茶多酚大孔樹脂吸附分離性能的研究.doc

茶多酚大孔樹脂吸附分離性能的研究1 材料與儀器1.1 材料：茶葉( 有限公司) (經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物教研室鑒定);1.2試劑及藥品：茶多酚對照品(批號： ，中國藥品生物制品檢定所提供);大孔樹脂LX-X由西安藍(lán)曉科技開發(fā)有限公司提供。其它試劑均為分析純。1.3 儀器：島津LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng)：包括LC-20A型高壓恒流泵、SPD-20A檢測器和LC Solution工作站；UV -762紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(HHS21-6C，上海醫(yī)療器械五廠);電子分析天平(FC204，上海精科實業(yè)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R50 2B (上海亞蓉生化儀器廠);SHZ-D()循環(huán)水式真空泵；索式提取器；電熱鼓風(fēng)干燥箱;植物粉碎機(jī)(FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司)；層析柱(40 mm50 cm)。2 方法2.1茶多酚的定性、定量檢測2.1.1茶多酚的薄層定性檢測硅膠薄板制作按1：3的比例稱取硅膠G和0.5%的CMC-NA，研磨約30min后，平鋪到1020cm的洗凈烘干的玻璃平板上，鋪勻，隔夜，自然晾干。展開劑配制按氯仿：乙酸乙酯：正丁醇：甲酸 = 2：1.3：0.4：0.3的比例配置（約需80ml）層析活化薄板：105，30min。點樣：所用液體為留取的待測液，點樣量為25uL。飽和：在層析缸內(nèi)扣放入一培養(yǎng)皿，再將薄板放在上面,板子不接觸層析液，在其蒸汽中飽和30min以上。層析：將板子放入展開劑中展開，待展開劑前沿距板子上端1.5cm取出，放入通風(fēng)廚晾干。結(jié)果觀察及分析:（肉眼觀察）2.1.2茶多酚的定量測定酒石酸亞鐵分光光度法1利用茶葉中的多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成藍(lán)色絡(luò)合物的性質(zhì)，將茶葉水提液及樹脂法、有機(jī)溶劑法所得產(chǎn)品配制成一定濃度的溶液，使其與酒石酸亞鐵溶液在一定的介質(zhì)條件中反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物，通過測定絡(luò)合物的吸光光度值，利用公式便可以算出茶葉及各產(chǎn)品中茶多分的含量。儀器及用具實驗室常規(guī)儀器及感量0.0001的分析天平、分光光度計2.1.2.1試劑和溶液1） 酒石酸亞鐵溶液：準(zhǔn)確稱量0.500克硫酸亞鐵（FeSO47H2O）和2.500g酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa4H2O），用水溶解并定容至500ml。（溶液低溫、避光保存，有效期一個月）2） PH=7.5的磷酸鹽緩沖液1/15M磷酸氫二鈉：稱取11.6885g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O），用水溶解并定溶至500ml。1/15M磷酸二氫鉀：稱取4.5390g磷酸二氫鉀（KH2PO412H2O），用水溶解并定溶至500ml。取上述1/5磷酸氫二鈉溶液85ml和1/15M磷酸二氫鉀溶液15ml，混勻即可。2.1.2.2操作方法試樣制備：稱取3g茶葉，研碎后，將其放置于500ml的錐形瓶中，加沸蒸餾水450ml，立即移入沸水浴中，浸提45min，浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，濾液移入500ml容量瓶中，殘渣用少量熱蒸餾水洗滌23次，并將濾液移入上述容量瓶中，冷卻后用蒸餾水稀釋至刻度。稱取多酚產(chǎn)品各0.025g，用甲醇溶解并定容至25ml，溶液濃度為0.1%。測定步驟：a. 吸取上述試樣液各1ml，分別加入已標(biāo)號的25ml容量瓶中，然后各加入4ml水，5ml酒石酸亞鐵溶液，充分混勻后用PH=7.5磷酸鹽緩沖液定溶至計刻度線。b. 不加試樣液，配制試劑空白溶液，以作參考。c. 用10ml比色杯，在波長540nm處測定各溶液的吸光度A。