生物實驗室常用試劑與培養(yǎng)基 第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片1.桿菌肽紙片（0.04U/片），抑菌圈10mm為敏感。質(zhì)控菌株 A群鏈球菌陽性 D群鏈球菌陰性 2.SMZ紙片（1.25g/23.75g/片），出現(xiàn)抑菌圈即為敏感。質(zhì)控菌株 D群鏈球菌陽性 A群鏈球菌陰性 3.新生霉素紙片（5.0g/片），抑菌圈16mm為敏感。質(zhì)控菌株 表皮葡萄球菌陽性 腐生葡萄球菌陰性 4.O129紙片、奧普托欣（Optochin）紙片參見第五節(jié)生化試驗培養(yǎng)基。二、診斷用血清1.沙門菌屬診斷血清A-F群O多價血清特異O群因子血清 常用的有O2，O4，O7，O9，O10特異H因子血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子血清。 2.志賀菌屬診斷血清 志賀菌屬四種多價血清（含有痢疾志賀、福氏、宋內(nèi)志賀） 痢疾志賀菌、血清。 福氏志賀菌多價血清及分型血清（1-6型）。 宋內(nèi)志賀菌診斷血清（除光滑相抗血清外，能制備粗糙相抗血清）。 鮑氏志賀菌多價血清及分型血清。3.致病性大腸埃希菌診斷血清腸致病性大腸埃希菌（EPEC）診斷血清。產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）診斷血清。腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）診斷血清。腸出血性大腸埃希菌（EHEC）診斷血清O157：H7。 4.霍亂弧菌O1、O139混合多價診斷血清及稻葉、小川、彥島O139分型血清。 5.腦膜炎奈瑟菌多價血清及分群血清。 6.鏈球菌分類診斷血清。 7.肺炎鏈球菌診斷血清。8.耶爾森菌診斷血清。三、常用染色液(一)革蘭染色液1. 結(jié)晶紫溶液A液 結(jié)晶紫 20g 95%乙醇 20mlB液 草酸銨 0.8g蒸餾水 80ml需在用前24小時將A液. B液混合,過濾后裝入試劑瓶內(nèi)備用。2.碘液 碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300ml將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補足水量。也可用少量蒸餾水將碘化鉀完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。3.脫色液 95%乙醇4.復(fù)染液A貯存液 沙黃 2.5g 95%乙 100mlB應(yīng)用液:A液 10ml蒸餾水 90ml(二)抗酸染色液1堿性復(fù)紅染色液(1)萋納石炭酸復(fù)紅溶液堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液 10ml5%石炭酸溶液 90ml(2)脫色液濃鹽酸 3ml95%乙醇 97ml(3)復(fù)染液(呂弗勒美藍液)美藍乙醇飽和溶液 30ml100g/L氫氧化鉀 0.1ml蒸餾水 100ml2.金胺0-羅丹明B染色液(1) 羅丹明B液 羅丹明B0.1g加蒸餾水100ml。(2)1g/L金胺O液 金胺O液0.1g加蒸餾水95ml,再加入純石炭酸 5ml,混勻。(3)3%鹽酸酒精(4)稀釋美藍液 呂弗勒美藍液100ml,加蒸餾水90ml,混勻。(三)鞭毛染色液(改良Ryu法)A液 5%石炭酸 10ml鞣酸 2g飽和硫酸鋁鉀液 10mlB液 結(jié)晶紫酒精飽和液 應(yīng)用液A液10份,B液1份,混合,室溫存放備用。(四)異染顆粒染色液甲液 甲苯胺藍 0.15g孔雀綠 0.2g95% 乙醇 2.0ml蒸餾水 100ml乙液 碘 2g 碘化鉀 3g 蒸餾水 300ml先將碘化鉀加入少許蒸餾水(約2ml),充分振搖,待完全溶解,再中入碘,使完全溶解后, 加蒸餾水至300ml。(五)莢膜染色液1印度墨汁或50g/L黑色素水溶液25g/L苯胺蘭水溶液第二節(jié) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基一、液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(一)蛋白胨水(Peptone water)用途 1.供細菌靛基質(zhì)試驗用。 2.一般細菌培養(yǎng)和傳代。 配法 蛋白胨（或胰蛋白胨） 10g Nacl 5g 蒸餾水 1L pH 7.2 將上述成分溶于水中，校正pH,分裝試管，每管23ml，置121滅菌15min備用。 質(zhì)量控制大腸埃希菌 生長良好，靛基質(zhì)陽性；傷寒沙門菌 生長良好，靛基質(zhì)陰性。