基因工程原理習(xí)題與答案.docx

基因工程原理習(xí)題集1、DNA分子克隆技術(shù)：克隆，指含有單一的DNA重組體的無(wú)性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系的過(guò)程。DNA分子克隆技術(shù)也稱基因克隆技術(shù)，是在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程。其基本步驟包括：制備目的基因?qū)⒛康幕蚺c載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩選、鑒定擴(kuò)增和表達(dá)。載體在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)，另一種是cDNA庫(kù)。2、分子雜交：兩條不同來(lái)源的DNA（或RNA）鏈或DNA與RNA之間存在互補(bǔ)順序時(shí)，在一定條件下可以發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋分子，這種分子稱為雜交分子。形成雜交分子的過(guò)程稱為分子雜交。3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：從不同個(gè)體制備的DNA，使用同一種限制性內(nèi)切酶酶切，切得的片段長(zhǎng)度各不相同。酶切片段的長(zhǎng)度可以作為物理圖譜或者連接圖譜中的標(biāo)記子。通常是在酶切位點(diǎn)處發(fā)生突變而引發(fā)的。4、報(bào)告基因：一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因,也就是說(shuō),是一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因、5、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：一種體外擴(kuò)增DNA的方法。PCR使用一種耐熱的多聚酶，以及兩個(gè)單鏈引物。以過(guò)高溫變性將模板DNA分離成兩條鏈。低溫退火使得引物和一條模板單鏈結(jié)合，然后是中溫延伸，反應(yīng)液的游離核苷酸緊接著引物從5/端到3/端合成一條互補(bǔ)的新鏈。而新合成的DNA又可以繼續(xù)進(jìn)行上述循環(huán)，因此DNA的數(shù)目不斷倍增。6、核酸的凝膠電泳：將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的摩擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極向正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠進(jìn)行染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。7、細(xì)菌轉(zhuǎn)化：所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致遺傳特性發(fā)生改變的過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株則叫做受體菌株。大腸桿菌是使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)菌株。8、反義核酸：指與靶DNA或RNA堿基互補(bǔ)，并能與之結(jié)合的一段DNA或RNA。9、RNA interference：是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA 導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過(guò)程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制范疇。10、Spi：噬菌體體重組克隆的一種篩選方法，其篩選方法是Spi+：不能感染E.coli(p2)； Spi-：(red- gam-)能感染E.coli(p2),形成小噬斑/host recA+/chi。包裝時(shí)若gam- ,需recA產(chǎn)物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑)，所以對(duì)宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/gam+可在recA-受體中增殖。11、DNA文庫(kù)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫(kù)，它包含了該生物的所有基因。12、cDNA：cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。13、cDNA文庫(kù)：以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。14、DNA探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。15、轉(zhuǎn)導(dǎo)（作用）：借助于病毒載體，遺傳信息從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。16、染色體步移：通過(guò)相互重疊的基因組克隆之間進(jìn)行一連串雜交從而實(shí)現(xiàn)染色體上基因的定位。17、斑點(diǎn)雜交：將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定后與探針進(jìn)行雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。18、-complementation：質(zhì)粒載體重組克隆的篩選方法，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。LacZM15 ：放在F質(zhì)粒上，隨宿主傳代；LacZ ：放在載體上，作為篩選標(biāo)記。19、菌落原位雜交：將細(xì)胞從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。20、核酸原位雜交：標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交的方法。21、限制性內(nèi)切酶：識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。22、酶切位點(diǎn)：DNA上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別出這個(gè)序列并在此將DNA酶切成兩段。23、DNA連接酶：催化DNA中相鄰的5/磷酸基與3/羥基間形成磷酸二酯鍵，使DNA切囗封合，連接DNA片段。24、持家基因：是指對(duì)所有類型組織細(xì)胞在任何時(shí)候都需要其表達(dá)的基因，通常都是維持細(xì)胞基本生存所必須的基因，其表達(dá)常保持在固定的水平。又稱為組成性表達(dá)基因。25、奢侈基因：只在某特定的細(xì)胞類型中表達(dá)或者說(shuō)只在發(fā)育階段的某些時(shí)期表達(dá)的基因叫做奢侈基因。26、Tm值：是反映DNA的熱穩(wěn)定性的一個(gè)參數(shù)，稱為DNA的熔解溫度，系指一半的雙鏈DNA解離成為單鏈時(shí)的溫度。27、分子標(biāo)記：廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記是指能夠用來(lái)作為指紋鑒定或區(qū)分個(gè)體特點(diǎn)的DNA片段。