流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的合理設(shè)計(jì)與篩選.doc

流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的合理設(shè)計(jì)與篩選摘 要流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，每年影響數(shù)百萬人的健康，造成比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題。但是到目前為止，人類對(duì)流感病毒一直缺乏安全有效的控制手段，這使得抗流感病毒藥物研究成為當(dāng)前藥學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。隨著病毒學(xué)研究的進(jìn)展，對(duì)流感病毒復(fù)制和感染過程的機(jī)理研究取得了重大的突破，在此基礎(chǔ)上提出了一些可作為抗流感藥物研究的靶標(biāo)，比如：血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白MZ以及核酸內(nèi)切酶等。本文以其中的一種靶標(biāo)化合物即神經(jīng)氨酸酶為研究對(duì)象，對(duì)其抑制劑做出合理的設(shè)計(jì)及篩選，為研究與合襯抗流感病毒的藥物提供一個(gè)較為合理的方向。關(guān)鍵詞：流感；流感病毒；神經(jīng)氨酸酶；定量構(gòu)效關(guān)系1、立項(xiàng)依據(jù)1.1、流感的危害以及防治現(xiàn)狀流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率高等特點(diǎn)，在兒童、老人及高危人群中的死亡率很高。流感感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的心、腎等多種臟器衰竭并能導(dǎo)致死亡。流感可以通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，人員和車輛往來是傳播本病的重要因素。有數(shù)據(jù)表明，每次流感爆發(fā)期會(huì)使全球人口的近10%感染致病。僅在20世紀(jì)，流感的大流行就有三次，每次均使25%35%的人感染致病，死亡率超過2%。迄今為止，世界上已發(fā)生過五次流感的大流行和若干次小流行，造成數(shù)十億人發(fā)病，數(shù)千萬人死亡，嚴(yán)重影響了人們的生活和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。而預(yù)防和治療流感給人們造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并導(dǎo)致勞動(dòng)力的下降和人力資源的緊張。然而面對(duì)己對(duì)人類健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重破壞的流行性感冒，人類卻一直缺乏有效的手段。1.2、有神經(jīng)氨酸酶抑制劑預(yù)防與治療流感的現(xiàn)狀NA抑制劑是目前探索抗流感化學(xué)治療藥物研究中取得的突破性進(jìn)展。它可以有效地阻斷流感病毒的復(fù)制過程。與其它類型的抗流感病毒藥物相比，NA抑制劑具有更高的療效及更好的安全性和耐受性，并對(duì)所有的流感病毒亞型均有效，也很少出現(xiàn)病毒的抗藥性。目前上市的NA抑制劑有兩種:葛蘭素公司得到Relenza羅氏公司的Tamiful，此外，還有一些神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物正在開發(fā)中，如BioCryst公司的BANA-113、BANA-206；Abbott公司的A-315675等。由此可見，由于神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物所具有的獨(dú)特機(jī)制及療效，它們己成為世界各大醫(yī)藥公司競相研究的熱點(diǎn)。1.3、立項(xiàng)意義作為一類新型的抗流感病毒藥物，NA抑制劑較金剛烷胺類藥物抗病毒譜更廣、耐藥率低且不良反應(yīng)少，顯示出較好的臨床療效早期治療不僅能減輕癥狀、縮短病程并促使患者迅速恢復(fù)，而且能夠減少流感的并發(fā)癥和相關(guān)抗生素的應(yīng)用。Oseltarivir對(duì)于流感的預(yù)防有確切的作用，尤其是在患者不能接種疫苗、對(duì)疫苗無反應(yīng)或接種疫苗無效時(shí)，其預(yù)防作用更為重要。綜上所述，流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑是繼金剛烷胺/金剛乙胺和病毒疫苗之后的一類具有全新作用機(jī)制的流感預(yù)防與治療藥物。它可同時(shí)抑制A型和B型流感病毒，不易引起抗藥性且耐受性好流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的開發(fā)成功是目前探索抗流感化學(xué)治療藥物研究中取得的突破性進(jìn)展。研究證實(shí)它能抑制流感病毒的復(fù)制，降低其致病性，可減輕癥狀、縮短病程、減少并發(fā)癥，并且毒性較低?？梢灶A(yù)計(jì)隨著它在臨床上的推廣使用，將極大地減輕流感對(duì)人們健康的威脅。因此流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑作為一類新穎的抗流感病毒藥物將會(huì)具有更為廣闊的發(fā)展前景。