（中醫(yī)骨傷科學(xué)專業(yè)論文）兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

目錄 中文摘要 1 英文摘要 3 1 l l 日i j 吾 一 一 一 一 一 6 正文 第一章 兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 8 1 實(shí)驗(yàn)材料 8 2 實(shí)驗(yàn)方法 1 2 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 5 4 討論 1 7 5 小結(jié) 2 0 6 參考文獻(xiàn) 2 1 第二章 兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng) 2 3 1 實(shí)驗(yàn)材料 2 3 2 實(shí)驗(yàn)方法 2 4 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2 6 4 討論 3 4 5 小結(jié) 3 7 6 全文結(jié)論 3 8 7 參考文獻(xiàn) 3 9 致謝 4 1 附圖 4 2 文獻(xiàn)綜述 4 9 作者簡(jiǎn)介 5 6 f i i ii 1 111 1 11 1 111 11 11111l y 17 9 318 8 兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 研究生 張善濤 中文摘要 對(duì)通過(guò)酶消化法獲取的兔尺骨皮質(zhì)骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定 探討其體外生長(zhǎng) 增殖能力 的作為種子細(xì)胞的代數(shù) 檢測(cè)兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞在自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干 x k c f d b 系列同種骨 及可吸收性明膠海綿三種支架上的生長(zhǎng)情況 對(duì)三種支 與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià) 并用不同的細(xì)胞密度與三種支架材 培養(yǎng) 探求合適的細(xì)胞接種密度 為骨組織工程的細(xì)胞來(lái)源 載體材料的選擇和 動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù) 結(jié)果 兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 從3 月齡新西蘭大白兔 雌雄不限 獲取尺骨皮質(zhì)骨 通過(guò)酶消化法獲取原代細(xì)胞 適時(shí)傳代 每日倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖特征 m t t 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖 情況 繪制生長(zhǎng)曲線 檢測(cè)第2 3 6 7 和8 代細(xì)胞a l p 行a l p 染色 i 型膠原免疫組織 化學(xué)染色及骨鈣素免疫組化染色 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定 結(jié)果 分離培養(yǎng)出的原代細(xì)胞 形 態(tài)類似成纖維細(xì)胞 具有良好的體外增嫡能力 細(xì)胞倍增時(shí)間約為7 天 各項(xiàng)染色檢測(cè) 呈強(qiáng)陽(yáng)性 細(xì)胞增殖速度 第l 2 天 各代細(xì)胞無(wú)差別 p 0 0 5 第3 天開(kāi)始第7 8 代 細(xì)胞落后于第2 3 和6 代細(xì)胞 一直持續(xù)到第l o 天 尺o 0 5 而第2 3 代同第6 代細(xì)胞 及第7 代同第8 代細(xì)胞之間無(wú)顯著性差異 p o 0 5 a l p 檢測(cè) 第2 3 6 代成骨細(xì)胞高 于第7 8 代細(xì)胞 尺0 0 5 第二章兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng) 將成骨細(xì)胞接種到三種支架材料上 進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng) 用倒置相差顯微鏡 掃描 電鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng) 增殖情況 并進(jìn)行m t t 細(xì)胞上架率 a l p 及骨鈣素 檢測(cè) 結(jié)果 倒置相差顯微鏡顯示三種支架為多孔網(wǎng)狀 孔隙互相通連 隨培養(yǎng)時(shí)間的 延長(zhǎng) 細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛 增殖迅速 掃描電鏡顯示復(fù)合培養(yǎng)3 d 時(shí) 有較多的細(xì)胞粘附并鋪 展在支架上 培養(yǎng)6 d 時(shí) 細(xì)胞完全伸展 呈長(zhǎng)梭形 l o d 時(shí)細(xì)胞分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì) 重疊生長(zhǎng)并連接成網(wǎng)狀 尤以兩種骨性材料組明顯 m t t 檢測(cè)顯示三種支架材料在實(shí)驗(yàn) 前期不影響成骨細(xì)胞的生長(zhǎng) 增殖 p o 0 5 后期 9 d 1 2 d 能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增 殖及分泌 與對(duì)照組比較有顯著性差異 尺o 0 5 而三種支架材料組之間無(wú)顯著性差 異 d 0 0 5 細(xì)胞上架率 當(dāng)細(xì)胞接種密度為lx1 0 6 m l 時(shí) 可吸收明膠海綿細(xì)胞上架 率最高 為4 5 5 2 3 1 5 a l p 檢測(cè) 細(xì)胞密度為lx1 0 5 m l 時(shí)各組之間無(wú)顯著性差異 乃0 0 5 細(xì)胞密度為l 1 0 6 m l 時(shí)三種支架材料組高于對(duì)照組 p o 0 5 三種支架 材料組之間無(wú)顯著性差異 乃o 0 5 細(xì)胞密度為6 1 0 6 m l 及l(fā)x1 0 7 m l 時(shí) 可吸收明 膠海綿組 小牛脫蛋白松質(zhì)骨組 凍干松質(zhì)骨組 對(duì)照組 p o 0 5 在12 d 時(shí)細(xì)胞密度為 6 1 0 6 m l 的各組支架材料a l p 細(xì)胞密度為1 1 0 7 m l 的各組支架材料a l p 骨鈣素檢測(cè) 第1 4 天小牛脫蛋白松質(zhì)骨組及凍干松質(zhì)骨組明顯高于對(duì)照組及可吸收明膠海綿組 尺 l o 0 5 第2 1 天及第2 8 天 小牛脫蛋白松質(zhì)骨組 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿組 對(duì)照 組 p o 0 5 結(jié)論 1 兔尺骨皮質(zhì)骨體外可以培養(yǎng)出成骨細(xì)胞 體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞具有增殖 分泌 功能 其中第2 3 6 代細(xì)胞增殖和分泌功能強(qiáng)于第7 8 代細(xì)胞 新西蘭大白兔皮質(zhì) 骨成骨細(xì)胞理想的作為種子細(xì)胞的代數(shù)為2 6 代細(xì)胞 2 三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞理想細(xì)胞接種密度為lxi 