28、基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的重新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)的過(guò)程。29、載體：是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA，它們一般是通過(guò)改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。30、衛(wèi)星DNA：又稱短串聯(lián)重復(fù)，26個(gè)核苷酸組成的重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)（1060次），兩側(cè)為特異的單拷貝序列，人類基因組中每10kbDNA序列至少有一個(gè)STR序列。31、多克隆位點(diǎn)：DNA中含有兩個(gè)以上密集的、能被多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)區(qū)。32、定位克隆：也稱為圖位克隆，是在獲取基因在染色體上的位置信息后，采用各種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)基因進(jìn)行克隆和定位。定位克隆包括定位和克隆兩個(gè)過(guò)程，定位是通過(guò)連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置，克隆是從定位的染色體區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。 也可以回答為“通過(guò)遺傳標(biāo)記”先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進(jìn)行突變的篩選，并獲得cDNA及全基因的過(guò)程。33、基因芯片：基因芯片又稱為DNA微陣列，以基因序列為分析對(duì)象的微陣列，是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。34、RT-PCR：是以RNA為起始材料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲取目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆cDNA及合成cDNA探針，改造cDNA序列等。35、錨定PCR：用于在體外擴(kuò)增未知序列的DNA片段的方法，一般的PCR必須預(yù)先知道欲擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)的序列，但人們經(jīng)常需要分析一端序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補(bǔ)的引物作為錨定引物，在與基因另一側(cè)配對(duì)的特異引物參與下，擴(kuò)增帶有同聚物尾的序列。錨定引物PCR對(duì)分析未知序列基因有特殊用途。36、反向PCR：常規(guī)PCR可擴(kuò)增位于兩個(gè)引物之間的DNA片段，但不能擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA序列，反向PCR則可擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA片段，對(duì)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。其原理為：先用一種在目標(biāo)DNA區(qū)段上沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶從距離目標(biāo)DNA一定距離的兩側(cè)位置切割DNA分子，然后將這些片斷進(jìn)行分子內(nèi)連接形成環(huán)，根據(jù)已知的目標(biāo)DNA序列按照向外延伸的要求設(shè)計(jì)一對(duì)向外引物，保證被擴(kuò)增的是目標(biāo)DNA區(qū)段兩側(cè)的未知序列。37、多重PCR：在同一反應(yīng)中采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏、快速的特點(diǎn)，特別適用于檢測(cè)單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結(jié)果與southern blotting一樣可靠。38、質(zhì)粒：是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做載體。39、粘粒載體：也叫柯斯質(zhì)粒，是一類人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和復(fù)制子的特殊特殊類型的質(zhì)粒載體。40、穿梭質(zhì)粒載體：是人工構(gòu)建的一類具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可以在兩種不同寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。41、基因突變：基因突變是指由于DNA堿基對(duì)的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱點(diǎn)突變。42、逆轉(zhuǎn)錄酶：在體內(nèi)、外均能轉(zhuǎn)錄病毒性RNA成為DNA，稱為依賴RNA多聚酶，即為逆轉(zhuǎn)錄酶。分布在病毒的類核內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄酶與三種功能有關(guān)： 使RNA一DNA雜合雙鏈形成；切除雜合雙鏈中的RNA鏈；進(jìn)而再生成DNA一DNA的雙鏈。43、扣除雜交：就是用一般細(xì)胞的mRNA與特殊細(xì)胞的cDNA雜交，先扣除一般共有的cDNA，再將剩下的特異的cDNA進(jìn)行克隆，用此方法已成功克隆出控制動(dòng)物胚胎發(fā)育和組織分化的基因。44、測(cè)序酶 為修飾的T7 DNA polymerase，99%3-5外切活性被除去（Version1.0）；完全除去(V 2.0)；用于測(cè)序反應(yīng)(測(cè)序酶)。45、YAC載體 酵母人工染色體載體；含酵母染色體復(fù)制起點(diǎn)ori，自主復(fù)制序列ARS；著絲粒（CEN）；兩個(gè)端粒（TEL）。用于克隆50kb以上甚至-Mb（200-500kb）。原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化，URA3-trp-ade2-1赭石突變酵母菌，紅色菌落插入失活。46、同尾酶 一類產(chǎn)生相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶。47、cI篩選法 C基因發(fā)生突變時(shí)不能溶源化，C- ：在hflA（高頻溶源化）中形成噬斑。C+ 在hflA中形成溶源，產(chǎn)生混濁噬斑。48、Sanger測(cè)序 即酶法測(cè)序，用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過(guò)聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。49、同裂酶：DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，產(chǎn)生相同粘性末端，這類限制性內(nèi)切酶稱為同裂酶。50、復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)，DNA復(fù)制在起始位點(diǎn)處形成復(fù)制叉進(jìn)行雙向復(fù)制，通常DNA復(fù)制的起始DNA序列存在重復(fù)倒位序列。