(二)營養(yǎng)肉湯(Nutrient broth)用途 供一般細菌的增菌培養(yǎng)，加入1%的瓊脂粉亦可作營養(yǎng)瓊脂。配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3gNacl 5g蒸餾水 1LpH 7.4 將上述成分稱量混合溶解于水中，校正pH，按用途不同分裝于燒瓶或試管內(nèi)。經(jīng)121滅菌15min，作無菌試驗后冷藏備用。 質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌 生長良好。保存 置冰箱3周內(nèi)用完。 (三)牛肉浸液培養(yǎng)基 用途 細菌培養(yǎng)最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，除用于一般細菌的培養(yǎng)外，又可以作營養(yǎng)瓊脂及其它培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。 配法 新鮮除脂牛肉 500g Nacl 5g 蛋白胨 10g 蒸餾水 1L pH 7.47.6 1.先將牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切塊絞碎。稱取500g置容器加入蒸餾水1L，攪勻后置冰箱過夜，次日煮沸加熱30min，并用玻棒不時攪拌用絨布或麻布進行粗過濾，再用脫脂棉過濾即成。在過濾中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g溶解后，用NaOH溶液矯正pH至7.67.8，并加熱煮沸10min，補充蒸餾水至1L，最后用濾紙過濾，呈清晰透明、淡黃色液體，經(jīng)12115min滅菌備用。 2.根據(jù)用途不同可以制成營養(yǎng)肉湯，以此為基礎(chǔ)制成其它培養(yǎng)基。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15g/L20g/L即可。質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌等均生長良好。 保存 置4冰箱內(nèi)可以使用較長時間。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量為3g/L5g/L。二、固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (一)營養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar) 用途 供一般細菌和菌株的純化及傳種用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g Nacl 5g 瓊脂粉（優(yōu)質(zhì)） 12g 蒸餾水 1L pH 7.27.4 將上述成分(除瓊脂外)溶于水中，校正pH后加入瓊脂，煮沸溶解，根據(jù)用途不同進行分裝，經(jīng)121滅菌15min，傾注平板或制成斜面，冷藏備用。 質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌 菌落淺黃色； 痢疾志賀菌 菌落無色；銅綠假單胞菌 菌落無色或淺綠色。保存 置4冰箱保存，兩周內(nèi)用完。 (二)血瓊脂培養(yǎng)基(Blood agar medium) 用途 供一般病原菌的分離培養(yǎng)和溶血性鑒別及保存菌種用。配法 pH7.47.6牛肉浸液瓊脂 100ml 脫纖維羊血(或兔血) 510ml 將血瓊脂基礎(chǔ)經(jīng)121滅菌15min，待冷卻至50左右以無菌手續(xù)加入羊血，搖勻后立即傾注滅菌平皿內(nèi)，待凝固后，經(jīng)無菌實驗冷藏備用。 質(zhì)量控制 化膿性鏈球菌ATCC 19615生長良好，-溶血；肺炎鏈球菌ATCC 6303生長良好，-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生長良好,不溶血。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 (三)巧克力瓊脂培養(yǎng)基 用途 主要用于嗜血桿菌的分離培養(yǎng)，亦可用于奈瑟菌的增殖培養(yǎng)。 配法 鮮牛肉浸出液 1L蛋白胨 10g Nacl 5g 瓊脂粉 12g 無菌脫纖維羊血或兔血 100ml 將上述成分（除兔血外）加熱溶解，調(diào)pH7.2，置12115min高壓滅菌，待冷至約85，以無菌方法加入兔血，搖勻后置85水浴中，維持該溫度10min，使之成巧克力色。