細(xì)胞因子檢測(cè)ppt課件.ppt

細(xì)胞因子的檢測(cè)方法 細(xì)胞因子 一類由細(xì)胞分泌 具有多種功能的高活性小分子蛋白 參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等 白細(xì)胞介素 interleukin IL 干擾素 interferon IFN 腫瘤壞死因子 tumornecrosisfactor TNF 集落刺激因子 colonystimulatingfactor CSF 生長(zhǎng)因子 growthfactor GF 趨化因子 chemokine 細(xì)胞因子的檢測(cè)方法 待檢樣品 細(xì)胞上清 指示細(xì)胞 CTLL 2 IL 2依賴細(xì)胞系 按不同稀釋度加入 37 C 16 20小時(shí) 加入3HTdR 1 5 Ci 37 C 4 6小時(shí) 收集細(xì)胞 測(cè)定 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn) 待檢樣品 細(xì)胞上清 IFN 指示細(xì)胞 wish 按不同稀釋度加入 37 C 4小時(shí) 37 C 24 48小時(shí) 棄取上清 加入VSV 水泡性口炎病毒 觀察細(xì)胞病變 鏡檢或比色 UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferation SDM SDM Glivec CalculationofProliferativeIndex P I CFSE 43210 TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments CellProliferationELISAKit BrdU colorimetric Chromium 51 51Cr releaseassays 計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞 趨化因子 細(xì)胞 趨化實(shí)驗(yàn)示意圖 微孔濾膜 用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原 使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng) 使微量的 不可見的反應(yīng)成為可見的或可測(cè)定的 免疫標(biāo)記技術(shù) 高通量細(xì)胞因子檢測(cè)CBA CytometricBeadArray 是一種微珠多用途檢測(cè)分析技術(shù) 它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液 EDTA血漿 血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量 其采用夾心法分析策略 與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比 此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo) 用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測(cè)樣本的濃度 此分析方法不受樣本量的限制 而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù) Cytokinenetwork CBA原理示意圖 LabInvest2003 83 1131 1146 cytokinebeadarrays CBA ELISPOT 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體 在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)斑點(diǎn) spot 是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域 代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞 它可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反應(yīng)能力 優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高 是目前為止最靈敏的檢測(cè)技術(shù) 可檢測(cè)到百萬分之一陽性細(xì)胞率 單細(xì)胞水平 活細(xì)胞功能檢測(cè) 操作簡(jiǎn)便 可進(jìn)行高通量篩選 1 特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部 2 封閉能結(jié)合單抗的其他部位 3 加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng) 陽性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲 4 移出細(xì)胞 洗滌 5 加入生物素標(biāo)記的二抗 6 加入酶標(biāo)鏈霉親和素 7 加入顯色底物 在酶的催化分解下 產(chǎn)生不可溶的色素 就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn) 8 斑點(diǎn)計(jì)數(shù) 可人工計(jì)數(shù) 也可用自動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù) 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果分析 ELISPOT 應(yīng)用 移植研究 allograftrejection疫苗開發(fā) 亦可評(píng)估疫苗效力 或是疫苗注射路徑影響Th0 Th1 Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析自體免疫研究 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究癌癥研究 腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用過敏機(jī)制探討 IL 4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換 其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究傳染疾病研究 Lymedisease Chlamydiainfections Helicobacterpyloriinfections HIVinfections multiplesclerosis 等 Medium PHA Peptide1 Peptide21 Peptide47 GzB HIV peptiderecallpatientB IFN g HIV peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN gandGzB KleenT etal AIDS2003 18 383 392 ELISPOT和ELISA的區(qū)別 ELISPOT法源自ELISA 又突破傳統(tǒng)ELISA法 是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展 它們最大的不同 1 ELISA通過顯色反應(yīng) 在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度 與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量 整體水平 ELISPOT也是通過顯色反應(yīng) 在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn) 可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù) 1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞 從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率 單細(xì)胞水平 2 ELISPOT比ELISA更敏感 ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域 自身免疫診斷和預(yù)后分析 器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè) 過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測(cè) 疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)等 胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè) LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF 的測(cè)定R1 淋巴細(xì)胞 R2 單核細(xì)胞 TNF 的誘生和檢測(cè) 主要由單核 巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生 能使殺傷腫瘤細(xì)胞 THP 1 人單核細(xì)胞系 在LPS 脂多糖 刺激下可分泌TNF L929 小鼠成纖維細(xì)胞 可被THP 1分泌的TNF 殺傷 且細(xì)胞的死亡率與TNF 活性成正比 四甲基偶氮唑鹽 MTT 在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶的作用下 被還原呈藍(lán)黑色的MTT 甲瓚 離心收集培養(yǎng)上清 加入 加入四甲基偶氮唑鹽