51、啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的部位。在RNA合成開(kāi)始位點(diǎn)的上游大約10bp和35bp處有兩個(gè)共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個(gè)序列的共同順序如下,-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動(dòng)子均有共同順序(consensus sequence)，只有少數(shù)幾個(gè)核苷酸的差別。52、起始密碼子：AUG不僅是Met或者fMet(在原核細(xì)胞)的密碼子，也是肽鏈合成的起始信號(hào)，故稱AUG為起始密碼子。53、起始因子： 在蛋白質(zhì)生物合成的起始階段與核糖體亞基結(jié)合，起始蛋白質(zhì)的合成。在E.coli中已分離出三種IF。IF1、IF2和IF3。其中，IF3具有形成三元復(fù)合物和解離因子活性，使70S核糖體顆粒解離為30S和50S亞基；IF2形成30S前起始復(fù)合物；IF1無(wú)特異功能，但具有加強(qiáng) IF2和IF3的活性作用。54、復(fù)制終點(diǎn)DNA復(fù)制的終止位點(diǎn)，DNA復(fù)制在起始位點(diǎn)處形成復(fù)制叉進(jìn)行雙向復(fù)制，在終止位點(diǎn)處終止DNA復(fù)制，通常DNA復(fù)制的終點(diǎn)DNA序列存在重復(fù)倒位序列。55、終止子：細(xì)菌DNA中有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，稱為終止子。作用是在DNA模板的特異位點(diǎn)處終止RNA的合成。在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開(kāi)模板DNA。56、終止密碼子：UAA、UAG和UGA為終止密碼子，不代表任何氨基酸，也稱為無(wú)意義密碼子。57、終止因子： 蛋白質(zhì)肽鏈合成的終止因子，在E.coli中已分離出三種釋放因子。RF1，RF2和RF3。其中，只有RF3與GTP(或GDP)能結(jié)合。它們均具有識(shí)別mRNA鏈上終止密碼子的作用，使肽鏈釋放，核糖體解聚。二、選擇題1、對(duì)限制性內(nèi)切酶的作用，下列哪能個(gè)不正確？- A、識(shí)別序列長(zhǎng)度一般為46bp B、只能識(shí)別和切割原核生物DNA分子 C、識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu) D、切割原核生物DNA分子2、1、同一種質(zhì)粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時(shí)，它們的遷移速率是：A、OC DNASC DNA L DNA。 B、SC DNA L DNAOC DNA。C、L DNAOC DNASC DNA。 D、SC DNAOC DNAL DNA。3、下列關(guān)于基因克隆操作方法的敘述哪一個(gè)是不正確的。A、選擇合適的限制酶，使其在特定的位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。B、選擇能夠進(jìn)行自我復(fù)制的小分子DNA作為載體DNAC、基因克隆就是分子雜交D、制備所需要的DNA片段，用DNA連接酶使其和載體DNA連接成重組DNA。4、酵母雙雜交體系被用來(lái)研究_ A、哺乳動(dòng)物功能基因的表型分析 B、酵母細(xì)胞的功能基因 C、蛋白質(zhì)的相互作用 D、基因的表達(dá)調(diào)控5、有關(guān)反轉(zhuǎn)錄的正確敘述是_ A、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)不需要引物 B、反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是cDNA C、反轉(zhuǎn)錄的模板可以是RNA,也可以是DNA D、合成鏈的方向是3/5/6、關(guān)于禽類RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)活性的描述,正確的選擇是_ A、DNA聚合酶活性,3/5/的外切酶活性,DNA旋轉(zhuǎn)酶活性 B、DNA聚合酶活性,5/3/的外切酶活性,DNA旋轉(zhuǎn)酶活性 C、DNA聚合酶活性,DNA內(nèi)切酶活性,DNA旋轉(zhuǎn)酶活性7、用于分子生物學(xué)和基因工程研究的載體必須具備兩個(gè)條件_ A、含有復(fù)制原點(diǎn),抗選擇基因 B、含有復(fù)制原點(diǎn),合適的酶切位點(diǎn) C、抗性基因,合適的酶切位點(diǎn)8、關(guān)于核酸電泳的敘述,錯(cuò)誤的是?_ A、泳動(dòng)速率與分子構(gòu)象有關(guān) B、聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率最高 C、分子泳動(dòng)的方向與凈電荷有關(guān) D、泳動(dòng)速率與分子大小有關(guān)9、mRNA的序列是5/ACUGAGCU3/,那么通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的序列應(yīng)該是:_ A、5/TGACTCGA3/ B、5/AGCTCAGT3/ C、5/AGCUCAGU3/ D、5/ACTGAGCT3/10、PCR實(shí)驗(yàn)的特異性主要取決于_ A、DNA聚合酶的種類 B、反應(yīng)體系中模板DNA的量 C、引物序列的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度 D、四種dNTP的濃度11、下列關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的敘述哪一個(gè)是不正確的?A、限制性內(nèi)切酶存在于許多種細(xì)菌中B、限制酶的功能是識(shí)別和降解外來(lái)的DNAC、限制酶是識(shí)別和降解DNA的酶的總稱D、限制酶能識(shí)別DNA分子上特定的核苷酸序列并在特定的位點(diǎn)切割DNA12、下列關(guān)于cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的敘述中,哪一項(xiàng)是不正確的? A、cDNA文庫(kù)代表了mRNA來(lái)源 B、從不同類型細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)可用于分離差異表達(dá)的基因 C、cDNA文庫(kù)代表的所有的DNA,適合于研究基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié) D、基因組文庫(kù)在理論上均等的代表了所有基因序列13、下列關(guān)于DNA連接酶的敘述哪一個(gè)是不正確的?A 、催化DNA鏈中相鄰的3-OH末端和5-磷酸基之間形成磷酸二酯鍵。B、在DNA的體外重組中，用于具有粘性末端DNA分子之間的連接。C、在DNA的體外重組中，用于平末端DNA分子之間的連接。D、催化DNA鏈中的5-OH末端和3-磷酸基之間形成磷酸二酯鍵。