取出置室溫冷至約50，傾注平板或制成斜面?zhèn)溆谩?質(zhì)量控制 流感嗜血桿菌ATCC 10211、肺炎鏈球菌ATCC 6305生長良好，菌落典型。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 (四)胱氨酸胰化酪蛋白瓊脂（CTA）用途 常用于測定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營養(yǎng)要求較高細菌的糖發(fā)酵試驗。 配法 胱氨酸 0.5g 胰化酪蛋白 20g NaCl 5g 亞硫酸鈉 0.3g 瓊脂 3.5g 酚紅 0.0175g 蒸餾水 1L 將上述成分（酚紅除外）混合溶解，調(diào)pH至7.2，加入酚紅指示劑。分裝試管，11515min滅菌。用于測定糖發(fā)酵時，按需要加入各種糖溶液，將待檢標本直接種于培養(yǎng)基管內(nèi)，置35孵箱，18h24h觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽性，不變色為陰性。第三節(jié) 保存和增菌培養(yǎng)基一、菌種保存培養(yǎng)基 (一)皰肉培養(yǎng)基(Chopped meat medium) 配法 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液（pH7.6） 7ml 將干燥的肉渣0.5克裝入15mm150mm試管內(nèi)，再加入pH7.6牛肉浸液7ml，兩者高度比例為12。在試管液面上加一層34mm高度的融化凡士林，用橡皮塞塞緊，經(jīng)121滅菌15min后，置4冰箱備用。質(zhì)量控制破傷風桿菌或壞死梭桿菌48h的培養(yǎng)物，稀釋1000倍，每管接種0.01ml，生長良好。保存置4冰箱內(nèi)，數(shù)月有效。(二)半固體培養(yǎng)基(Semi-solid medium) 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 3g Na2HPO412H2O 2g 瓊脂粉 4.5g 蒸餾水 1L pH 7.47.6 將上述成分混合于水中，加熱溶解，調(diào)pH至7.47.6，分裝試管內(nèi)的2/3左右的高度，12115min高壓滅菌，備用。 質(zhì)量控制 大腸埃希菌(ATCC25922)生長良好,動力陽性。 福氏志賀菌(ATCC12022)生長良好,動力陰性。 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)生長良好,動力陰性。培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。二、增菌培養(yǎng)基(enrichment medium) (一)葡萄糖肉湯 用途 用于血液增菌。 配法 蛋白胨(或月示 胨) 10g NaCl 5g 肉浸液（或心浸液） 1L 葡萄糖 3g 枸櫞酸鈉 3g 5g/L對氨基苯甲酸水溶液 10ml 1mol/L MgSO47H2O 20ml 青霉素酶 1000U 將蛋白胨、NaCl混合于肉浸液中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸5min，并補足失水，調(diào)整pH至7.8。過濾分裝，每瓶50ml，高壓滅菌11520min后，每瓶加入青霉素酶50U，經(jīng)無菌試驗合格后，冷卻備用。 將采取的血液標本，以無菌手續(xù)注入培養(yǎng)瓶中（血液1ml，培養(yǎng)液10ml），置35培養(yǎng)箱內(nèi)，每日取出觀察一次結(jié)果。如有細菌生長，可出現(xiàn)數(shù)種不同的表現(xiàn)，應(yīng)隨時作分離培養(yǎng)，可選用血瓊脂、EMB及巧克力平板等。無細菌生長表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶，需連續(xù)觀察7天，仍無細菌生長方可棄去。在觀察的過程中，至少應(yīng)作兩次分離培養(yǎng)。注:1.枸櫞酸鈉為抗凝劑，使血液加入培養(yǎng)基中不凝固。 2.對氨基苯甲酸主要能中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。 3.硫酸鎂主要能破壞血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。4.