植物組織培養(yǎng)實驗.doc

實驗一 植物組織培養(yǎng)實驗室的構造和功能一、目的要求：掌握如何組建植物組織培養(yǎng)實驗室，熟悉組培中設計的各種儀器設備和器皿用具。二、儀器與用具超凈工作臺、空調機、蒸餾水發(fā)生器、高壓滅菌鍋、低溫冰箱、普通冰箱、電磁爐、各種電子天平、pH儀器等設備，以及各種試驗器皿和器械用具等。三、方法步驟1.了解組織培養(yǎng)實驗室守則以及有關注意事項。2.掌握儀器設備和器皿用具的名稱與用途以及實驗室的構造。3.參觀組培實驗室的構建情況，包括準備室（化學實驗室）、緩沖室、無菌操作室（接種室）和培養(yǎng)室的設計要求，以及內部儀器設備的名稱及其作用。四.實驗報告1.將本次實驗內容整理成實驗報告2.設計一個植物組織培養(yǎng)實驗室的組建方案。實驗二 MS培養(yǎng)基母液的配制與保存一、目的要求通過MS培養(yǎng)基母液的配制與保存，掌握配制與保存培養(yǎng)基母液的基本技能。二、材料與用具配制MS培養(yǎng)基所需的藥品（見附表）。植物生長調節(jié)物質、各類天平、燒杯、容量瓶、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl、母液瓶、標簽、冰箱等。三、方法與步驟1.母液的配制(將MS母液配置表畫在黑板上，舉例講解母液的配制過程，包括稱量、溶解、定容三步，再將班級分為五個組進行配制)2.植物生長調節(jié)物質母液的配制稱量：用微量0.001或0.0001的分析天平或由電子天平準確稱取生長素（或細胞分裂素）50mg。溶解：生長素（如IAA、IBA、NAA、2、4-D）可用少量的0.1mol/LNaOH溶解，細胞分裂素（如KT、ZT、6-BA）可用0.1mol/L的HCl加熱溶解。定溶：將溶解的植物生長調節(jié)物質倒入50ml容量瓶，用水沖洗小燒杯數(shù)次，最后加蒸餾水定容至50ml，配制成濃度為1mg/ml的溶液。3.母液的保存裝瓶：將配好的母液分別倒入瓶中，貼好標簽，注明培養(yǎng)基名稱、母液號、配制倍數(shù)（或濃度）以及配制日期。儲藏：將母液瓶儲放在4冰箱內備用。四、實驗報告將本次實驗內容整理成實驗報告（敘述母液配置過程）。附表 MS培養(yǎng)基母液配制（單位：mg）母液成分規(guī)定量擴大倍數(shù)稱取量母液體積(ml)配1L培養(yǎng)基吸取量（ml）編號種類1大量元素KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4190016503701701010101019000165003700170010001002鈣鹽CaCl233210332010001003微量元素MnSO4.H2OZnSO4.7H2OH3BO3KINaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16.98.66.20.830.250.0250.02510010010010010010010084543031041.512.51.251.25500104鐵鹽Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.334.510010018651725500105維生素甘氨酸鹽酸硫胺素(VB1)鹽酸吡哆醇(VB6)煙酸肌醇2.00.10.50.510010010010010010010052525500050010注意：配制前核實各種化學成分的含水量實驗三 固體培養(yǎng)基的配制一、目的要求通過MS固體培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的基本技能。二、材料與用具MS培養(yǎng)基母液、植物生長調節(jié)劑、瓊脂、蔗糖、蒸餾水、移液管、量筒、容量瓶、電磁爐、酸度計、0.1mol/LNaOH(HCl)、培養(yǎng)瓶、記號筆等。三、方法與步驟1按母液順序和規(guī)定量，用量筒和移液管提取母液，放入1000ml的容量瓶中，MS1-100ml、MS2-100ml、MS3-10ml、MS4-10ml、MS5-10ml。2.加入植物生長調節(jié)劑，加入的種類與數(shù)量，視培養(yǎng)物不同而異，有時也可不加。3.加入蔗糖若干，溶解定容至1000ml，再放入9g瓊脂。4.調整PH值，經酸度計測試，用0.1mol/LNaOH（HCl）把培養(yǎng)基PH值調整至5.8-6.0。5.在電磁爐上加熱溶液，并不斷攪拌，使瓊脂不斷熔化。6.分裝培養(yǎng)基，把配好的培養(yǎng)基分裝到50-150ml的培養(yǎng)瓶中，分裝后立即加蓋封口，用記號筆注明培養(yǎng)基名稱。四、實驗內容配制火鶴培養(yǎng)基：MS+NAA0.2 mg/mL +蔗糖30g+瓊脂9g，PH5.8-6.0。五、實驗報告根據(jù)實驗內容總結出固體培養(yǎng)基配制的具體過程。實驗四 培養(yǎng)基和培養(yǎng)用具的滅菌一、目的要求通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)用具的滅菌，掌握高壓滅菌和干熱滅菌的一般操作技術。二、材料與用具培養(yǎng)皿、三角瓶、注有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、裝有蒸餾水的玻璃瓶、牛皮紙、鑷子、剪刀等金屬器械、高壓滅菌器、烘箱等。三、方法與步驟1.高壓滅菌鍋：洗滌包扎裝水（需淹沒電熱絲）滅菌：把需滅菌的物品放入高壓滅菌鍋內，當壓力達120kpa，鍋內的溫度為121時，保持30min。關掉開關，打開放氣閥，讓滅菌鍋自然冷卻。儲藏：待滅菌鍋內的氣體放盡，把物品從滅菌器中取出，培養(yǎng)基要放置在溫度低于30，沒有強光照射的專用柜中備用。2.干熱滅菌洗滌滅菌：把洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在150溫度下，干熱滅菌1h或120溫度下2h滅菌完畢，待冷卻后取出。四、實驗報告高壓滅菌前后應注意哪些事項？實驗五 無菌操作技術一、目的要求通過在超凈工作臺上進行無菌操作訓練，初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術。二、材料與用具超凈工作臺、70%的酒精、95%的酒精、盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、接種器械（解剖刀、剪刀、鑷子等）、酒精等、培養(yǎng)材料（根、莖、葉或種子等）、0.1%的升汞或“84”滅菌液、無菌水等。