人參三七提取物促血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究_田偉

1 人參三七提取物促血管生成的 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究 田偉 雷燕 朱凌群 陳可冀 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 2 研究背景 益氣活血中藥治療冠心病取得較好療效，促血管生成可能是的重要機(jī)制之一 前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血中藥有促進(jìn)血管生成、改善心肌缺血，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的作用，但其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和作用靶標(biāo) ？ 3 研究背景 細(xì)胞信號(hào)通路是細(xì)胞應(yīng)答內(nèi)外環(huán)境信息，經(jīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)整合作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)及細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育的途徑。細(xì)胞的增殖、分化主要與有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑有關(guān)。 Ras是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，通過 Ras-Raf-MAPK最后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng) 觀察人參三七提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成信號(hào)蛋白的作用，以闡明益氣活血藥促血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 4 血管生成的過程 外因 活化鄰近的血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌蛋白酶降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì) 血管內(nèi)皮細(xì)胞增生 血管內(nèi)皮細(xì)胞改組形成小管，隨后吻合成網(wǎng)狀并注入血流 5 研究思路 中藥促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 中藥作用靶點(diǎn) 血管生成信號(hào)通路 VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 信號(hào)阻斷 VEGFR-2 Ras 6 VEGF VEGFR Ras 血管生成信號(hào)通路： VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 7 實(shí)驗(yàn) 1 人參和三七不同 配比、 濃度 、 時(shí)間 對(duì) HUVEC增殖的影響 配比： 1： 1； 1： 2； 2： 1 濃度： 0.25mg/ml、0.5mg/ml、 1mg/ml、 2mg/ml、 4mg/ml 時(shí)間： 24h， 48h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 2 3 4 5 時(shí)間 （ 天 ） MTTA B C D E F HUVEC 不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn) 生長曲線圖 24h內(nèi)皮細(xì)胞增殖直方圖 人參三七提取物 配比 ： 2： 1 濃度 ： 4mg/ml 時(shí)間 ：培養(yǎng) 24h HUVEC增殖作用最強(qiáng) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 人參：三七 (1:1) 人參：三七 (1:2) 人參：三七 (2:1) 空白對(duì)照組 0.25mg/mL 0.5mg/mL 1mg/mL 2mg/mL 4mg/mL MTT 9 實(shí)驗(yàn) 2 人參三七提取物促 VEC增殖 和分泌 VEGF 實(shí)驗(yàn)分為 5組 MTT 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖 ELISA 檢測(cè)上清 VEGF含量 人參、三七能夠促進(jìn)HUVEC增殖和分泌 VEGF 10 實(shí)驗(yàn) 3 人參三七提取物促 VEC上 VEGFR-2表達(dá) 免疫組化 SP法 051015202530組別陽性細(xì)胞數(shù)空白組貝復(fù)濟(jì)組中藥大劑量組中藥中劑量組中藥小劑量組陽性細(xì)胞光密度 陽性細(xì)胞數(shù) 人參、三七能促進(jìn) VEGFR-2的表達(dá)，其作用和 bFGF相當(dāng) 11 實(shí)驗(yàn) 4 人參三七提取物對(duì)血管生成 信號(hào)蛋白及其 mRNA的影響 檢測(cè)血管生成信號(hào)通路上 VEGFR-2、 Ras、 MAPK 蛋白及其 mRNA表達(dá) 探討益氣活血中藥干預(yù)后，對(duì)血管生成信號(hào)蛋白VEGFR-2、 