2、項(xiàng)目研究內(nèi)容2.1、神經(jīng)氨酸酶抑制劑的設(shè)計(jì)思路2.1.1、 經(jīng)氨酸酶與底物作用機(jī)理1974年，Meindl等人發(fā)現(xiàn)NA催化反應(yīng)的過渡態(tài)類似物Neu5Ac2en可以等效地抑制病毒和非病毒的神經(jīng)氨酸酶的活性，因而推斷神經(jīng)氨酸酶的活性位點(diǎn)具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。對(duì)神經(jīng)氨酸酶與-Neu5Ac復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，底物在結(jié)合時(shí)，可以由能量上占優(yōu)勢的椅式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榕で拇綐?gòu)象，這種構(gòu)象的改變部分是由于底物的梭基與NA活性位點(diǎn)的三個(gè)精氨酸殘基形成鹽橋而導(dǎo)致的。同位素研究和分子模擬研究表明，NA對(duì)底物的催化作用主要是通過形成酶穩(wěn)定的唾液酸氧鎓離子中間體1。中間體1再與水分子發(fā)生立體選擇性反應(yīng)，優(yōu)先生成-Neu5Ac， -Neu5Ac再轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)力學(xué)更穩(wěn)定的異構(gòu)體-Neu5Ac。神經(jīng)氨酸酶的復(fù)合物共價(jià)鍵的形成是在Neu5Ac2en和NA高度保守的位于N-乙酰神經(jīng)氨酸C-2下方的酪氨酸殘基之間；另外，Neu5Ac2en及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)很多神經(jīng)氨酸有較好的抑制活性的事實(shí)也有力的支持了平面氧鎓離子過渡態(tài)的設(shè)想。2.1.2、 合物的合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表明2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸具有一定的NA抑制活性，其IC50分別為358umoL和21。3umoL，可以作為先導(dǎo)化合物對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。以這兩個(gè)化合物作為NA抑制劑設(shè)計(jì)、合成的先導(dǎo)化合物，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)對(duì)齊進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以得到NA抑制活性增強(qiáng)的噻唑和噻唑烷類NA抑制劑，作為具有全新母核的NA抑制劑的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。2.2、 感病毒神經(jīng)氨酸酶的生物活性評(píng)價(jià)通過大量的實(shí)驗(yàn)表明選擇流感病毒神經(jīng)氨酸酶作為抗流感病毒藥物的靶點(diǎn)，根據(jù)流感病毒神經(jīng)氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)及與其活性位點(diǎn)作用的抑制劑的藥效團(tuán)模型，結(jié)合體外對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑活性的初步篩選，確定2-氨基噻唑-4-乙酸乙醋和2-苯基-4-噻唑烷酸作為先導(dǎo)化合物，并利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)、合成了噻唑類和噻唑烷類兩類新型的小分子流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。所設(shè)計(jì)的這兩種化合物均具有一定的神經(jīng)氨酸酶一直記得活性，并且絕大多數(shù)的化合物對(duì)NA的抑制活性都比先導(dǎo)化合物有所增強(qiáng)；其中第一系列-噻唑類NAIs中活性最好的化合物為L4d，其活性比陽性對(duì)照弱20倍；而第二系列-噻唑烷類NAIs中活性最好的化合物為Y4f，其活性比陽性對(duì)照弱7倍。這些結(jié)果說明，噻唑和噻唑烷類都可以作為新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑的全新母核，并且在以后研究中，可以使用發(fā)現(xiàn)的這些化合物作為抗流感病毒先導(dǎo)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，來發(fā)現(xiàn)活性更好的、可作為抗流感藥物開發(fā)的新型流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。2.3、目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系研究2.3.1、 比較分子場與定量構(gòu)效關(guān)系研究本研究通過COMFA方法來獲得流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的三維定量構(gòu)效關(guān)系，應(yīng)用Surflex-Dock對(duì)接方法與構(gòu)象系統(tǒng)搜索確定神經(jīng)氨酸酶抑制劑的可能活性構(gòu)象，并以此活性構(gòu)象為模板構(gòu)建小分子化合物的三維結(jié)構(gòu)，最后運(yùn)用COMFA方法對(duì)其進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系研究。