0 6 m 1 6 1 0 6 m l 隨細(xì)胞接種密度上升細(xì)胞上架率在下降 當(dāng)細(xì)胞接種密度為1 1 0 6 m l 時(shí) 可吸收明膠 海綿細(xì)胞上架率最高 為4 5 5 2 3 1 5 3 在理想接種密度下 a l p 檢測(cè) 可吸收明膠海綿 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì) 骨 對(duì)照組 骨鈣素檢測(cè) 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿 對(duì)照組 4 本實(shí)驗(yàn)制備的小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞具有良好的生物相容性及 骨誘導(dǎo)性 且制備方便 價(jià)格低廉 是很好的骨替代材料 把小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮 質(zhì)骨成骨細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨 進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)是可行的 關(guān)鍵詞 組織工程 兔皮質(zhì)骨源成骨細(xì)胞 小牛脫蛋白松質(zhì)骨 c d c b 凍干松質(zhì)骨 f d c b 可吸收明膠海綿 a g s a n i m a lt e s t i n gp r o v i d e df u r t h e re x p e r i m e n t a le v i d e n c e m e t h o d sa n dr e s u l t f i r s tp a r t r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s sc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o ni nv i t r o u l n ac o r t i c a lb o n eo b t a i n e db yo p e r a t i o nf r o m3 m o n t h o l dn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s n ol i m i to fm a l eo rf e m a l e w e r ed e a l tw i t he n z y m ed i g e s t i o nt oo b t a i nc e l l s 礬t hm i c r o s c o p eo b s e r v e dc e l l u l a rf o r ma n dm u l t i p l i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i ce v e r y d a y a s s a y c e l lg r o w t ha n d p r o l i f e r a t i o nw i t hm 訂 d r a w i n gt h eg r o w t hc u r v e d e t e c t i o no f t h es e c o n d t h i r d 6t h 7 t h a n d8 t hg e n e r a t i o nc e l l s sa l p a p p r a i s a lc e l l sw i t ht h em e t h o do fs t a i n i n gc e l l sw i t ha l p i c o l l a g e na n db o n ec a l c i u me l e m e n t r e s u l t s t h ei s o l a t e da n dc u l t u r e dp r i m a r y c e l l sm o r p h o l o g yw e r es i m i l a rt of i b r o b l a s t s w i t hg o o dp r o l i f e r a t i o ni nv i t r o c e l l s sd o u b l i n gt i m ew a s a b o u t7d a y s a n da l lt e s tr e s u l t sw e r ep o s i t i v e d c e l lp r o l i f e r a t i o nr a t e t h ef i r s t1 2d a y s e a c h g e n e r a t i o no f c e l ld i dn o th a v et h ed i f f e r e n c e 伶0 0 5 f r o mt h et h i r dd a yt h e7 t h 8t hg e n e r a t i o nc e l l ss i g n i f i c a n t l yl a g g e db e h i n dt h es e c o n d t h i r da n d6t hg e n e r a t i o n c o n t i n u e dt ot h e f i r s t10d a y s p 0 0 5 w h i l es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o n 7 t ha n d8 t hg e n e r a t i o nh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 侈0 0 5 a l p t h es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o no f o s t e o b l a s t s a l pe x a m i n a t i o nw e r eh i g h e rt h a nt h e7 t h 8 t hg e n e r a t i o no fc e l l s sa l p p 0 0 5 t h ec e l ld e n s i t yw a slxl0 6 m l t h r e ek i n do fs u p p o r tm a t e r i a lg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p t h e12 d e a c hg r o u po f s u p p o r tm a t e r i a la l p w h e nt h ec e l ld e n s i t yw a s6 x10 0 m l e a c hg r o u po fs u p p o r tm a t e r i a l a l pw h e nt h ec e l ld e n s i t yi s1 107 m 1 b g p t h e14 t hd a y s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n ea n df r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n eg r o u pw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l g r o u pa n da b s o r b a b i l i t yg e l a t i ns p o n g eg r o u p p f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e c o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l