測定結(jié)果如表1：2.1.2.3結(jié)果計算茶葉及茶多酚產(chǎn)品中的茶多酚含量，以干物質(zhì)量百分率表示：計算公式為： A1.9572L1茶多酚（%）= 100 1000L2Mm 其中： L1試劑的總量（ml） L2測定時用液量（ml） M試樣的質(zhì)量(g) m試樣干物質(zhì)含量百分率（%） A試樣的吸光度 1.957用10mm比色杯，當(dāng)吸光度等于0.50時，每毫升茶湯中茶多酚相當(dāng)于1.957mg。 0.2391.957225茶多酚產(chǎn)品（%）= 100%=93.54% 100010.025 2.1.2.4結(jié)果討論2.1.3茶多酚的定量測定酒石酸亞鐵分光光度法21 原理利用茶葉中的多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成藍(lán)色絡(luò)合物的性質(zhì)，將茶葉水提液及三種提取法所得的產(chǎn)品配制成一定濃度的溶液，使其與酒石酸亞鐵溶液在一定的介質(zhì)條件中反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物。通過測定此絡(luò)合物的吸光度值，利用由沒食子酸乙醋作為對照品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線便可計算出茶葉及各產(chǎn)品中茶多酚的含量。根據(jù)茶多酚主要成份是表兒茶素和表沒食子兒茶素類。兒茶素結(jié)構(gòu)的羥基在苯核上的位置不同，既有鄰苯二酚基，又有連苯三酚基，還有沒食子酸形成酯型結(jié)合物。而酒石酸亞鐵主要是與茶多酚中的鄰位羥基和連位羥基功能團(tuán)顯色，而對間位羥基和單羥基不顯色。以沒食子酸丙醋為測定標(biāo)準(zhǔn)，它具有鄰位酚性羥基和連位酚性羥基的特點，又具有羥丙酯基，更能代表兒茶素為多種酚類的實際情況。在pH7.5波長540nm, lcm比色皿條件下用酒石酸亞鐵法lmg沒食子酸丙酯吸光度相當(dāng)于I.5mg茶多酚的吸光值。也就是說換算系數(shù)為1.5，這種測定法較科學(xué)，又易于掌握。2 儀器和用具實驗室常規(guī)儀器及感量0.0001g的分析天平、分光光度儀。3試劑和溶液1）酒石酸亞鐵溶液：準(zhǔn)確稱取0.5000g硫酸亞鐵（FeSO47H2O）和2.5000g酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa4H2O），用水溶解并定容至500ml。（溶液低溫、避光保存，有效期一個月）2） PH7.5的磷酸鹽緩沖液1/15M磷酸氫二鈉：稱取11.9380g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O），用水溶解并定容至500ml。1/15M磷酸二氫鉀：稱取4.5363g磷酸二氫鉀（KH2PO4），用水溶解并定容至500ml。取上述1/15M磷酸氫二鈉溶液85ml和1/15M磷酸二氫鉀溶液15ml混勻即可。3）沒食子酸丙酯溶液：準(zhǔn)確稱取0.0500g沒食子酸丙酯，用蒸餾水溶解移入50mL的容量瓶中稀釋至刻度，搖勻。此溶液為lmg/ml。4操作方法1） 試樣制備：稱取用三種不同的提取方法得到的茶多酚產(chǎn)品各0.1000g，用甲醇溶解并定容至100ml。溶液濃度為0.1%。稱取新買綠茶1g，用100沸水浴煮提兩遍，得到的提取液定容至100ml。2） 測定步驟標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的制作分別吸取0, 0.25, 0.50, 0.75,1.00,1.25mL的沒食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)液于一系列25mL的容量瓶中，加入4mL蒸餾水，再加入酒石酸亞鐵溶液5mL，用配制好的pH為7.5的磷酸緩沖溶液沖稀至刻度，搖勻。用分光光度計，在540nm處，用lcm比色皿，試劑空白作參比，測量吸光度，測得結(jié)果繪制校準(zhǔn)曲線，含量0-1250g/25mL符合比耳定律，回歸方程為y = 相關(guān)系數(shù)為 。樣品測定精確稱取50mg左右的樣品于小燒杯中，加蒸餾水溶解，并移入至50mL的容量瓶中，搖勻。吸取1mL樣品液于25mL的小容量瓶中，加入4mL蒸餾水，搖勻。準(zhǔn)確加入5.OmL的酒石酸亞鐵溶液，搖勻。用配制好的pH為7.5磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻。用分光光度計，在540nm處，用lcm比色皿，試劑空白作參比，測量吸光度，由回歸方程計算樣品含量。5結(jié)果計算計算方法和公式：2.1.4茶葉飲料中EGCG的反相高效液相色譜定量測定2.1.4.1實驗部分(1)儀器及試劑 儀器: 島津LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng)：包括LC-20A型高壓恒流泵、SPD-20A檢測器和LC Solution工作站；超聲清洗機(jī)；石英重蒸餾器。