酵母菌細(xì)胞融合-實(shí)驗(yàn)操作.doc

酵母菌細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)酵母菌原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)，為了解酵母菌為材料的外源基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)奠定基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母菌如釀酒酵母，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究中有很大作用，尤其是近些年來，隨著科技的進(jìn)步，酵母菌的遺傳操作如轉(zhuǎn)化、基因克隆和外源基因在酵母受體中的表達(dá)等技術(shù)都有了突破性的進(jìn)展。作為受體系統(tǒng)的酵母菌原生質(zhì)體在這些技術(shù)中有獨(dú)特的地位。這種經(jīng)溶菌酶處理脫壁后的細(xì)胞（脫壁不完全者稱原生質(zhì)球）既可以作為不同種屬間細(xì)胞融合的母體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器等大結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，又可作為外源基因轉(zhuǎn)移的受體，大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率。這些新技術(shù)不僅促進(jìn)了酵母菌遺傳學(xué)的發(fā)展，而且很多已應(yīng)用到構(gòu)建新的釀酒業(yè)酵母。本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母為材料，進(jìn)行原生質(zhì)體的分離制備和再生。酵母菌原生質(zhì)體的制備一般采用蝸牛酶、酵母溶菌酶或其它細(xì)胞壁溶解酶類。分離制備過程受許多因素的影響，如不同菌株的生長期、細(xì)胞濃度、溶菌酶類型和用量、處理時間和溫度等。所以整個實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)應(yīng)綜合考慮各種因素，才能獲得較好的效果。分離制備的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時，可以再生出細(xì)胞壁而恢復(fù)完整細(xì)胞狀態(tài)，即完成再生過程，這也是以原生質(zhì)體為受體的所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)最終能實(shí)現(xiàn)的一個關(guān)鍵步驟。在原生質(zhì)體制備中，應(yīng)選用適當(dāng)生長時期的菌體作為分離的材料。一般來說，對數(shù)生長期的酵母菌細(xì)胞易脫壁，靜止期細(xì)胞較難甚至不可能形成原生質(zhì)體。而不同菌種的生長對數(shù)期也略有差異，一般在1216小時之間（108細(xì)胞/ml）。制成的原生質(zhì)體懸浮液在0條件下保存46小時，不會影響融合再生率。所以欲進(jìn)行原生質(zhì)體融合，應(yīng)在制備后盡快進(jìn)行，以免時間過長，影響再生。分離過程中采用的-巰基乙醇可使細(xì)胞壁組分中的二硫鍵破壞，使蝸牛酶易于分解細(xì)胞壁。此外，滲透壓的調(diào)節(jié)可用0.8mol/L山梨醇、16蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。三、實(shí)驗(yàn)材料菌種：釀酒酵母SP-48、L-酵母：器具和試劑：恒溫?fù)u床、恒溫水浴、顯微鏡、臺式離心機(jī)、培養(yǎng)皿、試管、過濾滅菌裝置。液體YEPD：1000 ml 分裝四瓶（蛋白胨 2% 葡萄糖 2% 酵母浸膏 1% 自然pH 值）高滲YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂PB：2000 ml 檸檬酸：21克溶于1000毫升蒸餾水中 磷酸氫二鈉：143.256克溶于2000毫升蒸餾水中 取檸檬酸溶液678毫升 取磷酸氫二鈉溶液1322毫升 混合得2000毫升PB高滲PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克PEG-CaCl：聚乙二醇6000 40克 加入至100毫升高滲PB溶液中 使氯化鈣為0.4mol/l0.2%-巰基乙醇，無菌過濾器過濾.蝸牛酶液:1.5% 蝸牛酶用高滲PB緩沖溶液配制，無菌過濾器過濾.淀粉YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂（蛋白胨 2% 淀粉 2% 酵母浸膏 1% 自然pH 值）四、實(shí)驗(yàn)步驟整個分離制備和再生過程于無菌條件下操作。1.原生質(zhì)體的制備:(1) 菌種培養(yǎng):將酵母菌sp-48和L-酵母活化轉(zhuǎn)接新鮮斜面.自新鮮斜面分別挑取一環(huán)sp-48酵母和L-酵母轉(zhuǎn)接入250ml完全培養(yǎng)基中,30振蕩培養(yǎng)16-18h.(2) 收集細(xì)胞：取上述對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5ml,4000r/min離心10min，棄上清液.檸檬酸-磷酸緩沖液(PB)洗兩次，收集菌體(3) 預(yù)處理：取5ml0.2%-巰基乙醇PB緩沖液于裝有酵母泥的離心管中,30保溫10min,以1000轉(zhuǎn)/分離心10min,傾去上清液(4) 脫壁：在裝有處理過的SP48,L-酵母菌泥的兩只離心管中，分別加入5ml 1.5%蝸牛酶-PB溶液置30水浴中處理,取樣鏡檢,當(dāng) 80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體 2500r/min離心10min,用PB液離心洗滌，洗去酶液，加入4ml高滲PB液制成106/ml以上的原生質(zhì)體液,測定形成率原生質(zhì)體形成率=(酶解前菌落計(jì)數(shù)-未形成原生質(zhì)體菌數(shù))/ 酶解前菌落計(jì)數(shù)100%2.原生質(zhì)體再生率測定 : 將制備的原生質(zhì)體稀釋到2-3107個/ml,各取1ml原生質(zhì)體液用PB液稀釋后涂布在高滲完全培養(yǎng)基（YEPDS）和完全培養(yǎng)基(YEPD).30培養(yǎng)2天計(jì)算菌落數(shù),酶解前的菌液直接用無菌水稀釋涂布完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后計(jì)算菌數(shù)。原生質(zhì)體再生率3.原生質(zhì)體的融合:(1). 將L-酵母的原生質(zhì)體用紫外線滅活2分鐘,在黑暗中保存20分鐘, 2500rad/min離心10min,用2ml高緩沖液懸浮.(2). 將兩菌的原生質(zhì)體懸浮液混合,離心,向沉淀中加入3mlPEG-CaCl2,振蕩均勻, 30處理20min, 鏡檢并觀察融合情況.(3). 用高深緩沖液洗滌菌體沉淀, 2500rad/min離心10min.(4). 立即用高深緩沖液稀釋,取融合原菌液及10-1稀釋液各0.1ml菌液,涂布于再生培養(yǎng)基平板上.4.融合子的檢出: 將融合液涂布在加有0.01%的