本培養(yǎng)基近年來有許多改良配方，如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加營養(yǎng)；加0.2%核酸刺激細菌生長；加0.1%粘液素能被覆于細菌的表面，保護細菌免受抗體破壞；加入聚茴香腦磺酸鈉（SPS）能中和補體抗藥作用提高檢出率。 (二)血液增菌培養(yǎng)基(Blood enriched medium) 用途 供血液和骨髓液病原菌的增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g Nacl 5g 牛肉膏 3g 葡萄糖 1g 酵母膏粉 3g 枸櫞酸鈉 3g K2HPO4 2g 5g/L對氨基苯甲酸 5ml 1mol/LMgSO4。7H2O 20ml 4g/L酚紅溶液 6ml 青霉素酶 50U 聚茴香腦磺酸鈉(SPS) 0.3g 蒸餾水 1L pH 7.4 將上述成分（除酚紅指示劑、青霉素酶外）混合加熱溶解，校正pH至7.4，再加酚紅，過濾分裝每瓶3050ml，經(jīng)121滅菌15min經(jīng)3524h無菌試驗備用。臨用時每瓶加入1.52.5U青霉素酶。質(zhì)量控制 傷寒沙門菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化膿性鏈球菌ATCC 19615、肺炎鏈球菌ATCC 6305、金黃色葡萄菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853均生長良好。 (三)亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基(SF)（Selenite enrichment medium） 用途 供沙門菌增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 5g 乳糖 4g 磷酸氫二鈉 4.5g 磷酸二氫鈉 5.5g 亞硒酸氫鈉 4g 蒸餾水 1L pH 7.07.1 先將亞硒酸鹽加到200ml蒸餾水中，充分搖勻溶解。其它成分稱量混合，加入蒸餾水800ml，加熱溶解，待冷卻后兩液混合，充分搖勻，校正pH7.07.1(調(diào)整磷酸鹽緩沖對的比例來校正pH值)。最后分裝于15mm150mm的試管內(nèi)，每管10ml。置水浴隔水煮沸10min15min，立即冷卻，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?取新鮮便例標本1g或棉拭子采樣直接種于該培養(yǎng)管內(nèi)。搖動后置35培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細菌生長。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如SS瓊脂、HE瓊脂或麥康凱平板等，進行培養(yǎng)。質(zhì)量控制培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或無色，透明無沉淀物。增菌靈敏度 傷寒沙門菌110-5，鼠傷寒及副傷寒沙門菌110-7。保存 4保存，1周內(nèi)用完。 注：1.亞硒酸鹽，包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉、原則上均可使用。但以亞硒酸氫鈉效果為好。 2.磷酸鹽緩沖對，兩者的用量比例與含量和亞硒酸鹽及蛋白胨的品種有關(guān)。制備前應(yīng)進行調(diào)試，其總量為10g/L。 3.在制備過程中，亞硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時間亦不能超過規(guī)定時間，否則亞硒酸鹽會變質(zhì)，生成紅色沉淀物，而降低抑制性。4.培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色，有紅色沉淀物出現(xiàn)時不可再用。 (四)SS增菌液(Salmonella Shigela Enrichment Broth) 用途 用于沙門、志賀菌的增菌。 配法月示 胨 2g蛋白胨 8g 牛肉膏 3.5g 酵母膏 2g 葡萄糖 2g 枸櫞酸鐵 10g 硫代硫酸鈉 10g 亞硫酸鈉 0.7g 膽鹽 5.5g Na2HPO4 4g KH2PO4 0.1g 去氧膽酸鈉(進口) 1.5g煌綠 0.005g 蒸餾水 1L pH 7.1 將上述成分加熱溶于水中，分裝試管（150mm15mm），每管57ml，隔水煮沸5min備用。 取病人糞便標本1g直接種于增菌液內(nèi)，3516h18h培養(yǎng)，取出分離平板即可。 質(zhì)量控制 培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC50096,福氏志賀菌ATCC12022 生長良好；大腸埃希菌ATCC25922 抑制生長。 