Ras、 MAPK表達(dá)的影響 方法： western blotting ;RT-PCR 12 信號(hào)蛋白 VEGFR-2 、 Ras、 MAPK蛋白 及其 mRNA的表達(dá) A B C D E A B C D E 21kD -actin VEGFR-2 -actin Ras A 空白組； B bFGF組； C 中藥大劑量組； D 中藥中劑量組； E 中藥小劑量組 各組 VEGFR-2 蛋白的表達(dá) 各組 Ras 蛋白表達(dá)比較 43 kD 43 kD 215 kD -actin MAPK 43 kD 46 kD 各組 MAPK蛋白表達(dá)條帶 A B C D E 13 表 1 各組蛋白免疫印跡雜交信號(hào)強(qiáng)度 灰度平均值比較 (n=3) x, 組別 VEGFR-2/-actin Ras/-actin MAPK/-actin 空白對(duì)照 1.58 0.102 0.28 0.001 0.38 .0110 bFGF組 2.11 0.211 0.42 0.017 0.58 .0206 中藥大劑量 2.07 0.189 0.53 0.237 0.45 .0299 中藥中劑量 1.48 0.173 0.34 0.029 0.38 .0215 中藥小劑量 1.39 0.261 0.49 0.028 0.48 .0142 注：與空白組比較， P 0.05； P0.01 14 血管生成信號(hào)蛋白 MARK及其 -mRNA的表達(dá) 15 結(jié)果和結(jié)論 與空白組相比，中藥大劑量組 VEGFR-2、 Ras 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，小劑量組 MAPK、Ras蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。bFGF組 VEGFR-2、 Ras、MAPK的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P0.05 P0.01） 人參、三七可促進(jìn)血管生成信號(hào)蛋白 VEGFR-2 Ras MAPK的表達(dá) 可能是益氣活血藥促內(nèi)皮增殖，產(chǎn)生血管生成效應(yīng)的基礎(chǔ) 以上三個(gè)信號(hào)蛋白的 mRNA表達(dá)未見增加 16 實(shí)驗(yàn) 5 SU5416阻斷 對(duì) VEGFR-2下游 信號(hào)蛋白的影響及中藥干預(yù) 目的：觀察下游信號(hào)蛋白 Ras/MAPK表達(dá)，明確中藥 作用靶點(diǎn) 方法：加入半數(shù)抑制量的 SU5416，對(duì)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白 VEGFR-2進(jìn)行 IC50 阻斷，中藥干預(yù) SU5416： VEGFR-2 酪氨酸激酶的抑制劑，能阻斷來自細(xì)胞外血管生長刺激信號(hào)和已激活信號(hào)的轉(zhuǎn)化通路 SU5416阻斷后， Ras表達(dá) A：空白組 B： SU5416組 C： SU5416+中藥大劑量組 D： SU5416+中藥中劑量組 E： SU5416+中藥小劑量組 SU5416阻斷后， MAPK表達(dá) A：空白組； B： SU5416組； C： SU5416+中藥大劑量組； D： SU5416+中藥中劑量組； E： SU5416+中藥小劑量組 19 結(jié)論 人參、三七組方可以 顯著 促進(jìn) Ras蛋白的表達(dá) 促進(jìn) MAPK蛋白的表達(dá) 可以確定中藥直接作用于 Ras 暫不能肯定中藥是否作用于 Ras下游信號(hào)蛋白 MAPK 20 實(shí)驗(yàn) 6 FPP對(duì)下游信號(hào)蛋白 MARK 的影響及中藥干預(yù) 目的：觀察下游信號(hào)蛋白 MAPK表達(dá)， 明確 中藥靶點(diǎn) 方法： 加入半數(shù)抑制量的 FPP，對(duì) Ras 進(jìn)行 IC50 阻斷，中藥干預(yù) FPP：是法尼基轉(zhuǎn)移酶（ FTase）的競爭性抑制劑， FPP和 Ras蛋白均為 FTase的底物， FPP可以競爭性抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制 Ras信號(hào)蛋白的傳導(dǎo) FPP阻斷后， MAPK 表達(dá) A：空白組； B： FPP組； C： FPP+中藥大劑量組； D： FPP+中藥中劑量組； E： FPP+中藥小劑量組 圖 8-1 各組 MAPK蛋白表達(dá)條帶 22 結(jié)論 人參、三七組方可以 促進(jìn) MAPK 蛋白的表達(dá) 中藥直接作用于 MAPK這一靶點(diǎn) 23 實(shí)驗(yàn) 7 三維細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC形成 血管樣結(jié)構(gòu) 目的：比較二維與三維培養(yǎng) HUVEC成血管樣結(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)上的差別 方法：利用 Transwell 構(gòu)建三維培養(yǎng)體系 24 二維細(xì)胞培養(yǎng) （ x10） 25 二維細(xì)胞培養(yǎng) （ x10） 26 細(xì)胞培養(yǎng)第 3天 （ x10） 27 細(xì)胞培養(yǎng)第 4天 （ x10） 28 細(xì)胞培養(yǎng)第 5天（ x10） 29 LSCM逐層掃描 30