試劑：EGCG對照品( );甲醇(為色譜純、J&K Chemical Ltd);冰醋酸(AR級);乙酸乙酯(AR級);重蒸餾水;試劑配制后分別用0.45m HA和0.5m FH薄膜過濾.(2) RP-HPLC條件 色譜柱: Inertsil C18（4.6mm250mm，5m）；流動相:甲醇-水-冰醋酸(18：60：0.2,體積比; pH6.26.5)；使用前用0.5m FH薄膜過濾；脫氣1520 min；選280 nm為檢測波長；流速1.0 mL/min;室溫。(3)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 精密稱取在P2O5干燥器中干燥至恒重的EGCG對照品適量,用甲醇定容至一定體積使其成濃度為12mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。(4)樣液的制備及測定 取樣品(市售,北京科力福檸檬茶) 用甲醇定容至一定體積。2.1.4.2結(jié)果與討論(1) EGCG對照品甲醇溶液及樣品甲醇溶液的RP-HPLC譜圖如圖1。(2)方法線性關(guān)系 分別于0.50 mL甲醇中加入2、4、6、8、10L EGCG標(biāo)準(zhǔn)貯備液(12mg/mL)配成標(biāo)準(zhǔn)系列,每一濃度進(jìn)樣20L進(jìn)行色譜測定。EGCG在26.8129.0 ng,以HPLC色譜峰面積A與該峰代表的EGCG量X進(jìn)行線性回歸,所得回歸方程為:A= (r= )。(3)方法回收率及重現(xiàn)性 分別于6份50 mL相同出廠批次的樣品中精密加入EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液一定量,照樣品處理及樣液測定項下的方法用甲醇進(jìn)行色譜測定,所測得的峰面積代入隨行作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,求出測定值.該批樣品含EGCG經(jīng)三次測定的平均值為 ng/mL;每毫升萃取液中加入EGCG標(biāo)準(zhǔn)品的量為25.00 ng,測得相對回收率見表1. 同時連續(xù)6次精密進(jìn)樣5L EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液所測得峰面積的變異系數(shù)為2.12%,可見本色譜定量方法的重現(xiàn)性較好.(4)流動相中的冰醋酸作為離子抑制劑,可改善兒茶素化合物在HPLC譜圖中的峰形,但比例不宜過大,以防EGCG水解。2.2咖啡堿的定性、定量檢測2.2.1咖啡堿的薄層定性檢測硅膠薄板制作按1：3的比例稱取硅膠GF-254和0.5%的CMC-NA，研磨約30min后，平鋪到1020cm的洗凈烘干的玻璃平板上，鋪勻，隔夜，自然晾干。展開劑配制按甲苯：丙酮=6：4的比例配置（約需80ml）層析活化薄板：10530min。點樣：所用液體為留取的待測液，點樣量為25 uL。飽和：在層析缸內(nèi)扣放入一培養(yǎng)皿，再將薄板放在上面,板子不接觸層析液，在其蒸汽中飽和30min以上。層析：將板子放入展開劑中展開，待展開劑前沿距板子上端1.5cm取出，放入通風(fēng)廚晾干。結(jié)果觀察及分析:（紫外燈下觀察）2.2.2 HPLC法定量測定咖啡堿含量2.2.2.1實驗材料及儀器甲醇(分析純) 、雙蒸水、微量進(jìn)樣器、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、WATERS-2487高效液相色譜掃描儀、島津高效液相色譜掃描儀2.2.2.1實驗條件色譜柱：Symmetry C18(5m,4.6*150mm)流動相：甲醇:水=40：60流速：1ml/min檢測波長：274nm（根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB 8312-87 Tea- Determination of caffeine content 本標(biāo)準(zhǔn)適用于茶葉中咖啡堿的測定。在茶葉水浸出物中除去葉蛋白、茶多酚等物質(zhì)后,留下的生物堿其測定波長為274nm者,均稱茶葉咖啡堿。）進(jìn)樣量：10l溫度：室溫2.2.2.3實驗方法1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品0.050g（純度85%）,溶解定容于50ml有棕色容量瓶中,此液為0.85 mg/ml的咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。