2.3.2、 板化合物的選擇及構(gòu)象確定確定抑制劑的活性構(gòu)象是COMFA模型建立的關(guān)鍵步驟，根據(jù)3D-QSAR的一般規(guī)律，具有手性碳原子的化合物應(yīng)分別用單一的光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分子建模。本研究中，選擇產(chǎn)物中占據(jù)大部分的Yanti進(jìn)行分子建模。在設(shè)定的分子對(duì)接條件下，使用Surflex-Dock化合物Y4fanti與2HU4的活性中心進(jìn)行了對(duì)接選取對(duì)接構(gòu)象作為化合物的藥效構(gòu)象，并作為分子疊合的模板。進(jìn)行QSAR研究的化合物分子以此構(gòu)象為模板建立化合物庫，并進(jìn)行基于公共子結(jié)構(gòu)的分子疊合。2.3.3、 化合物的COMFA模建使用SYBYL軟件包中Edit/Build 模塊中sketch構(gòu)建了模板化合物Y4fanti，優(yōu)化過程中采用Powell能量梯度法，Tripos力場，迭代1000次，能量收斂限定為2。05Kcal/mol。A。定義Y4fanti中與R1、R2相連鍵作為可旋轉(zhuǎn)鍵，每次以15角遞增旋轉(zhuǎn)，選擇Compute energy check box為ON，設(shè)定其OFF的最大能量差異值為1000 Kcal/mol，其他值均為系統(tǒng)默認(rèn)值，對(duì)結(jié)果的能量值進(jìn)行Histogram分析，選擇能量分布最為集中的構(gòu)象，作為可能的藥效構(gòu)象模版分子Y4fanti。以Y4fanti作為模板，通過修飾相應(yīng)的原子或集團(tuán)分別構(gòu)建了其他化合物，并通過能量優(yōu)化得到三維結(jié)構(gòu)。2.4、 化合物的活性篩選本研究使用商品化的神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒，以有熒光特性的化合物為酶促反應(yīng)底物，建立了適合篩選小分子神經(jīng)氨酸酶抑制劑的熒光分析法。初步的體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性測試結(jié)果表明，所合成的化合物均具有一定的神經(jīng)氨酸酶抑制活性，部分化合物活性達(dá)到林M級(jí)，雖然不及陽性對(duì)照oseltamivir，但可以作為先導(dǎo)化合物繼續(xù)進(jìn)行研究開發(fā)。3、總結(jié)與展望有效的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究主要基于以下幾個(gè)方面:對(duì)酶作用機(jī)理的了解;流感病毒神經(jīng)氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)研究得到的信息以及組合化學(xué)等合理藥物設(shè)計(jì)技術(shù)的發(fā)展已有神經(jīng)氨酸酶抑制劑根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為唾液酸類、苯甲酸類、環(huán)己烯類、呋喃類、環(huán)戊烷類、吡咯烷類、多聚體類及其他類。通過分子對(duì)接，探討了兩個(gè)系列化合物與神經(jīng)氨酸酶活性區(qū)域的作用模式;采用比較分子力場分析(COMFA)方法構(gòu)建了噻唑烷類化合物的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型，結(jié)合模型給出的等勢線圖對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了探討，所構(gòu)建的COMFA模型具有較好的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2和預(yù)測能力，對(duì)于新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。而不足之處在于，所發(fā)現(xiàn)的噻唑烷類化合物是以一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的形式存在，還沒有對(duì)其進(jìn)行分離，并且由于計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接發(fā)現(xiàn)兩者的活性有所差別，若將這一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體分離，將可能發(fā)現(xiàn)活性比已測活性更好的化合物;另外，化合物的病毒活性測試也需完善。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑是一類新穎的抗流感病毒藥物，是進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)、取得成功的典型實(shí)例。流感病毒NA抑制劑對(duì)流感病毒的特性選擇性高、抑制活性好!細(xì)胞毒性小，在臨床研究中表現(xiàn)出療效顯著!患者耐受性好、不良反應(yīng)小，并不易出現(xiàn)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此流感病毒NA抑制劑作為一類新穎的抗流感病毒將會(huì)具有更為廣闊的發(fā)展前景。參考文獻(xiàn)1 鄭培忠,沈建英.