14、下列關(guān)于DNA克隆載體的敘述哪一個(gè)是不正確的?A、應(yīng)是宿主細(xì)胞本來(lái)就具有的或是宿主細(xì)胞完全可接受的DNA分子B、載體DNA都應(yīng)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的抗生素抗性C、它不僅能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制，而且也能復(fù)制它所連接的DNA分子D載體DNA經(jīng)與外源DNA連接后，仍不失自我復(fù)制能力15、下列關(guān)于克隆載體質(zhì)粒的敘述哪一個(gè)是錯(cuò)誤的? A、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳因子，一般為雙鏈環(huán)狀的DNA分子B、質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)能自主地進(jìn)行復(fù)制C、質(zhì)粒上都有產(chǎn)生大腸桿菌素的基因D、通過(guò)“轉(zhuǎn)化”，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能使受體菌獲得新的遺傳特性 16、下列關(guān)于質(zhì)粒pBR322DNA的敘述哪一個(gè)是錯(cuò)誤的? A、它的分子量較小，易于進(jìn)入細(xì)胞B、含有抗四環(huán)素(TetR)和抗氨芐青霉素(AmpR)的基因C、若用EcoRI切割該質(zhì)粒，不破壞它的兩個(gè)抗生素抗性基因D、用BamHI限制酶切割pBR322質(zhì)粒，將破壞它的抗氨芐青霉素基因 17、下列關(guān)于克隆載體細(xì)菌人工染色體BAC的敘述哪一個(gè)是錯(cuò)誤的? A、能插入幾百kb長(zhǎng)的DNA片段B、它含有抗四環(huán)素的選擇性標(biāo)記。C、它含有抗氯霉素的選擇性標(biāo)記(CmR)。D、具有一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)制原點(diǎn)，可獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制18、下列關(guān)于克隆載體噬菌體的敘述哪一個(gè)是錯(cuò)誤的?A、噬菌體侵染大腸桿菌，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖。B、噬菌體基因組中13的DNA是非必須的，可以用外來(lái)的DNA替換之。C、允許插入噬菌體的DNA片段的長(zhǎng)度不限D(zhuǎn)、 噬菌體侵染大腸桿菌可通過(guò)溶源途徑使它的DNA整合到宿主基因組上19、下列關(guān)于PCR的敘述哪一個(gè)是不正確的？ A、是Mullis于1984年發(fā)明的一種體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)。B、根據(jù)DNA復(fù)制的基本原則，反應(yīng)體系中需加入RNA聚合酶以合成引物。C、在PCR反應(yīng)體系中，需要特定的引物、dNTP、鎂離子等。D、需要模板DNA，即擴(kuò)增的DNA片段。20、下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述哪一個(gè)是不正確的?A、基因工程技術(shù)也稱“DNA重組技術(shù)”、“基因克隆”或“基因操作技術(shù)”。B、基因工程技術(shù)俗稱“遺傳工程”。C、基因工程技術(shù)需要限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等D、基因工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)生于1965年。21、下列關(guān)于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的敘述哪一個(gè)是錯(cuò)誤的？ A、它存在于根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。B、該質(zhì)粒上的T-DNA片段能夠被整合進(jìn)植物細(xì)胞染色體。C、它的T-DNA片段上含有參與植物生長(zhǎng)激素和冠癭堿合成的基因。D、它存在于所有的土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。 三、填空題1、大部分真核基因都是由蛋白質(zhì)編碼序列和非蛋白質(zhì)編碼序列兩部分組成,其中編碼序列稱為_(kāi)，非編碼序列稱為_(kāi)，在一個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，由于編碼蛋白質(zhì)的部分常被非編碼序列隔開(kāi)，所以，真核基因也被稱為_(kāi)。2、在噬菌體基因組中，目前發(fā)現(xiàn)的基因有60多個(gè)，其中一半左右參與了噬菌體生命周期的調(diào)控，這類基因稱為_(kāi)，另外一部分基因稱為_(kāi)。3、一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程叫做_ ，提供DNA的菌株叫_，接受DNA的菌株叫 _。4、PCR反應(yīng)主要有_、_、_三個(gè)步驟5、為了防止DNA的自身環(huán)化，可用_脫去雙鏈DNA_。6、基因工程中常用的載體有_、_、_。7、YAC載體容載能力是_，BAC載體的容載能力是_。8、用于電泳分離DNA或RNA的凝膠有_、_其中_可區(qū)分1bp的DNA。9、DNA探針標(biāo)記的方法有_、_。10、EcoR識(shí)別和切割位點(diǎn)是_，BamH識(shí)別和切割位點(diǎn)是_，Sau3A識(shí)別和切割位點(diǎn)是_。11、反轉(zhuǎn)錄酶除具有催化的合成外，還具有_的作用，可將雜種雙鏈中的_水解掉。12、質(zhì)粒載體容載能力是_，噬菌體載體的容載能力是_。13、不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率也不同，SC DNA的泳動(dòng)速度_，OC DNA泳動(dòng)速度_，L DNA泳動(dòng)速度_。14、噬菌粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA共同構(gòu)成的，其中來(lái)自質(zhì)粒的主要結(jié)構(gòu)是_，而來(lái)自噬菌體的主要結(jié)構(gòu)是_。四、判斷題1、所謂引物就是同DNA互補(bǔ)的一小段RNA分子。2、核酸分子在電場(chǎng)中向正極移動(dòng),蛋白質(zhì)向負(fù)極移動(dòng)。3、哺乳動(dòng)物某一類型細(xì)胞中,只有大約10%的mRNA是該類型所特有的,這類基因稱為持家基因。4、逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA或DNA為模板以tRNA為引物合成DNA。五、說(shuō)明題（下列各項(xiàng)在基因工程中的主要作用或功能）1、聚丙酰胺凝膠：2、pUC118噬菌粒載體： 3、T4多核苷激酶：4、Ti質(zhì)粒 5、 dNTP6、瓊脂糖：7、DNA探針： 8、堿性磷酸酶：9、IPTG10、x-gal六、問(wèn)答題1、分子標(biāo)記是怎樣逐步演化的?2、限制性核酸內(nèi)切酶有哪能幾種類型?哪一種類型的限制酶最適合于基因工程,為什么?請(qǐng)簡(jiǎn)要說(shuō)明理由、3、生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌如何保護(hù)自己的DNA不被降解?4、怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoRI限制位點(diǎn)中去?5、某重組體的插入片段為線狀雙鏈,長(zhǎng)度為10.0kb,被限制性核酸內(nèi)切酶A和B降解的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分級(jí)分離后結(jié)果如下: (1)酶A單獨(dú)消化時(shí),得到1.5kb和8.5kb的2個(gè)片段 (2)酶B單獨(dú)消化時(shí),得到0.5kb、3.0kb、6.5kb的3個(gè)片段 (3)酶A和酶B一起消化時(shí),得到0.5kb、1.0kb、2.0kb和6.5kb的4個(gè)片段 根據(jù)上述信息畫(huà)出該插入片段的限制性內(nèi)切酶圖譜。