2 待測樣品的制備準(zhǔn)確稱取0.050g咖啡堿樣品于50ml 容量瓶中,加水40ml 左右,搖勻,放入100 的烘箱內(nèi)保溫加熱1h ,冷卻后用水定容至刻度得樣品待測液。3 樣品的測定在上述液相色譜條件下,待儀器基線穩(wěn)定后,按照標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測樣品溶液的順序進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。待測樣品中咖啡堿濃度按下列公式計算:A標(biāo)/A樣=C標(biāo)/C樣式中:A為標(biāo)準(zhǔn)品中或待測樣品中咖啡堿的峰面積值;C為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中咖啡堿的濃度（mg/ml）; 2.2.2.4實驗結(jié)果檢測圖譜如下：2.2.2.5分析討論2.3大孔樹脂吸附實驗2.3.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附實驗表1吸附樹脂的物理性能型號極性比表面積/(m2/g) 孔徑/nmLXX2.3.1.1樹脂的處理和再生： 將樹脂放入自來水中，溶脹后浮選，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸餾水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至中性待用。樹脂簡單再生可用含量為95%的乙醇洗至無色，用蒸餾水洗至無白色混濁，并且無醇味，即可使用。當(dāng)樹脂反復(fù)使用后，吸附能力下降或受污染時需強(qiáng)化再生，可用酸堿處理再生后使用。2.3.1.2茶葉上柱液制備1）稱取50g綠茶茶葉，粉碎至粉末狀，加入500ml 80自來水置80溫箱中提取1.5h。2）用4層紗布趁熱過濾，濾渣再加入400ml 80自來水置80溫箱中提取1.5h。3）用4層紗布趁熱過濾，濾渣再加入400ml 80自來水置80溫箱中提取1.5h。4）用4層紗布趁熱過濾，棄去濾渣，合并濾液，放置過夜，次日離心得上清液，總體積為 ml，留10ml用于檢測。測定茶多酚濃度為原料茶多酚含量2.3.1.3 樹脂飽和吸附量和脫附率的測定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的用濾紙吸干表面水分的樹脂1.00 g于100 ml三角瓶中，精密加入 mg/ml的茶葉上樣液20.0 ml，在25，120 r/min的條件下振蕩吸附18-24 h，過濾，樹脂用蒸餾水沖洗3遍，一并合入濾液中，用蒸餾水定容至50ml。測定吸附后溶液中茶多酚的量，并按下式計算樹脂的飽和吸附量。靜態(tài)飽和吸附量(mg/g)= 加入的茶多酚量-未吸附的茶多酚量將上述經(jīng)過18-24 h靜態(tài)吸附茶多酚的樹脂分離出來，吸干表面水分，然后用75%的乙醇25.0 ml，在25，120 r/min的條件下振蕩脫附2 h，過濾，樹脂用蒸餾水沖洗3遍，一并合入濾液中，用蒸餾水定容至50ml，測定脫附液中茶多酚的量，按下式計算脫附率。脫附率(%)=洗脫出的茶多酚量/(加入的茶多酚量-未吸附的茶多酚量)100%。不同樹脂對茶多酚的吸附量和脫附率實驗結(jié)果見表1 。表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能型號原液茶多酚量剩余液茶多酚量吸附茶多酚量/(mg/g)酒精洗脫茶多酚量脫附率/% LXX-175%/50mlOD 0.244191.004mg/20mlOD 0.591115.659mg/50ml75.345OD 0.43384.738mg90.21LXX-275%/50mlLXX-1215%/50ml原液茶多酚濃度：0.2441.957210=9.5502mg/ml；原料茶多酚含量：0.2441.9572103550ml1000100g100%=16.522%20ml原液茶多酚量：0.2441.95721020=191.004mg；剩余液茶多酚量：0.5911.957250ml=115.659mg洗脫茶多酚量：0.4331.957250ml=84.738mg附：咖啡堿樹脂飽和吸附量和脫附率的測定標(biāo)準(zhǔn)品11.00mg/25ml = 0.44 mg/ml C18柱 流動相 甲醇：水 = 40 ：60 流速 0.7ml/min 波長 274nm 進(jìn)樣 20l附表1 咖啡堿含量測定出峰時間峰面積平均峰面積濃度（mg/ml）液體量/原料量含量（%）標(biāo)準(zhǔn)品9.36740755830.39