f d e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p b g p s e l f m a d e c a l f d e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t yg e l a t i n s p o n g e c o n t r o lg r o u p 4 t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n et h a tt h i se x p e r i m e n tm a d ew i t ht h er a b b i t 4 u l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sh a sg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n d b o n ei n d u c t i v i t y m o r e o v e ri tp r e p a r e dc o n v e n i e n t l y h a st h el o wp r i c e s oi ti st h ev e r yg o o db o n es u b s t i t u t i o n m a t e r i a l t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n ea n dt h er a b b i tu l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sc o n f o r m e dt oc o n s t r u c to r g a n i z a t i o np r o j e c tb o n e a n dc a l t yo nf u r t h e r e x p e r i m e n ti sf e a s i b l e k e yw o r d s t i s s u ee n g i n e e r i n g r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s c a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e c d c b f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e f d c b a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e a g s 5 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 前言 脊柱和四肢常因感染 損傷 畸形 腫瘤 手術(shù)等原因 造成較大骨缺損 僅靠殘 留骨組織的自身修復(fù) 往往難以滿足機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的需求 因此骨組織缺損的修復(fù)仍 然是困擾骨科界的一大難題 這尤其表現(xiàn)在不能接受自體骨移植的移植 骨質(zhì)疏松的老 年人或大段骨缺損的病人上 傳統(tǒng)的治療方法有自體骨移植 異種骨移植和生物材料替 代等 這些方法均不同程度地存在著來(lái)源困難 免疫排斥及成骨能力不確定等缺點(diǎn) 在 對(duì)較大骨缺損進(jìn)行骨移植時(shí) 新骨形成之前移植骨可能已被機(jī)體吸收 造成植骨失敗 而組織工程的創(chuàng)立和發(fā)展 為骨的修復(fù)與重建提供了新的思路和方法 成為骨缺損修復(fù) 研究的突破點(diǎn) 組織工程學(xué) t i s s u ee n g i n e e r i n g 是2 0 世紀(jì)8 0 年代提出的一門新興的交叉學(xué) 科 主要是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理和技術(shù) 在體外構(gòu)建具有生物功能的人工 取代物 以修復(fù)組織缺損 替代失去功能或衰竭的組織和器官的部分或全部功能 它包 括了生物學(xué) 工程學(xué) 醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的交叉和融合 它指應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的方 法 利用細(xì)胞 合成材料 處理過(guò)的天然材料和組織 細(xì)胞因子和基因技術(shù)使組織重新 構(gòu)建和再生 從而完成缺損組織的修復(fù)或器官解剖與功能的重建 骨組織工程是其重點(diǎn) 研究對(duì)象之一 其基本技術(shù)路線是 采集功能相關(guān)的健康而有生命的細(xì)胞 將其種植于 具有一定結(jié)構(gòu)的支架上 然后將經(jīng)初步分裂繁殖后的細(xì)胞群落與支架復(fù)合體植入體內(nèi) 形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官 據(jù)組織工程學(xué)原理 骨組織工程的研究?jī)?nèi)容包 括支架材料 種子細(xì)胞 誘導(dǎo)因子和組織工程骨構(gòu)建方式等多個(gè)方面 目前骨組織工程 的構(gòu)建主要有三種方式 支架骨 種子細(xì)胞 支架材料 生長(zhǎng)因子 支架材料 種 子細(xì)胞 生長(zhǎng)因子 骨組織工程材料不僅影響種子細(xì)胞的生物學(xué)特性和培養(yǎng)效率 而且決定移植后能否 與受體很好地適應(yīng)并結(jié)合在一起 從而發(fā)揮其修復(fù)骨缺損地作用 因而在目前骨組織工 程的研究中 尋找理想地支架材料是一大熱點(diǎn) 理想的骨組織工程細(xì)胞載體材料的要求 有 良好的生物相容性 如無(wú)毒 不致畸性等外 還應(yīng)利于種子細(xì)胞粘附 增殖 不 引起炎癥反應(yīng) 甚至利于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化 支架完成支持作用后應(yīng)能完全降解 降解 速度與降解時(shí)間可人為調(diào)控與組織細(xì)胞生長(zhǎng)率相適應(yīng) 具有三維立體多孔結(jié)構(gòu) 孔隙 率最好達(dá)9 0 以上 具有較高的面積體積比 利于細(xì)胞粘附生長(zhǎng) 細(xì)胞外基質(zhì)沉積 營(yíng) 養(yǎng)和氧氣進(jìn)入 代謝產(chǎn)物排出 也有利于血管和神經(jīng)長(zhǎng)入 一定的機(jī)械強(qiáng)度 為新生 組織提供支撐 并保持一定時(shí)間直至新生組織具有自身生物力學(xué)特性 良好的材料一 細(xì)胞界面 材料應(yīng)能提供良好的細(xì)胞界面 利于細(xì)胞粘附 增殖 更重要的是能激活細(xì) 胞特異基因表達(dá) 維持細(xì)胞正常表型表達(dá) 易消毒性 組織工程中種子細(xì)胞的選擇也是備受關(guān)注的焦點(diǎn) 目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)試驗(yàn)室以骨髓基 質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞 但該途徑具有定向誘導(dǎo)分化難 細(xì)胞表型不穩(wěn)定等缺點(diǎn) 骨皮質(zhì) 來(lái)源成骨細(xì)胞目前研究比較少 但據(jù)國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明 骨皮質(zhì)培養(yǎng)成骨細(xì)胞是可行的 成熟的成骨細(xì)胞在體內(nèi)不發(fā)生增殖 