注：1.切勿高壓，隔水煮沸時間不宜超過5min。 2.煌綠用量應(yīng)根據(jù)不同批號酌情增減。 (五)堿性蛋白胨水(Alkaline peptone water) 用途 供霍亂弧菌增菌培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 蒸餾水 100ml pH 8.6 將上述成分溶解于水中,校正pH，分裝于試管810ml，經(jīng)12115min滅菌備用。 將待檢標本接種到堿性胨水中，置35培養(yǎng)6h8h，取表面菌液一白金環(huán)移種到堿性瓊脂、慶大瓊脂或TCBS瓊脂平板上。必要時做第二次增菌。（經(jīng)6h8h培養(yǎng)，霍亂弧菌呈均勻混濁生長，表面有菌膜出現(xiàn)。）質(zhì)量控制 各實驗室自配或采用商品培養(yǎng)基，用前有條件的實驗室可用標準菌株，一般臨床實驗室可用非01群弧菌，生長良好者方可使用?；魜y弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌 生長良好（6h）；大腸埃希菌ATCC25922 不生長（6h）。保存 置4冰箱，2周內(nèi)用完。注：若在堿性胨水中加入1%亞碲酸鉀0.51ml/L，則成為亞碲酸鉀堿性胨水，其增菌效果更為理想。第四節(jié) 分離培養(yǎng)基 一、革蘭陽性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)羅-琴改良培養(yǎng)基（Lowenstein-Jenden medium）用途 供結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)用。 配法 KH2PO4 2.4g MgSO47H2O6 0.24g 枸櫞酸鎂(或枸櫞酸鈉) 0.6g 天門冬素 3.6g 甘油(純) 12ml 蒸餾水 600ml 馬鈴薯淀粉 30g 新鮮雞卵液 1L 2%孔雀綠水溶液 20ml 先將磷酸鹽、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素及甘油，加熱溶解于600ml蒸餾水中。再添放馬鈴薯粉，邊放邊攪，并繼續(xù)置沸水中加熱30min，待冷卻至60左右時，加入雞卵液1L及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無菌操作分裝于滅菌試管，每支56ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內(nèi)制成斜面，經(jīng)851h間歇滅菌二次(或高壓滅菌11520min)，待凝固后經(jīng)無菌試驗，4冷藏備用。 取晨咳痰或其它體液標本，經(jīng)消化處理和離心沉淀的濃縮液0.1ml（約二滴）滴種于培養(yǎng)基的斜面上，盡量搖晃，置355%10%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)14周，觀察結(jié)果。凡在1周內(nèi)發(fā)現(xiàn)生長的菌落，一般不可能是結(jié)核分枝桿菌；在2周后生長的菌落，呈奶油狀，略帶黃色，粗糙突起，不透明，即取菌進行涂片染色鏡檢，及作其鑒定。質(zhì)量控制 自制或商品培養(yǎng)基在使用前，均應(yīng)進行性能監(jiān)測，符合要求者方可應(yīng)用。保存置4冰箱內(nèi)24周有效。 注：1.本培養(yǎng)基pH約為6.0左右，一般無須校正。 2.間歇滅菌的溫度不宜超過90。 (二)血清斜面培養(yǎng)基(呂氏血清斜面) 用途 供白喉棒狀桿菌培養(yǎng)用。配法1%葡萄糖肉湯(pH7.6) 100ml 無菌動物血清(牛羊豬兔) 300ml 將上述成分混合后，分裝于試管內(nèi)，每管約45ml。斜插在血清凝固器內(nèi)（或蒸籠）加熱808530min，使血清凝固成斜面，冷卻后放4冰箱內(nèi)。取出后采用間歇滅菌法，85滅菌30min，連續(xù)3天，經(jīng)無菌試驗證明無雜菌生長即可應(yīng)用。 將喉拭直接接種于上述斜面上，置35培養(yǎng)16h24h。白喉桿菌在上述培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面光滑、完整，鹽水中易乳化，用阿爾培脫染色，兩極異染顆粒明顯。 注：1.所用血清不能含有防腐劑。 2.該培養(yǎng)基不能高熱滅菌，以防破壞其營養(yǎng)成分。3.配制時所有器皿、棉塞等均應(yīng)高壓滅菌。 (三)亞碲酸鉀血瓊脂 用途 分離白喉桿菌用 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉浸膏 3g 葡萄糖 2g 胱氨酸 0.05g 1%亞碲酸鉀 45ml 脫纖維羊血 100ml 瓊脂 2g 蒸餾水 900ml pH 7.6 先將蛋白胨、NaCl、牛肉膏、葡萄糖和胱氨酸加水加熱溶解，調(diào)pH至7.6，加入瓊脂，高壓滅菌11515min備用。待冷至50左右，用無菌操作加入已滅菌的亞碲酸鉀溶液及羊血，混勻傾注平板。將標本直接接種于亞碲酸鉀平板上。置35孵箱，經(jīng)24h48h培養(yǎng)，觀察結(jié)果。白喉桿菌能使亞碲酸鉀還原成金屬碲而形成黑色和灰黑色的菌落。其它大部分細菌在此培養(yǎng)基上被抑制，故較易鑒別。 二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)弧菌分離培養(yǎng)基 1.堿性瓊脂 用途 供霍亂弧菌分離培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 脂 20g 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分混合于水中，加熱溶解，校正pH至 8.4，分裝后高壓滅菌12115min傾注平板。 凡急性病人水樣便在做增菌培養(yǎng)的同時，應(yīng)直接取標本接種到堿性瓊脂平板或亞碲酸鉀瓊脂平板上。置35培養(yǎng)12h16h，觀察結(jié)果?；魜y弧菌生長較快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑濕潤。在亞碲酸鉀瓊脂上菌落呈灰黑色。質(zhì)量控制 各實驗室凡自配或商品培養(yǎng)基,在使用前有條件的實驗室可用標準菌株生長對照，臨床實驗室可送防疫部門所設(shè)立的專門檢驗機構(gòu)進行目的菌監(jiān)測,質(zhì)量可靠者方可使用.EL-Tor弧菌 生長良好；大腸埃希菌ATCC 25922 抑制生長。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 2.堿性膽鹽瓊脂(Alkaline bile-salt agar） 用途 用于霍亂弧菌的分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g10g 瓊脂 20g 膽鹽（牛、豬） 2.5g 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分稱量混合于水中加熱溶解，校正pH，分裝高壓滅菌12115min，傾注平板。 取病人糞便標本或增菌培養(yǎng)物1接種環(huán)接種平板，置35溫箱培養(yǎng)16h18h?；魜y弧菌迅速生長，其它細菌生長較緩慢。在16h18h，霍亂弧菌的菌落較大，直徑可達2mm左右。呈扁平，青灰色，半透明，光滑濕潤，易挑起。其它細菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。質(zhì)量控制 同堿性瓊脂。保存 置冰箱，1周內(nèi)用完。 3.慶大霉素瓊脂(Gentamicin Agar) 用途 供霍亂弧菌分離培養(yǎng)用。 配法 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g 枸櫞鈉 10g 無水亞硫酸鈉 3g 蔗糖(或白糖) 10g 瓊脂 15g20g 慶大霉素,多粘菌素B“雙抗液” 2ml 蒸餾水 1L pH 8.4 將上述成分(除雙抗液外)稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH，分裝滅菌12115min，待冷卻至50后，每100ml內(nèi)加“雙抗液”0.2ml，另加5g/L亞碲酸鉀水溶液0.1ml，再傾注平板。最后每ml培養(yǎng)基內(nèi)含有慶大霉素0.5U，多粘菌素B6U。 將糞便標本或增菌培養(yǎng)物劃線接種到該平板上，置35培養(yǎng)16h18h。 由于該培養(yǎng)基抑制性強，其他非弧菌科細菌被抑制，而霍亂弧菌生長迅速，16h菌落可達2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑濕潤。培養(yǎng)時間長，菌落略黃色、隆起，中心厚而不透明。質(zhì)量控制霍亂弧菌(小川、稻葉)生長良好，培養(yǎng)18h24h菌落直徑2.53.0mm；大腸埃希菌和變形桿菌抑制生長。（由于臨床實驗室不允許保存霍亂弧菌，實際工作中可用非01群弧菌代替）。保存 置4冰箱內(nèi)，1周內(nèi)用完。 注：1.