6、簡(jiǎn)述重組DNA(基因工程)的主要步驟7、簡(jiǎn)述分子克隆的基本步驟8、說(shuō)明基因克隆的一種方法9、何為基因工程?試述其對(duì)遺傳學(xué)的意義10、在進(jìn)行基因工程時(shí),載體是攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表達(dá)的工具,請(qǐng)問(wèn)一個(gè)載體應(yīng)具有那些基本特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?11、重組DNA技術(shù)的發(fā)展與載體的發(fā)現(xiàn)和研究密切相關(guān),作為載體應(yīng)當(dāng)具備哪些條件?12、什么是cDNA文庫(kù)?同基因組文庫(kù)有何差別?13、建立一個(gè)基因文庫(kù)后,如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克隆?14、簡(jiǎn)述cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程15、簡(jiǎn)述PCR相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用16、PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制兩者有哪些主要的相同點(diǎn)和不同點(diǎn),各舉出5個(gè)17、PCR反應(yīng)包括哪些基本要素?18、基因工程中常用一互補(bǔ)來(lái)篩選重組質(zhì)粒,請(qǐng)說(shuō)明其原理、19、RFLP的中英文名?20、說(shuō)明基因芯片的工作原理及其在生物學(xué)研究中的意義21、什么是管家基因?有何意義?22、說(shuō)明報(bào)告基因的一種用途23、核酸原位雜交的基本步驟有哪些?24、DNA分子標(biāo)記有哪些種類?25、重組的類型有哪些?26、說(shuō)明PCR反應(yīng)的基本原理并列舉幾種特殊的PCR方法27、核酸分子探針有哪些種類?試說(shuō)明各類探針的特點(diǎn)28、非放射性標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)是什么?有哪幾類非放射性標(biāo)記物?合成非放射性核酸探針的方法有哪幾種?29、核酸分子雜交中有哪些常用的濾膜雜交方法、試舉一例說(shuō)明其原理30、如何進(jìn)行啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能分析?31、用從總RNA中分離mRNA的原理是什么?32、什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星星活性?受哪些因素影響? 33、下面是一個(gè)基因工程質(zhì)粒載體形體圖，請(qǐng)指出這個(gè)載體各部分（虛線箭頭所指）的功能？并說(shuō)明這個(gè)載體的在基因克隆中的用途和工作原理？ 34、下面是一個(gè)基因工程質(zhì)粒載體形體圖，請(qǐng)指出這個(gè)載體各部分（虛線箭頭所指）的功能？并說(shuō)明這個(gè)載體的在基因克隆中的用途和工作原理？35、已知一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，如何克隆到編碼此蛋白質(zhì)的基因？七、分析題：1、在PCR擴(kuò)增時(shí)，（1）PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶，為什么？有何對(duì)策？（2）PCR擴(kuò)增后有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶，其原因是什么？應(yīng)該如何改進(jìn)？2、燃料乙醇是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能發(fā)酵六碳糖，但不能發(fā)酵五碳糖；大腸桿菌能發(fā)酵大部分碳源，但產(chǎn)乙醇的含量低。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)在大腸桿菌中生產(chǎn)乙醇的技術(shù)路線，并用圖例說(shuō)明。（注：運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌含有的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因）3、打算在細(xì)菌中表達(dá)一種稀有的藥物蛋白質(zhì)(來(lái)自人類基因)，以便能夠大量制備這種蛋白。下圖是編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列。(1)請(qǐng)問(wèn)這段cDNA序列要在大腸桿菌中表達(dá)應(yīng)當(dāng)還需考慮一些什么問(wèn)題?(2)請(qǐng)選擇一個(gè)合適的載體，試述該段cDNA序列克隆在載體中并導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)的全過(guò)程？(3) 現(xiàn)為了確保分離純化，決定將一段6個(gè)組氨酸的短肽分別加到該蛋白質(zhì)的N端或C端。這些帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)能夠緊緊地同A蛋白柱結(jié)合，但很容易被EDTA溶液洗脫。此法可以一步完成大量蛋白質(zhì)的純化。請(qǐng)你設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，各含有10個(gè)同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴(kuò)增該基因的編碼序列，另外，在N端有一個(gè)起始密碼，其后是6個(gè)組氨酸密碼子（CAC）？另設(shè)計(jì)一對(duì)引物，能夠在C端加上6個(gè)組氨酸和一個(gè)終止密碼？4、我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn)：將pdc基因（丙酮酸脫羧酶）克隆到pUC18載體中，以便在E.coli TOP10中表達(dá)，這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行：載體用BamHI切割后，立即用堿性磷酸酶處理，接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合，加入T4連接酶進(jìn)行溫育，連接后，將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照：對(duì)照1：將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。對(duì)照2：將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。對(duì)照3：將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用T4連接酶連接（但沒(méi)有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。