但是體外培養(yǎng) 在合適的條件下 成骨細(xì)胞可以大 6 兔皮質(zhì)骨米源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 量增殖 目前其常用的培養(yǎng)方法是酶法和組織塊法 二者各有優(yōu)缺點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)屬南京軍區(qū) 十一五 重點(diǎn)計(jì)劃課題 0 6 2 2 9 子項(xiàng)目及福建省青年科技人 才創(chuàng)新項(xiàng)目 2 0 0 4 f 3 1 4 6 子項(xiàng)目 前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)通過(guò)酶消化法可以從兔尺骨皮 質(zhì)骨獲得細(xì)胞 且已與其它組織來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行了比較研究 本實(shí)驗(yàn)對(duì)采用酶消化法獲 得的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定 探求合適代數(shù)的成骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞 然后把種子細(xì)胞與 自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨 凍干松質(zhì)骨 可吸收明膠海綿三種支架材料復(fù)合培養(yǎng) 對(duì)三種 支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià) 并用不同的細(xì)胞密度與三種支架 材料復(fù)合培養(yǎng) 選取理想的細(xì)胞接種密度 同時(shí)對(duì)三種支架材料進(jìn)行對(duì)比 為骨組織工 程的細(xì)胞來(lái)源 載體材料的選擇和進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù) 7 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 第一章兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 1 實(shí)驗(yàn)材料 1 1 試驗(yàn)地點(diǎn)及動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)在廈門大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心完成 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備專用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室及 標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)問(wèn) 見(jiàn)圖1 一圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3 月齡新西蘭大白兔8 只 雌雄不 限 購(gòu)自上海動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心 1 2 主要試劑與儀器 見(jiàn)表1 表2 和圖3 圖6 1 3 主要溶液配制 1 3 1 常規(guī)培養(yǎng)基 d m e m f 1 2 培養(yǎng)基干粉一袋 超純水7 0 0 m l 攪拌溶解 加入n a h c o 1 2 g 定容至1 0 0 0 m l 用n a o h 或者h(yuǎn) c l 調(diào)節(jié)p h 值為7 0 7 2 過(guò)濾后p h 可上升0 2 0 3 以 蔡氏過(guò)濾器0 4 5 u m 和0 2 2 u m 雙層濾膜過(guò)濾除菌 2 0 0 m l 每瓶分裝 4 c 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?使 用前添加1 0 胎牛血清和1 雙抗 青霉素1 0 0 0 0u m 和鏈霉素1 0 0 0 0ug m 1 靜置1 2 2 4 小時(shí)后可使用 1 3 20 1 m o l lp b s a 不含鈣 鎂的磷酸鹽緩沖液 n a c l8 o g k c l0 2g k h p 0 40 2 g n a h p o 1 2 h 02 8 9 9 加超純水7 0 0 m l 攪拌溶解 鹽酸調(diào)節(jié)p h 7 2 定容至1 0 0 0m l 高壓蒸汽滅菌2 0m i n 分裝2 0 0 m l 每瓶 4 儲(chǔ)存?zhèn)溆?1 3 30 2 5 的胰蛋白酶 用少許p b s 將2 5 0 m g 胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀 再謇b p b s 至1 0 0m l 攪拌溶解 力h n a h c o 調(diào)p h 8 0 左右 室溫放置4h 或4 c 冰箱過(guò)夜 超凈臺(tái)內(nèi)用0 2 2 ji n 孔徑的一次性濾器過(guò)濾除菌 用離心管1 0m l 每管分裝 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴 溶解 1 3 4o 1 的i 型膠原酶 用少許p b s 將l o o m gi 型膠原酶粉末調(diào)成糊狀 再卒b p b s 至l o o m l 攪拌溶解 力f l n a h c o 調(diào)p h 8 o 左右 室溫放置4h 或4 c 冰箱過(guò)夜 超凈臺(tái)內(nèi)用0 2 2um 孔徑的濾器過(guò)濾除菌 用1 5 m l 離心管分裝 l o m l 每管 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴溶 解 1 3 5 噻唑藍(lán) m 1 1 稱取2 5 0 m g 噻唑藍(lán)粉末 加入5 0 m l 的p b s 攪拌溶解 超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾 4 c 避光保存 有效期1 4 天 1 3 6p n p p a m p 溶液 p n p p2m m m g c l 2 m m a m p0 i m a m p 2 氨基 2 甲基一卜丙醇 0 9 m l 9 9 純度 p n p p 對(duì)硝基苯磷酸二鈉 六水 0 0 7 4 2 9 m g c l 2 6 h 00 0 4 0 6 6 9 先把p n p p m g c l 溶解于l o o m l 的超純水 過(guò)濾除菌 4 c 儲(chǔ)存 使用前加入a m p 1 3 70 2 結(jié)晶紫溶液 0 2 9 結(jié)晶紫 溶于l o o m l 超純水 攪拌后 4 c 保存?zhèn)溆?1 3 8 電鏡制樣中常用固定劑的配制方法 1 3 8 1 磷酸緩沖液 0 2 m 甲液 n a h p o 1 2 h 0 7 1 6 4 9 3 5 8 2 r 兔皮質(zhì)骨米源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 加蒸餾水溶解成1 0 0 0 m l 5 0 0 m 1 乙液 n a h p o 2 h 03 1 2 1 9 1 5 6 0 5 加蒸餾水溶解成l0 0 0 m l 5 0 0 m 1 按下表混合甲 乙兩液即得所需p h 的磷酸緩沖液 表l o 2 m 的磷酸緩沖液的配制 5 0 m 1 p h6 46 6 6 8 7 07 27 4 甲液 m 1 1 3 31 8 82 4 5 3 0 5 3 6 04 0 5 乙液 m 1 3 6 