三、方法步驟1.用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅菌過的專用實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。2.打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射20min。3.操作前10min使超凈工作臺處于工作狀態(tài)，讓過濾室空氣吹拂工作臺面和四周的臺壁。4.照射20min后，關閉紫外燈。5.用70%的酒精擦拭工作臺和雙手。6.用蘸有70%酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放入工作臺。7.用解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上。8.把培養(yǎng)材料放進70%的酒精中浸泡30s,再用0.1%的升汞（氯化汞，HgCl2）中浸泡10min,或在“84”滅菌液（經無菌水1：1的稀釋）中浸泡10-15min,浸泡時可進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸，然后用無菌水沖洗4-5次。9.用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到，打開瓶口。10.取下接種器械，在火焰上滅菌。11.將滅菌后的培養(yǎng)材料在無菌的培養(yǎng)皿中切割成11cm大小，然后放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。操作期間應經常用70%酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在95%的酒精中浸泡和在火焰上滅菌。12.接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。四、實驗報告1.將本次實驗內容整理成實驗報告。2.接種一周后，觀察接種材料的污染情況，并分析污染原因。實驗六 火鶴的增殖培養(yǎng)一、目的要求通過學習火鶴的組織培養(yǎng)的基本方法和步驟，熟練掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術。二、材料與用具1.材料：火鶴試管無菌苗2.儀器：超凈工作臺、解剖刀、長把鑷子、無菌培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等3.培養(yǎng)基：MS+NAA0.2mg/mL+蔗糖30g+瓊脂9g PH：5.8-6.0三、方法步驟1.選取生長健壯，長約5cm以上的火鶴試管苗。2.在超凈工作臺上用蘸有70%的酒精擦拭雙手和工作臺以及裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。3.在酒精燈火焰下燒培養(yǎng)瓶瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到。4.打開長有火鶴的培養(yǎng)瓶瓶蓋，用長把鑷子取出火鶴試管苗，放入滅過菌的培養(yǎng)皿中。5.用手術刀將火鶴幼苗切成1.5cm長的小段，每段帶有1-2片幼葉。6.蓋好瓶蓋，注明品種及接種日期，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。7.定期觀察植株的生長、分化情況。四、實驗報告通過火鶴莖段培養(yǎng)的基本方法和步驟，制定出杜鵑的微扦插繁殖方案。實驗七 杜鵑莖段的微扦插繁殖一、目的要求通過學習杜鵑莖段培養(yǎng)的基本方法和步驟，學會和掌握試管微扦插繁殖的基本技術。二、材料與用具杜鵑試管無菌苗、超凈工作臺、解剖刀、長把鑷子、無菌培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)基：DJ+NAA0.05mg/mL+ZT0.5 mg/Ml+蔗糖30g+瓊脂9g PH：5.0三、方法步驟1.選取生長健壯，長約5cm以上的杜鵑試管苗。2.在超凈工作臺上用蘸有70%的酒精擦拭雙手和工作臺以及裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。3.在酒精燈火焰下燒培養(yǎng)瓶瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到。4.打開長有杜鵑的培養(yǎng)瓶瓶蓋，用長把鑷子取出杜鵑試管苗，放入滅過菌的培養(yǎng)皿中。5.用手術刀將杜鵑幼苗切成1.5cm長的小段，每段帶有1-2片幼葉。6.將切好的莖段插入培養(yǎng)基中，保持莖段高度一致。7.蓋好瓶蓋，注明品種及接種日期，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。8.定期觀察植株的生長、分化情況。四、實驗報告將本次實驗內容整理成實驗報告，并觀察記錄杜鵑的生長分化情況。實驗八 蝴蝶蘭原球莖的增殖培養(yǎng)一、目的要求通過對蝴蝶蘭原球莖增殖的繼代培養(yǎng)的操作，掌握蝴蝶蘭原球莖增殖的基本技術和基本方法。二、材料與用具1.材料：培養(yǎng)瓶中蝴蝶蘭原球莖。2.儀器：超凈工作臺、無菌培養(yǎng)皿、長把鑷子、解剖刀等。3.培養(yǎng)基： 1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖20g+瓊脂9g PH:5.8 KC+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g+瓊脂9g PH:5.8三、方法步驟在超凈工作臺中，用長把鑷子將蝴蝶蘭的原球莖取出，放在無菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀將其切成0.5cm左右的小塊，移入上述兩種培養(yǎng)基中，每瓶放入20塊左右，蓋好瓶塞，注明品種名稱、接種日期、接種人，最后放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定期觀察其生長及增值情況。四、實驗報告 敘述上述兩種培養(yǎng)基的制作過程及原球莖繼代增值的操作要點。實驗九 蝴蝶蘭的定植與移栽一、目的要求熟練掌握蝴蝶蘭定植與移栽的操作步驟。二、材料與用具蝴蝶蘭組培苗、長把鑷子、解剖刀、培養(yǎng)基、草炭、塑料小缽等。三、方法與步驟 1.定植：在超凈無菌的條件下，用鑷子將蝴蝶蘭的組培苗取出，組培苗大小不一，將打的組培