對(duì)照4：將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用T4連接酶連接（但沒(méi)有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（見(jiàn)下表1）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)（見(jiàn)下表1）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（見(jiàn)下表1）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落，分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI進(jìn)行切割，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶，另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。表1、pdc基因克隆的結(jié)果制備的樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1次第2次第3次對(duì)照1 只有細(xì)胞TMTC00對(duì)照2 未切的載體TMTC01000對(duì)照3 省去磷酸酶處理，無(wú)pdc基因TMTC0435對(duì)照4 無(wú)pdc基因TMTC025實(shí)驗(yàn)樣品TMTC034注：TMTC=too many to count，多到無(wú)法計(jì)數(shù)（1）你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？對(duì)照1的目的是什么？（2）影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么？對(duì)照2的作用何在？（3）對(duì)照3和4各有什么作用？（4）為什么要用堿性磷酸酶處理載體？（5）pUC18表達(dá)的是pdc基因融合蛋白還是純pdc基因產(chǎn)物?為什么?（6）第三次實(shí)驗(yàn)如何進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的挑選？并說(shuō)明其原理？基因工程原理習(xí)題集參考答案二、選擇題參考答案1、B 2、B 3、C 4、C 5、B 6、C 7、B 8、C 9、B 10、C 11、C 12、C 13、D 14、B 15、C 16、D 17、B 18、C 19、B 20、D 21、D 三、填空題參考答案1、外顯子,內(nèi)含子,斷裂基因； 2、必須基因,非必須基因； 3、轉(zhuǎn)化,供體菌株,受體菌株； 4、變性、退火、延伸；5、堿性磷酸酶，5磷酸；6、質(zhì)粒載體、 噬菌體載體、人工染色體載體。7、200-500kb， 10-215kb，平均100kb；8、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺凝膠；9、切口平移法、隨機(jī)引物法；10 GAATTC， GGATCC，GATC ；11、RNA酶，RNA；12、小于10kb，9-23kb；13、 最快，最慢，居中。14、復(fù)制區(qū)，IG區(qū)。四、判斷題參考答案：1、錯(cuò)誤 2、錯(cuò)誤 3、錯(cuò)誤 4、錯(cuò)誤五、說(shuō)明題（下列各項(xiàng)在基因工程中的主要作用或功能）參考答案：1、電泳介質(zhì),用于分離大小相差1bp的DNA,或用于分離蛋白質(zhì)。2、用于制備單鏈DNA,因載體有單鏈絲狀噬菌體的IG區(qū),在幫助單鏈?zhǔn)删w的幫助下在宿主細(xì)胞中制備單鏈DNA。3、補(bǔ)齊DNA5端缺失的磷酸4、用于植物基因工程的轉(zhuǎn)化載體, 內(nèi)含T-DNA區(qū)。5、DNA合成底物。6、電泳介質(zhì),用于分離大DNA或RNA7、作為分子雜交用,用于篩選與探針同源的基因8、除去DNA5端的磷酸基,防止DNA重組時(shí)載體的自連9、安慰誘導(dǎo)物,結(jié)構(gòu)與別乳糖相似,用于誘導(dǎo)乳糖操縱元的表達(dá)10、生色劑，-半乳糖苷酶分解X-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物，用于互補(bǔ)或藍(lán)白斑篩選。六、問(wèn)答題參考答案：1、分子標(biāo)記是能夠用來(lái)作為指紋鑒定或區(qū)分個(gè)體特點(diǎn)的DNA片段。這種標(biāo)記在遺傳學(xué)研究和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有非常重要的作用。分子標(biāo)記的基礎(chǔ)是個(gè)體間存在的自然遺傳變異，進(jìn)而造成許多遺傳序列的多態(tài)性，即這些序列在不同的個(gè)體表現(xiàn)不同。分子標(biāo)記就是通過(guò)查找和應(yīng)用這種變異對(duì)個(gè)體、性狀和基因在遺傳差異的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒別。 （1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 這是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)發(fā)生變異的突變都可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。此技術(shù)包括以下基本步驟： DNA的提取和純化；DNA的限制性內(nèi)切酶酶切；用凝膠電泳將DNA片段分開(kāi)；把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上；利用放射性標(biāo)記的探針與濾膜上的DNA片段進(jìn)行雜交以顯示特定的DNA片段，然后分析結(jié)果。（2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA該技術(shù)用隨機(jī)引物非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。其特點(diǎn)包括：不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也不需要預(yù)先知道序列信息；用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段，總的來(lái)說(shuō)RAPD在檢測(cè)多態(tài)性時(shí)是一種相當(dāng)快速的方法；技術(shù)簡(jiǎn)單，RAPD分析不涉及分子雜交、放射自顯影或其他技術(shù)；RAPD分析所需DNA樣品量少；RPD分析中存在的最大問(wèn)題是重復(fù)性不太高，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中條件的變化會(huì)引起一些擴(kuò)增產(chǎn)物的改變。（3）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 其特點(diǎn)是把RFLP和PCR結(jié)合了起來(lái)。其基本步驟是：把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”），用接頭互補(bǔ)的但3/端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3/一端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增，再在有高分辨率的測(cè)序膠上分開(kāi)這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染色法均可檢測(cè)之。