73 1 22 5 51 9 51 4 o9 5 1 3 8 2 固定液 2 5 戊二醛磷酸緩沖溶液 0 2 m 磷酸緩沖液5 0 m l 2 5 戊二醛水 溶液l o m l 加水定容至l o o m l 1 3 8 3 梯度乙醇液 3 0 3 份純乙醇液 7 份超純水 5 0 5 份純乙醇液 5 份超純水 7 0 7 份純乙醇液 3 份超純水 9 0 9 份純乙醇液 1 份超純水 9 5 9 5 份純乙醇液 0 5 份超純水 1 0 0 直接使用純乙醇液 1 3 8 4 醋酸異戊酯 乙醇 1 1 v v 配制 9 對(duì)硝基苯磷酸二鈉 p n p p 2 氨基 2 甲基 1 丙醇 a m p 酶免骨鈣素 t r i t o nx 1 0 0 超純水 培養(yǎng)皿 1 0 0 m i n 6 0m m 3 5 m m 細(xì)胞培養(yǎng)板 2 4 孔 9 6 孔 e p p e n d o f f 管 2m 1 離心管 1 5m l 5 0 m i 微孔移液槍 2 2 0 1 0 0 1 0 0 0 1 a l 微孔濾膜 o 4 5 岬 o 2 2t t m 血球計(jì)數(shù)板 凍干松質(zhì)骨 x k c f i b 系列同種骨 s i g m a a c r o s 美國(guó)a d l a m r e s c o 廈門大學(xué)物理微機(jī)電中心 c o m i n g c o m i n g 上海生物工程技術(shù)公司 f a l c o n f i n n p i p e t t e 上海市新亞凈化器廠 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠 北京鑫辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司 可吸收性明膠海綿 南京金陵藥業(yè)股份有限公司 一一 1 0 電子天平 酶標(biāo)儀 恒溫磁力攪拌器 b s 2 0 0 s w e 北京采多利斯 滅j i 公j d e l x 8 0 0 8 5 1 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器l d z x 4 0 b i 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 超低溫冰箱 離心機(jī) 倒置相差顯微鏡 熒光顯微鏡 掃描電鏡 d h g 9 1 4 0 a d f 8 5 1 4 k a 1 0 0 0 a e 2 0 a x i o v e r t2 0 0 b i o t e k 固 仁f u 器有限公i d i 海中立醫(yī)療器械廠 1 海褙宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公i d 美圍兩盟公ld 飛鴿牌 m o t i c c a r iz e i s s x l 3 0 e x e m p h l i p s 福建中醫(yī)約人學(xué)碩十學(xué)何論文 2 實(shí)驗(yàn)方法 2 1 兔皮質(zhì)骨細(xì)胞的獲取及培養(yǎng) 2 1 1 原代細(xì)胞的獲取及培養(yǎng) 取材前清洗并紫外消毒實(shí)驗(yàn)室 采用高壓蒸汽或過(guò)濾方法滅菌實(shí)驗(yàn)用品 準(zhǔn)備如下 用品 新西蘭兔 硫化鈉 脫毛 速眠新 碘伏 酒精 注射器 手術(shù)刀 鑷子 血 管鉗 骨錘 組織剪 線剪 無(wú)菌紗布 手套 帽子 口罩 手術(shù)衣 手術(shù)布巾 1 5 m l 離心管 見(jiàn)圖7 一圖8 3 月齡的新西蘭大白兔稱重為2 k g 左右 雌雄不限 用脫毛劑硫化 鈉去毛后 皮下注射麻藥速眠新 0 2 0 3m l k g 觀察動(dòng)物肌肉松弛后局部消毒 鋪 巾 見(jiàn)圖9 切開(kāi)皮膚皮下組織 鈍性撥開(kāi)肌肉 暴露肱骨 尺骨 徹底去除尺骨上的 軟組織 用手術(shù)刀片取尺骨上的皮質(zhì)骨 見(jiàn)圖1 0 注意不打通髓腔 將骨皮質(zhì)置于1 5 m l 裝有含雙抗的p b s 液的離心管中 迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞問(wèn) 然后將組織塊轉(zhuǎn)移j u l o o m m 培養(yǎng)皿 中 以含雙抗的無(wú)鈣 鎂p b s p b s a 液反復(fù)沖洗至沖洗液無(wú)血色和雜質(zhì) 用眼科剪將 皮質(zhì)骨片反復(fù)剪切成1 2 m m 2 大小 過(guò)程中注意保持骨片濕潤(rùn) 然后將組織塊用0 2 5 胰酶 消化3 0 m i n 1 去除消化液 重復(fù)消化5 次 然后加培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 0 j 時(shí)后去除培養(yǎng)基 加入胰酶消化3 0 m i n 加入適量培養(yǎng)基終止消化 取上清液離心l o m i n 1 0 0 0 r m i n 沉 淀物用培養(yǎng)液懸浮 接種于培養(yǎng)皿內(nèi) 重復(fù)3 次 直至離心后無(wú)沉淀物 3 天后觀察換液 以后每2 天換液一次 并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 貼壁 生長(zhǎng)情況 2 1 2 細(xì)胞的傳代及培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底9 0 面積時(shí) 進(jìn)行消化傳代 傳代過(guò)程如下 1 棄去舊的培養(yǎng)基 加入2 m lp b s 清洗2 次 2 加入0 2 5 胰蛋白酶l m l 搖晃培養(yǎng)皿 確保胰酶覆蓋整個(gè)培 養(yǎng)皿底 3 1 0 3 鐘后 棄胰酶液 重新加入0 2 5 胰蛋白酶2 m l 消化5 l o m i n 4 倒置相差顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓 細(xì)胞間隙增大 細(xì)胞隨液體移動(dòng)時(shí)棄消化液 或者直接加入5 m ld m e m f 一1 2 培養(yǎng)基終止消化 用吸管反復(fù)輕輕吹打 制造細(xì)胞懸液 5 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1 5 m 1 離心管中 以1 0 0 0 轉(zhuǎn) 分 r p m 離 5 8 m i n 棄上清 加入培養(yǎng)基 重新懸浮細(xì)胞 用差速貼壁法純化細(xì)胞 以1 3 比例傳代 于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 1 3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 傳代時(shí) 取2 0 u l 細(xì)胞懸液 從蓋玻片交接處滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中 在1 0 倍物鏡的倒置 顯微鏡下 調(diào)焦找到細(xì)胞 分別計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)上四個(gè)角落中由橫豎各3 條并行線組成的1 6 個(gè)小格上的細(xì)胞 細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1 如果細(xì)胞壓在線上 則數(shù)上不數(shù)下 數(shù)左不數(shù)右 用以下計(jì)算公式 四大格中細(xì)胞數(shù)x1 0 0 0 0 4 計(jì)數(shù)單位以個(gè) m l 表示 2 2 兔皮質(zhì)骨細(xì)胞的觀察及檢測(cè) 2 2 1 倒置相差顯微鏡觀察 每天觀察各代細(xì)胞的形態(tài)特征 