該培養(yǎng)基國內(nèi)有商品出售，多數(shù)產(chǎn)品已加入慶大霉素，使用時，應(yīng)詳閱說明書。2.“雙抗液”配制 98ml滅菌蒸餾水中加慶大霉素(25，000U/ml)1ml，多粘菌B或抗敵E(300，000U/ml)1ml。4冰箱保存一個月用完。 4.四號瓊脂(No.4 Agar) 用途 供分離霍亂弧菌用。 配法 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 3g 亞硫酸鈉(無水) 3g 檸檬酸鈉 10g 豬膽汁粉 5g 十二烷硫酸鈉 20g 利凡諾（雷佛奴爾） 3g 瓊脂粉 12g 慶大霉素亞碲酸鉀混合液 1ml 蒸餾水 1L pH 8.0 將上述8種成分放入玻璃或搪瓷容器內(nèi)(嚴禁用鋁制容器等金屬容器)，加入蒸餾水，加熱溶解混合后，調(diào)整至pH8.0,然后按1.2%加入瓊脂，煮沸至瓊脂溶化后，冷至60左右，按每100ml瓊脂加入慶大霉素亞碲酸鉀混合液(1ml 40，000U慶大霉素加79ml蒸餾水混合后，加入0.8g亞碲酸鉀溶解混合即成，每ml含500U的慶大霉素和10g/L亞碲酸鉀)0.1ml，搖勻，傾注平板。 取待檢標本劃線接種平板，置35培養(yǎng)過夜。 8h后即可初步觀察結(jié)果，24h培養(yǎng)霍亂弧菌呈中心黑色較大而扁平的菌落，較易鑒別。質(zhì)量控制 配成的培養(yǎng)基呈亮黃色透明；EL-Tor弧菌稻葉型生長良好；EL-Tor弧菌小川型生長良好；大腸埃希菌ATCC25922抑制生長。 注：1.慶大和亞碲酸鉀混合液應(yīng)新鮮配制并置冰箱保存。2.雷夫奴爾應(yīng)避光保存，而且每批均應(yīng)預(yù)試后方可使用。成品培養(yǎng)基應(yīng)避光保存。(二)腸桿菌分離培養(yǎng)基 1.中國藍瓊脂(Chinese blue Agar) 用途 系分離腸道菌的弱選擇性培養(yǎng)基。 配法 肉膏湯瓊脂(pH7.4) 1L 10g/L中國藍水溶液(滅菌) 10ml 乳糖 10g 10g/L薔薇紅酸乙醇溶液 10ml 取乳糖10g置于已滅菌的肉膏湯瓊脂瓶內(nèi)，加熱溶解瓊脂并混勻。待冷卻至50左右，加入中國藍、薔薇 紅酸溶液混勻，立即傾注平板，凝固后備用。 將標本接種平板，置3518h24h。分解乳糖產(chǎn)酸的細菌，其菌落呈藍色；不分解乳糖的細菌，菌落為淡紅色的透明菌落。 質(zhì)量控制大腸埃希菌ATCC 25922菌落呈藍色。痢疾志賀菌型ATCC 13313和鼠傷寒沙門菌ATCC 13311菌落呈淡紅色。保存 4冰箱保存，1周內(nèi)用完。 注：(1)中國藍水溶液需煮沸或高壓11515min滅菌后應(yīng)用。薔薇紅酸乙醇溶液無需滅菌，但加熱時應(yīng)避開火焰。 (2)薔薇紅酸能抑制革蘭陽性細菌生長，但對大腸埃希菌沒有抑制作用，標本接種量不宜太多。(3)此培養(yǎng)基pH7.4，制好后應(yīng)呈淡紅色，若過堿呈鮮紅色，過酸則呈藍色，均不適用。 2.木糖、賴氨酸、去氧膽酸鹽(XLD)培養(yǎng)基 用途 為腸道菌選擇性培養(yǎng)基。 配法 酵母浸膏 3g L-賴氨酸 5g NaCl 5g D-木糖 3.75g 乳糖 7.5g 蔗糖 7.5g 去氧膽酸鈉 2.5g 硫代硫酸鈉 6.8g 枸櫞酸鐵銨 0.8g 瓊脂 13.5g 1%酚紅溶液 8ml 蒸餾水 1L 將上述成分(酚紅除外)混合，加熱溶解，校正pH至7.2,再加入酚紅溶液混勻。121高壓滅菌15min，傾注平板備用。 將標本劃線接種平板，置35培養(yǎng)18h24h。大腸埃希菌、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬細菌在本培養(yǎng)基上形成黃色、不透明菌落；大多數(shù)沙門菌屬細菌因不利用糖類，為半透明紅色或無色菌落。質(zhì)量控制大腸埃希菌 呈黃色菌落；宋內(nèi)志賀菌 呈無色菌落；傷寒沙門菌 呈紅色菌落有黑心；金黃色葡萄球菌 抑制生長保存 貯存于4有效期5天。 3.SS瓊脂(SalmonellaShigella agar) 用途 供沙門菌屬和志賀菌屬的分離培養(yǎng)用。 配法 月示胨 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 瓊脂 1520g 膽鹽(No.3) 3.5g 枸櫞酸鈉(2H2O) 8.5g 硫代硫酸鈉(5H2O) 8.5g 枸櫞酸鐵 1g 1%中性紅水溶液 2.5ml 0.1%煌綠水溶液 0.33ml 蒸餾水 1L pH 7.07.1 將上述成分(除中性紅，煌綠外)混合于水中，加熱煮沸溶解，校正pH，然后加入中性紅和煌綠水溶液，充分混勻冷卻至50時傾注平板。 