（4）單核苷酸多態(tài)性技術(shù) 同一位點(diǎn)的不同等位基因之間常常只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差異，因此在分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標(biāo)記，已 有2000多個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體上，在植物上也在進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。2、類限制性核酸內(nèi)切酶、類限制性核酸內(nèi)切酶和類限制性核酸內(nèi)切酶三類。類限制性核酶最適合基因工程，因?yàn)轭愊拗菩院嗣竷?nèi)切酶只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需MG2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。類和類限制性核酸內(nèi)切酶由于切割序列是隨機(jī)的，與識(shí)別序列不統(tǒng)一，因此在基因工程中沒(méi)有什么價(jià)值。3、細(xì)菌通過(guò)對(duì)自身DNA上的識(shí)別序列進(jìn)行甲基化來(lái)保護(hù)自己的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。4、對(duì)于平末端DNA，右先連上工設(shè)計(jì)合成的EcoRI切割產(chǎn)生的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，然后再插入到EcoRI限制位點(diǎn)中去；也可以將EcoRI的限制位點(diǎn)進(jìn)行改造，將粘性末端變成平末端后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。5、 6、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個(gè)基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導(dǎo)入能進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞，從而得到復(fù)制； （4）重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇和篩選。7、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個(gè)基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導(dǎo)入能進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞，從而得到復(fù)制； （4）重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇和篩選。8、差異克?。豪脕?lái)源不同DNA之間的表現(xiàn)度差異來(lái)分離差異表達(dá)基因的功能克隆方法。在任何組織中都表達(dá)的基因是管家基因，在大多數(shù)cDNA文庫(kù)中都出現(xiàn)。用一個(gè)來(lái)源的cDNA去除第二個(gè)來(lái)源中共同的RNA，留下獨(dú)特的RNA用于文庫(kù)構(gòu)建。9、基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的重新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)的過(guò)程。 基因工程是基因分子水平上的遺傳工程，是一門能定向改造生物遺傳性狀的育種新技術(shù)?；蚬こ棠苁箮в懈鞣N遺傳信息的DNA片段越過(guò)不同生物間特異的細(xì)胞界限而組入到完全不同的生物體內(nèi)。定向地控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異，從而創(chuàng)造出自然界沒(méi)有或具有新的遺傳性狀的生物新品種。10、(1)具有多克隆位點(diǎn)； （2）能自我復(fù)制； （3）具有篩選標(biāo)記；（4）在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。11、 (1)具有多克隆位點(diǎn)； （2）能自我復(fù)制； （3）具有篩選標(biāo)記；（4）在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。12、（1）cDDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。 基因組文庫(kù)指的是將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞,進(jìn)行克隆得到的所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合,它包含了該生物的所有基因。 （2）基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的差別：基因組文庫(kù)中包含了甩有的基因，而cDNA文庫(kù)只包含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)元和調(diào)節(jié)序列，因此在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)沒(méi)有多大用處。cDNA文庫(kù)代表了mRNA的來(lái)源，其中一些特定的轉(zhuǎn)錄本豐富而另一些很少，所以存在豐度的差別；而基因組文庫(kù)在理論上均等地代表了所有基因序列。從不同細(xì)胞類型制備的cDNA文庫(kù)包含一些共同序列和獨(dú)特序列，可用于分離差別表達(dá)的基因；基因組文庫(kù)中不能?；蚪M文庫(kù)由于含有不表達(dá)序列，因此比cDNA文庫(kù)大。mRNA在不同的組織之間存在豐度的差異，因此cDNA文庫(kù)的在構(gòu)建時(shí)對(duì)于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫(kù)不存在這樣的問(wèn)題。13、（1）抗生素抗性基因插入失活法； （2）一半乳糖苷酶基因失活插入法； （3）放射性標(biāo)記核酸探針雜交法。14、構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主要步驟：mRNA分離； cDNA第一鏈合成； cDNA第二鏈合成 載體與cDNA的連接；噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染； cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增和保存。15、聚合酶鏈反應(yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的的方法，因此也稱為基因的體外擴(kuò)增法。是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。其應(yīng)用主要是以下幾個(gè)方面： （1）科學(xué)研究： 基因克??