生長(zhǎng)及增殖情況 并照相 2 2 2 結(jié)晶紫染色細(xì)胞形態(tài)觀察 待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿皿底后行染色 去除培養(yǎng)液 p b s 沖洗兩次 加入l m l1 0 的中性緩 沖福爾馬林固定 3 0 分鐘后吸除福爾馬林 用去離子水沖洗兩遍 風(fēng)干 每孔加入l m l0 2 兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨 細(xì)胞與二種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 的結(jié)晶紫溶液 室溫下染色3 0 分鐘 然后用超純水多次沖洗 直到?jīng)_沈液基本無(wú)色 于 倒置顯微鏡下觀察 拍照 2 2 3m t t 法測(cè)各代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 消化收集第2 3 6 7 和8 代細(xì)胞 調(diào)整細(xì)胞密度為lx1 0 5 個(gè)細(xì)胞 m l 以每孑l 1 5 0 i ll 接種于9 6 孔培養(yǎng)板中 每代細(xì)胞設(shè)1 0 塊板 每板設(shè)6 孔 置入3 7 c 5 c 0 2 飽和濕 度孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2 天換液一次 于接種后第l l o d 每天每代細(xì)胞各取出一塊培養(yǎng)板用m t t 法測(cè)成骨細(xì)胞的光吸收值 a 4 9 2 每孔加5 m g m 1m t t 溶液2 0u1 3 7 2 5 c 0 2 飽和濕 度孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h 后 小心吸棄孔內(nèi)上清液 p b s 液輕洗3 次 每孔加入二甲亞砜1 5 0 pl 振蕩l o m i n 使沉淀充分溶解后 選擇4 9 2 n m 波長(zhǎng) 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的 光吸收值 a 僦 記錄結(jié)果 并以時(shí)間為橫軸 光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 2 2 4 各代細(xì)胞堿性磷酸酶 a l p 檢測(cè) 把第2 3 6 7 和8 代成骨細(xì)胞分別制成lx1 0 6 m l 的細(xì)胞懸液 以6 0 u 1 分別接種于 2 4 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 每代設(shè)2 4 個(gè)復(fù)孔 分別于第6 8 1 0 1 2 天去除培養(yǎng)基 每代細(xì)胞 每次取6 孔 然后 向每孔中力n 2 0 0ul0 5 的t r i t o n x 一1 0 0 并放置過(guò)夜 最后 向每 孔中力n 2 0 0ul 的p n p p a m p 溶液 含p n p p2m m o l l m g c l 2m m o l l a m p0 1m o l l 的 水溶液 并于3 7 c 孵育3 0 m i n 用4 0 0i j ll m o l ln a o h 終止反應(yīng) 用紫外分光光度計(jì) b e c k m a nc o u l t e rd u8 0 0 于4 0 5 n m 處檢測(cè)上清液的吸光值 a 4 0 5 2 2 5 細(xì)胞a l p 染色 取第3 代細(xì)胞 接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板 普通培養(yǎng)液培養(yǎng) 2 天換液一次 培養(yǎng)7 天取出蓋玻片 按照以下方法操作 1 將培養(yǎng)板用冷丙酮在4 0 冰箱內(nèi)固定1 8 2 4 小時(shí) 2 放入孵育液中置于3 7 c 溫箱或水浴內(nèi)孵育1 0 3 0 分鐘 3 蒸餾水稍沈 4 2 硝酸鉆水溶液處理2 5 分鐘 5 蒸餾水速洗一次 6 1 硫化胺水溶液處理l 2 分鐘 7 流水沖洗數(shù)分鐘 8 自然脫水 于光學(xué)顯微鏡下觀察 2 2 6i 型膠原免疫組織化學(xué)染色 取第3 代細(xì)胞 接種于預(yù)置蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板 普通培養(yǎng)液培養(yǎng) 2 天換液一次 培養(yǎng)1 2 天取出蓋玻片 以p b s 洗滌三次 9 5 酒精固定2 0 分鐘 按照以下方法操作 1 3 過(guò)氧化氫孵育5 1 0 分鐘 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性 2 蒸餾水沖洗2 分鐘x 3 次 加5 正常山羊血清封閉 室溫下2 0 分鐘 3 棄去多余液體 滴加5 0 u l 鼠i 型膠原單克隆抗體中作液 3 7 c 孵育1 小時(shí) 4 c 冰箱過(guò)夜 4 0 0 1 m p b s 漂洗3 分鐘x 3 次 5 滴加生物素化羊抗鼠i g g 中作液5 0 u 1 3 7 c 孵育1 小時(shí) 1 3 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 6 0 0 1 m p b s 漂沈3 分鐘x3 次 7 滴加5 0 u l s a b c 復(fù)合液 3 7 孵育1 5 分鐘 8 0 0 1 m p b s 漂洗3 分鐘 3 次 9 滴加i o o u l d a b 顯色液 室溫顯色3 1 0 分鐘 光鏡下控制顯色時(shí)間 1 0 蒸餾水反復(fù)洗滌以終止反應(yīng) 蘇木素復(fù)染 脫水 透明 封片 2 2 7 骨鈣素免疫組化染色 染色方法同i 型膠原免疫組化染色 操作過(guò)程中使用的抗體 一抗為骨鈣素抗血清 二抗為生物素化羊抗人i g g 2 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用s p s s l 3 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理 各組數(shù)據(jù)均以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 s 表示 采用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析 o n e w a ya n o v a 檢驗(yàn) 各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)兩兩比較采用 l s d 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 尺0 0 5 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 1 4 兔皮質(zhì)骨米源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3 1 倒置相差顯微鏡觀察 3 1 1 原代細(xì)胞觀察 倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)新接種的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中 為圓形透亮細(xì)胞 見(jiàn)圖1 1 4 5 h 后細(xì)胞開(kāi)始貼壁 2 4 h 后細(xì)胞大部分貼壁 呈長(zhǎng)梭形 短梭形及橢圓形 第2 3 d 細(xì)胞開(kāi)始增殖 形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主 