將標本接種平板，置35培養(yǎng)1824h。沙門菌屬其菌落呈無色半透明，產(chǎn)生H2S者菌落中心呈黑色。志賀菌屬的菌落呈無色半透明。大腸菌屬呈紅色渾濁。宋內(nèi)志賀菌能延緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)24h后可以出現(xiàn)紅色菌落。腸道致病菌的菌落均可達1.5mm以上。 質(zhì)量控制大腸埃希菌菌落 呈紅色；痢疾志賀型、福氏志賀菌和傷寒沙門菌 生長良好，菌落無色；腸炎或豬霍亂沙門菌菌落 呈黑色；糞腸球菌、金黃色葡萄球菌 不生長。保存 避光，3天內(nèi)用完。注：煌綠要新配，中性紅要優(yōu)質(zhì)。 4.麥康凱瓊脂(Maconkey agar) 用途 供腸道致病菌的分離培養(yǎng)和非發(fā)酵細菌鑒別用。 配法 蛋白胨 20g Nacl 5g 膽鹽(豬、牛、羊) 5g 乳糖 10g 瓊脂 1520g 1%中性紅溶液 5ml 蒸水 1L pH 7.2 將上述成分(除中性紅外)稱量加入水中，加熱溶解，校正pH，加入中性紅溶液，分裝滅菌11520min，冷卻至50左右時傾注平板。 取標本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)1824h。不發(fā)酵乳糖的腸道細菌呈無色菌落，直徑約2.0mm左右，光滑半透明。質(zhì)量控制大腸埃希菌菌落 呈桃紅色；痢疾志賀菌菌落 呈無色；傷寒沙門菌菌落 無色；金黃色葡萄球菌 不生長。保存 置4冰箱(避光)，1周內(nèi)用完。注：非發(fā)酵細菌在該平板上是否生長，是臨床鑒定某些非發(fā)酵細菌的指標之一。 5.伊紅美藍瓊脂(Eosin methylene blue agar) 用途 供腸道致病菌及大腸菌群的分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氫二鉀 2g 20g/L伊紅Y水溶液 20ml 65g/L美藍水溶液 10ml 瓊脂 17g 蒸餾水 1L pH 7.1 將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正pH，分裝滅菌12115min備用。臨用時加熱溶化瓊脂加入乳糖，冷至5055時加入伊紅和美藍水溶液，搖勻傾注平板。 取糞便標本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)18h24h。根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌羧o色菌落或挑選紫紅色及有金屬光澤的菌落轉(zhuǎn)種克氏雙糖或三糖鐵瓊脂進行鑒定。質(zhì)量控制 大腸埃希菌菌落 呈紫紅色，有時有金屬光澤，直徑2.3mm。傷寒沙門菌菌落呈灰白色，直徑1.8mm。金黃色葡萄球菌不生長。保存 置4冰箱，1周內(nèi)用完。 6.克氏雙糖鐵瓊脂(Kliger iron agar) 用途 供腸桿菌科細菌的初步鑒定用。 配法 蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 50g 枸櫞酸鐵銨 0.5g 硫代硫酸鈉 0.5g 0.2%酚紅水溶液 5ml 瓊脂 12ml 蒸餾水 1L pH 7.5 將上述成分（除瓊脂、酚紅外）稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH，再加入瓊脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，每管4ml，經(jīng)115滅菌20min，立即制成高層斜面，待凝固后經(jīng)無菌試驗備用。 取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。斜面變黃，底層變黃，產(chǎn)氣者或不產(chǎn)氣者多屬大腸埃希菌群及發(fā)酵乳糖的菌株。斜面變紅，底層變黃，為不發(fā)酵乳糖菌株。產(chǎn)H2S菌株可使底層或全管產(chǎn)生黑色反應(yīng)。質(zhì)量控制奇異變形桿菌 K/A H2S陽性；大腸埃希菌 A/A；志賀痢疾桿菌 K/A；傷寒沙門菌 K/A H2S陽性；銅綠假單胞菌 K/K。 保存 置4冰箱，2周內(nèi)用完。注:該培養(yǎng)基pH尤為重要，pH7.5時使用效果最佳。 7.三糖鐵瓊脂(Triple sugar iron agar) 用途 供腸桿菌科細菌初步生化鑒定用。 配法 蛋白胨 15g 月示胨 5g 牛肉膏 3g 酵母膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g Nacl 5g 硫酸亞鐵 0