；DNA測(cè)序；分析突變；基因重組與融合；檢測(cè)基因的修飾；鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的DNA序列；轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的繪圖；合成基因的構(gòu)建；構(gòu)建克隆或表達(dá)載體；檢測(cè)某基因的內(nèi)切酶多態(tài)性等。 （2）臨床診斷：細(xì)菌、病毒、螺旋體、支原體、衣原體、立克次氏體、分枝桿菌等病原體的鑒定；人類遺傳病的鑒定；診斷遺傳疾患；臨測(cè)臨床標(biāo)本中病原體的核酸序列；對(duì)法醫(yī)學(xué)標(biāo)本做遺傳學(xué)鑒定；分析激活癌基因中的突變情況；生成克隆化雙鏈DNA中的特異序列作為探針。16、（1）相同點(diǎn)：反應(yīng)的底物都是dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）；都需要DNA聚合酶的催化，而且鏈的延伸都只能是5/3/方向；都需要模板，都按半保留復(fù)制機(jī)理進(jìn)行；都需要引物；都需要MG2+催化。（2）不同點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制，而PCR中，DNA是連續(xù)復(fù)制；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，不需要將雙鏈完全解開(kāi)形成單鏈，按半不連續(xù)方式進(jìn)行DNA的復(fù)制，而PCR反應(yīng)中，DNA雙鏈必須完全解鏈，復(fù)制過(guò)程都是連續(xù)進(jìn)行的；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，DNA的解鏈通過(guò)解鏈酶催化，而PCR反應(yīng)中是通過(guò)高溫使雙鏈解離；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，引物是通過(guò)RNA聚合酶和成的RNA鏈，而PCR反應(yīng)中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸； 細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，溫度保持一致，而PCR反應(yīng)中，溫度在解鏈溫度、退火、延伸3個(gè)溫度之間變化。17、PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有六種，即引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs（包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，是PCR反應(yīng)中靶DNA序列擴(kuò)增的原料）、模板DNA和緩沖液（通常含有MGCl2、Tris一HCl、KCl等）、MG2+（DNA聚合酶的激活劑）。18、很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼一半乳糖苷酶N一端的146個(gè)氨基酸，稱為一肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ15基因型，它表達(dá)一半乳糖苷酶的C一端肽鏈。當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有一半乳糖苷酶活性，使特異的底物X一gal變?yōu)樗{(lán)色化合物，這就是所謂的一互補(bǔ)，而重組子由于基因插入使一肽基因失活，不能形成一互補(bǔ)，在含X一gal的平板上，含陽(yáng)性重組子的細(xì)菌為無(wú)色菌落或噬菌斑。19、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)。20、原理：基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法一致，都是應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過(guò)熒光或同位素檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的信號(hào)做出比較和檢測(cè)，從而得出所需要的信息。 生物學(xué)研究的意義： （1）用于繪制基因缺失圖譜和進(jìn)行基因表達(dá)分析； （2）用于基因突變研究； （3）用于病毒病原體的檢測(cè)和基因分型；（4）用于細(xì)菌檢測(cè)；（5）用于同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；（6）能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；（7）基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖；（8）用病人的可疑cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。21、管家基因是指所有類型組織細(xì)胞在任何時(shí)候都需要表達(dá)的基因。由于管家基因是生命活動(dòng)必需的基因，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，差異小，所以在基因芯片技術(shù)中根據(jù)各芯片的管家基因可以得出標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正；管家基因在所有的細(xì)胞中都有表達(dá)，因此有關(guān)管家基因的概念有助于分析差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，進(jìn)而進(jìn)行差異表達(dá)基因的克隆。通過(guò)管家基因，能比較不同樣本中某種mRNA的水平。在進(jìn)行基因分離時(shí)，可通過(guò)不同組織間基因的比較，扣除相同部分（管家基因）后得到差異表達(dá)基因，從而得到不同組織間基因表達(dá)。22、（1）用于鑒定啟動(dòng)子； （2）可以用以了解細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，便于分析基因的調(diào)節(jié)； （3）在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否成功23、基本步驟：組織與細(xì)胞的固定組織和細(xì)胞雜交前的預(yù)處理探針的選擇及標(biāo)記雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)。24、（1）RFLP標(biāo)記 DNA某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長(zhǎng)度隨之發(fā)生變化。這種變化引起的多態(tài)現(xiàn)象即為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。對(duì)RFLP的檢測(cè)主要是用southern雜交的方法進(jìn)行，即利用限制酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之雜交，通過(guò)發(fā)射自影或非同位素顯色技術(shù)來(lái)揭示DNA的多態(tài)性。 （2）RAPD標(biāo)記 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，用隨機(jī)短引物（人工合成的六核苷酸）進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)可用于對(duì)任何未知基因研究。