也有部分短梭形 見(jiàn)圖1 2 第4 5 d 細(xì)胞增殖明 顯 形成多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞簇 細(xì)胞由簇中央向周圍生長(zhǎng) 第7 8 d 細(xì)胞繼續(xù)增殖 并連成單層片狀 形態(tài)以帶長(zhǎng) 短梭形為主 見(jiàn)圖1 3 第9 l o d 細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底 見(jiàn)圖1 4 細(xì)胞形態(tài)較均一 多為長(zhǎng)梭形 短梭形 也有少量呈三角形 3 1 2 傳代細(xì)胞觀察 倒置相差顯微鏡下可見(jiàn) 1 6 代細(xì)胞形態(tài)同原代細(xì)胞無(wú)明顯差異 初期細(xì)胞在培養(yǎng) 液中呈圓形 2 h 后細(xì)胞貼壁 4 6 h 后 大部分細(xì)胞貼壁 形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主 也有少 量三角形 細(xì)胞之間相互連接 突起較短 2 4 h 后 細(xì)胞完全貼壁 第3 4 d 細(xì)胞增殖 明顯 以長(zhǎng)梭形 三角形為主 8 9 d 細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底 從第7 代細(xì)胞丌始見(jiàn)少量空 泡細(xì)胞 細(xì)胞貼壁時(shí)間延長(zhǎng) 4 6 h 開(kāi)始貼壁 增殖速度減慢 第4 6 d 細(xì)胞丌始增殖 連續(xù)培養(yǎng)l o d 細(xì)胞仍未長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底 3 1 3 細(xì)胞結(jié)晶紫染色后的觀察 各代細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后 細(xì)胞形態(tài)如上述 但細(xì)胞之間的連接 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞 核以及核仁更加清晰可見(jiàn) 見(jiàn)圖1 5 細(xì)胞基本形狀為長(zhǎng)梭形 胞內(nèi)有一個(gè)細(xì)胞核 容 納l 3 個(gè)核仁 核漿比例為1 4 1 2 不等 細(xì)胞之間分界清楚 但突起相互交織在一起 使細(xì)胞連成一片 核漿比例較小 單核 核仁一般為l 2 個(gè) 處于分裂期時(shí)雙核 可有 5 6 個(gè)核仁 而且細(xì)胞分解更加清晰 見(jiàn)圖1 6 各種細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色或淡藍(lán)色 黑白 照呈灰黑色 細(xì)胞核圓形或橢圓形 淡染 核仁呈小圓點(diǎn) 深藍(lán)色 3 2 各代細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖測(cè)定 5 種不同代數(shù)的細(xì)胞增殖過(guò)程如表3 所示 生長(zhǎng)過(guò)程分為生長(zhǎng)緩慢的潛伏期 增殖 迅速的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的平臺(tái)期 5 代細(xì)胞其大致增殖時(shí)間為 第1 2 d 細(xì) 胞數(shù)量無(wú)明顯增加 第3 d 開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量明顯增加 在第7 8 d 達(dá)到最高峰 然后進(jìn)入緩 慢的增殖期 細(xì)胞增殖速度 第1 2 天 各代細(xì)胞增殖無(wú)差別 乃o 0 5 第3 天開(kāi)始第7 8 代細(xì)胞增殖速度明顯落后于第2 3 和6 代細(xì)胞 尺0 0 5 而第2 3 同6 代及第7 代 同第8 代細(xì)胞之間并無(wú)明顯差別 乃0 0 5 福建中醫(yī)約人學(xué)碩十學(xué)位論文 o 6 o 5 0 4 o 3 0 d 值 o 2 o 1 0 一貧j 2 代 德3 代 i 罵 笫6 代 笫7 代 d 一筇8 代 一 磊 7 多q 么 j 豫 f 一一 瘤 1 7 i t m h m 描 l d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d1 0 d 表3m t t 法檢測(cè)不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 f i g3t h eg r o w t hc u r v e so fc e l l sf r o md i f f e r e n tg e n e r a t i o nb ym t t 3 3 各代細(xì)胞a l p 表達(dá)情況 如表4 示 各代成骨細(xì)胞都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)a l p 活性不斷增高 在培養(yǎng)初期第 2 3 和6 代成骨細(xì)胞a l p 檢測(cè)明顯高于第7 8 代成骨細(xì)胞 而第2 3 與6 代及第7 代與第8 代之問(wèn)無(wú)顯著性差異 隨培養(yǎng)時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)這種差異不斷擴(kuò)大 在第1 2 天時(shí)這 種差異尤為明顯 p 0 0 5 與第3 代比較 p 0 0 5 與第2 3 6 代比較 p 0 0 5 3 4 細(xì)胞a l p 染色 細(xì)胞培養(yǎng)7 天行a l p 染色 a l p 染色呈陽(yáng)性 細(xì)胞呈灰黑色 胞漿內(nèi)有灰黑色顆粒 沉淀 見(jiàn)圖1 7 a l p 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 7 0 3 5i 型膠原免疫組織化學(xué)染色 經(jīng)染色后可見(jiàn)胞漿內(nèi)及細(xì)胞間有大量的棕黃色顆粒存在 明顯的強(qiáng)陽(yáng)性 見(jiàn)圖1 8 3 6 骨鈣素免疫組化染色 細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒存在 呈明顯的強(qiáng)陽(yáng)性 見(jiàn)圖1 9 1 6 兔皮質(zhì)骨米源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究 4 討論 4 1 成骨細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題 成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性直接影響組織工程化活性骨的質(zhì)量 因此 對(duì)成骨細(xì)胞的研 究是骨組織工程重要內(nèi)容之一 成骨細(xì)胞來(lái)源多樣 細(xì)胞取材常用的機(jī)體來(lái)源有動(dòng)物如 猴 羊 豬 狗 兔 鼠等 胚胎及人類遺棄的組織或者新鮮尸體等 而其組織來(lái)源又 包括 骨膜 骨松質(zhì) 骨皮質(zhì) 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨外間充質(zhì)干細(xì) 胞 胚胎干細(xì)胞等 1 這些細(xì)胞來(lái)源各有優(yōu)缺點(diǎn) 骨髓干細(xì)胞因取材較方便 具有多向 分化潛能 條件誘導(dǎo)下可向成骨細(xì)胞分化 是一種很有前途的種子細(xì)胞來(lái)源 是目前常 用的種子細(xì)胞之一 但干細(xì)胞需要分離純化 且干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化 需要一定的誘 導(dǎo)條件 誘導(dǎo)成功后仍可能存在分化不夠穩(wěn)定等問(wèn)題 近年來(lái)松質(zhì)骨來(lái)源的成骨細(xì)胞的 研究很多 3 松質(zhì)骨主要是疏松的骨小梁成分 來(lái)源廣泛 具有培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單 細(xì)胞增 殖較快等優(yōu)點(diǎn) 但骨小梁上有骨內(nèi)膜 且小梁間有很多骨髓成分 細(xì)胞成分 雜質(zhì)較多 摻有不少成纖維細(xì)胞和造血細(xì)胞等 成骨細(xì)胞成份相對(duì)不純 另一種常用的組織來(lái)源為 骨膜 細(xì)胞耿材常用的 般是外骨膜 其分為內(nèi)外兩層 內(nèi)層較薄 結(jié)締組織較疏松 纖維較少 除了豐富的小血管和神經(jīng) 還含有較多的成骨細(xì)胞 骨原細(xì)胞和未分化的干 細(xì)胞t 4 1 生長(zhǎng)時(shí)期 骨膜來(lái)源的成骨細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)具有很強(qiáng)的成骨能力 成年骨膜在創(chuàng) 傷應(yīng)激下聚集較多促骨生長(zhǎng)因子 5 1 而有很強(qiáng)的再生骨能力 因此骨膜來(lái)源的成骨細(xì)胞 具有較強(qiáng)的成骨能力和增殖速度 但由于其取材困難 容易摻雜肌肉組織 膠原成分較 多 容易混雜成纖維細(xì)胞及細(xì)胞容易污染等缺點(diǎn) 也限制了其作為種子細(xì)胞的廣泛應(yīng)用 關(guān)于骨皮質(zhì)來(lái)源的成骨細(xì)胞目前研究比較少 骨皮質(zhì)是由許多哈佛氏骨單位規(guī)則排 列而成的 發(fā)育中的骨單位表面具有活躍的成骨細(xì)胞 骨形成單位有1 0 0 4 0 0 個(gè)細(xì)胞 t 6 1 可不斷形成類骨質(zhì) 經(jīng)鈣化后成為新骨 此后成骨細(xì)胞一部分轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞 部分 仍位于骨表面 并成為扁平的內(nèi)襯細(xì)胞 在力學(xué)刺激及誘導(dǎo)下 4 8 小時(shí)后 可向成骨 細(xì)胞轉(zhuǎn)換 但不發(fā)生增殖 電鏡下觀察皮質(zhì)的成骨細(xì)胞后方總有一兩層激活的間充質(zhì)細(xì) 胞和前成骨細(xì)胞 可向成骨細(xì)胞分化 據(jù)國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明 7 1 骨皮質(zhì)培養(yǎng)成骨細(xì)胞是 可行的 成熟的成骨細(xì)胞在體內(nèi)不發(fā)生增殖 但是體外培養(yǎng) 在合適的條件下 成骨細(xì) 胞可以大量增殖 本課題前期的試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)通過(guò)酶消化法可以培養(yǎng)出細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)進(jìn) 一步檢驗(yàn)為成骨細(xì)胞 4 2 皮質(zhì)骨源成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及體外生長(zhǎng)特點(diǎn) 目前皮質(zhì)骨源性成骨細(xì)胞的常用分離方法是組織塊法和酶消化法 j a np a u l m f r o l k e 8 等用膠原酶結(jié)合組織塊法培養(yǎng)皮質(zhì)骨組細(xì)胞 a n g e l am i n h w e in g 1 等用 i 型膠原酶消化皮質(zhì)骨過(guò)夜 p h w a r n k e 叮和s p r i n g e ri n g 嵋均用組織塊法直接培養(yǎng) 組織塊法操作簡(jiǎn)單 細(xì)胞損傷小 但原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間明顯太長(zhǎng) 考慮到取材時(shí)皮質(zhì)骨 片的厚度 大小及貼壁等因素其培養(yǎng)時(shí)間約2 4 周不等 再加上后期細(xì)胞的消化 傳代 而且在后期的換液中因骨片的存在增加了細(xì)胞污染的幾率 因此整個(gè)種子細(xì)胞的培養(yǎng)周 期太長(zhǎng) 會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)及浪費(fèi)大量的人力和財(cái)力 酶消化法操作相對(duì)復(fù)雜 福建中醫(yī)藥人學(xué)碩十學(xué)位論文 胰酶會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定損傷 長(zhǎng)時(shí)間的酶消化可能破壞成骨細(xì)胞細(xì)胞膜和表型相關(guān)的膜 表面分子 1 2 1 但原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間明顯縮短 約1 2 周 如果在消化過(guò)程中注意酶及 消化時(shí)間的控制 不僅能較短時(shí)間的獲得較好的種子細(xì)胞 而且能節(jié)約大量的時(shí)問(wèn)和財(cái) 力 本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法獲取原代細(xì)胞 在倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)新接種的細(xì)胞懸浮于 培養(yǎng)液中 為圓形 橢圓形透亮細(xì)胞 大小不等 隨培養(yǎng)液移動(dòng) 約4 5 h 后部分細(xì)胞 開(kāi)始貼壁 約2 4 h 后大部分細(xì)胞貼壁 但在倒置相差顯微鏡下仍可見(jiàn)少量未貼壁的懸浮 在配液中的細(xì)胞 因此為保證不浪費(fèi)細(xì)胞 剛消化接種的細(xì)胞其換液時(shí)間最后控制在 4 8 小時(shí)以后 第2 3 d 細(xì)胞開(kāi)始增殖 形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主 第4 5 d 細(xì)胞增殖迅速 形成多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞簇 細(xì)胞由簇中央向周圍生長(zhǎng) 第7 8 d 細(xì)胞繼續(xù)增殖并連 成單層片狀 以長(zhǎng) 短梭形細(xì)胞為主 第9 一l o d 細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底 細(xì)胞形態(tài)均一 為長(zhǎng)梭形 在細(xì)胞增殖過(guò)程中 細(xì)胞密集區(qū)可表現(xiàn)為放射狀 旋渦狀或柵欄狀 第2 6 代細(xì)胞間不存在接觸抑制 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) 相互重疊成多層 細(xì)胞密度增加 未 見(jiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象 這可能是因?yàn)槌墒斓某晒羌?xì)胞能分泌大量的i 型膠原 膠原纖維交織 成網(wǎng)狀 將新增殖的成骨細(xì)胞包圍其中 導(dǎo)致細(xì)胞形成多層 為鈣化組織提供必不可少 的三維結(jié)構(gòu) 與成骨細(xì)胞的特點(diǎn)相復(fù)合 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中我們還發(fā)現(xiàn)每代細(xì)